Unidade Local de Saúde do Alto Minho, Viana do Castelo [Relatório de estágio]

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FARMÁCIA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO

Anabela Franco Enes

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FARMÁCIA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO

UNIDADE LOCAL DE SAÚDE DO ALTO MINHO

VIANA DO CASTELO

Relatório de estágio orientado pelo

Doutor Ricardo Luz

Anabela Franco Enes

MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS

Í

ÍNDICE DE FIGURAS ... iv

ÍNDICE DE TABELAS ... vi

ABREVIATURAS ... viii

PARTE I – Relatório de Estágio RESUMO/ABSTRACT ... 1 INTRODUÇÃO GERAL ... 2 1. PRÉ-ANALÍTICA ... 2 1.1.COLHEITA DE AMOSTRAS ... 3 1.2.CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO ... 5 2. HEMATOLOGIA ... 5 2.1.HEMOGRAMA... 6 2.1.1. Princípio de Funcionamento ... 7 2.1.2. Interpretação de Histograma ... 13 2.1.3. Gestão de Resultados ... 16

2.2.ESFREGAÇOS DE SANGUE PERIFÉRICO ... 17

2.2.1. Preparação de Esfregaço de Sangue ... 18

2.2.2. Princípio da Coloração de Lâminas ... 19

2.2.3. Situações que Requerem Confirmação ... 20

2.3.LÍQUIDOS BIOLÓGICOS ... 21

2.3.1. Líquido Cefalorraquidiano ... 21

2.3.2. Líquido Seminal ... 23

2.4.LÍQUIDOS BIOLÓGICOS PATOGÉNICOS ... 28

2.4.1. Líquido Ascítico, Líquido Pleural, Líquido Sinovial ... 28

2.5.VELOCIDADE DE SEDIMENTAÇÃO GLOBULAR ... 31

2.5.1. Analisador Automático ... 32

2.5.2. Método Clássico de Westergren ... 33

2.6.HEMOGLOBINA GLICADA ... 34 2.6.1. Princípio de Funcionamento ... 35 2.7.FRAGILIDADE OSMÓTICA... 35 2.7.1. Princípio do Método ... 36 2.8.GASIMETRIA ARTERIAL ... 36 2.8.1. Princípios de Funcionamento ... 37 2.8.2. Interesse Clínico ... 38 2.9.CONTROLO DE QUALIDADE ... 39

2.9.1. Controlo de Qualidade Interno ... 39

2.9.2. Controlo de Qualidade Externo ... 40

3. MICROBIOLOGIA ... 41

3.1.MEIOS DE CULTURA ... 42

3.2.EXAME BACTERIOLÓGICO ... 44

3.2.1. Exame Direto ... 44

ii

3.2.3. Identificação dos Organismos ... 65

3.2.4. Teste de Sensibilidade a Antibióticos ... 71

3.3.EXAME MICOLÓGICO ... 72

3.3.1. Exame Direto ... 73

3.3.2. Exame Cultural ... 73

3.3.3. Identificação dos Organismos ... 74

3.4.EXAME PARASITOLÓGICO E VIROLÓGICO ... 76

3.4.1. Parasitológico ... 76

3.4.2. Virológico ... 80

3.5.EXAME MICOBACTERIOLÓGICO ... 83

3.5.1. Descontaminação das Amostras ... 83

3.5.2. Exame Direto ... 84

3.5.3. Exame Cultural ... 86

3.5.4. Identificação e Antibiograma de Micobactérias ... 87

3.6.CONTROLO DE QUALIDADE ... 87

4. IMUNOQUÍMICA ... 88

4.1.COLHEITA DE AMOSTRAS ... 89

4.2.TRIAGEM DE AMOSTRAS ... 89

4.3.QUÍMICA CLÍNICA ... 90

4.3.1. Métodos Utilizados e Princípio de Funcionamento ... 91

4.3.2. Processamento de Amostras ... 93

4.3.3. Interesse Clínico ... 95

4.4.ENDOCRINOLOGIA E SEROLOGIA INFECIOSA ... 100

4.4.1. Métodos Utilizados e Princípio de Funcionamento ... 101

4.4.2. Interesse Clínico ... 101

4.5.IMUNOALERGOLOGIA ... 104

4.5.1. Métodos Utilizados e Princípio de Funcionamento ... 104

4.5.2. Interesse Clínico ... 106

4.6.ELETROFORESE ... 106

4.6.1. Métodos Utilizados e Princípio de Funcionamento ... 107

4.6.2. Proteínas Séricas ... 107

4.7.IMUNOLOGIA ... 110

4.7.1. Métodos Utilizados e Princípio de funcionamento ... 111

4.7.2. Interesse Clínico ... 113

4.8.URIANÁLISES ... 118

4.8.1. Urina Tipo II e Sedimento Urinário ... 118

4.8.2. Urina 24h ... 127

4.8.3. Outras Pesquisas Urinárias ... 128

4.8.4. Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes ... 129

4.9.SEROLOGIA MANUAL ... 129

4.9.1. Sífilis ... 129

4.9.2. Sorodiagnóstico Febril ... 132

4.9.3. Reação de Waaler-Rose ... 132

4.9.4. Reação de Paul-Bunnel ... 133

4.10.CALIBRAÇÕES E CONTROLOS DE QUALIDADE ... 134

4.10.1. Calibração ... 134

4.10.2. Controlo de Qualidade Interno ... 134

4.10.3. Controlo de Qualidade Externo ... 135

5. CONCLUSÃO ... 136

iii Parte II - Tiroide na Grávida e na Criança

RESUMO/ABSTRACT ... 141 INTRODUÇÃO ... 143 AGLÂNDULA DA TIROIDE ... 143 HORMONAS E SUA BIOSSÍNTESE ... 144 Vias Metabólicas ... 146 TRANSPORTE HORMONAL ... 148 REGULAÇÃO HORMONAL ... 148

EFEITOS DAS HORMONAS ... 150

DISFUNÇÃO DA TIROIDE ... 151

Tirotoxicose e Hipertiroidismo ... 152

Hipotiroidismo ... 153

Inflamação da Tiroide... 154

Doença Autoimune da Tiroide ... 156

Disponibilidade de Iodo ... 158

TIROIDE NA GRÁVIDA ... 159

PRINCIPAIS ALTERAÇÕES DURANTE A GRAVIDEZ ... 160

DISFUNÇÕES NA GRÁVIDA ... 164

Hipertiroidismo na Grávida ... 164

Hipotiroidismo na Grávida ... 167

Disponibilidade de Iodo na Grávida ... 169

TIROIDE NO FETO ... 172

IMPORTÂNCIA DAS HORMONAS DA TIROIDE NO FETO ... 172

DESENVOLVIMENTO DA TIROIDE NO FETO ... 173

EFEITO DA DISFUNÇÃO MATERNA NO FETO ... 176

Hipertiroidismo Fetal ... 177

Hipotiroidismo Fetal ... 177

Efeito da Disponibilidade de iodo no Feto ... 178

CONSEQUÊNCIAS DA DISFUNÇÃO DA TIROIDE NO RECÉM-NASCIDO ... 179

Hipertiroidismo e Tirotoxicose no Recém-Nascido ... 179

Hipotiroidismo no Recém-Nascido ... 180

Disponibilidade de Iodo no Recém-Nascido ... 181

DIAGNÓSTICO E TERAPÊUTICA ... 183 HIPERTIROIDISMO ... 183 HIPOTIROIDISMO ... 185 DISPONIBILIDADE DE IODO ... 187 CONCLUSÃO ... 190 BIBLIOGRAFIA ... 192 ANEXOS ... 198

iv

Í

F

Figura 1 - Analisador automático de hemogramas Sysmex XE-2100. ... 7

Figura 2 - Composição de fosfolípidos nos granulócitos imaturos e maturos. ... 8

Figura 3 - Mecanismo de ação do canal 5Diff. ... 11

Figura 4 - Mecanismo de ação no canal WBC/BASO. ... 11

Figura 5 - Mecanismo de ação no canal NRBC... 12

Figura 6 - Mecanismo de ação do canal RET. ... 13

Figura 7 - Exemplo de um resultado de hemograma de uma amostra normal: (1) Dados de análise; (2) Diagrama de dispersão 5Diff; (3) Diagrama de dispersão WBC/BASO; (4) Diagrama de dispersão IMI; (5) Diagrama de dispersão NRBC; (6) Diagrama de dispersão RET; (7) Diagrama de dispersão PLT-O; (8) Histograma de RBC; (9) Histograma de PLT; (10) Mensagem do sistema de WBC; (11) Mensagem do sistema de RBC/RET e (12) Mensagem do sistema de PLT. ... 14

Figura 8 - Esfregaço de sangue periférico com o auxílio de um aplicador de gota de sangue com espalhador, Haemo-Diff da SARSTEDT. 1. Colocar aplicador no tubo; 2. Tudo é invertido para dispensar uma gota de sangue na lâmina; 3. Usar o espalhador para fazer o esfregaço.(2) ... 18

Figura 9 - (A) Esfregaço bem preparado; (B) e (C) Esfregaços mal preparados.(2) ... 19

Figura 10 - Câmara de Neubauer. ... 21

Figura 11 - Representação da câmara de contagem de Neubauer com os nove quadrantes de contagem. Para uma amostra de LCR, a contagem de células é feita nos quadrantes 1, 3, 7 e 9. (5) ... 22

Figura 12 - A) Citocentrífuga Shandon Cytospin 2. B) Procedimento da montagem da amostra para a citocentrífuga.(5) ... 23

Figura 13 - A – Estrutura normal de um espermatozoide.(6) B – Espermatozoides corados com coloração de papanicolau.(7) ... 27

Figura 14 - Possíveis alterações morfológicas dos espermatozoides.(7) ... 28

Figura 15 - Aparelho automático de velocidade de sedimentação globular VES-MATIC 20. ... 32

Figura 16 - Suporte graduado vertical Microvette®, capilar e tubo Microvette® 100/200 de citrato de sódio para o método de Westergren da SARSTEDT. ... 33

Figura 17 - Analisador automático de hemoglobina glicada ARKRAY ADAMS A1c HA-8160. ... 34

Figura 18 - Aparelho automático de gasimetrias GEM Premier (3500 e 4000). ... 37

Figura 19 - Esquema de como estriar as placas de modo a obter colónias isoladas e unidades formadoras de colónias (UFC) contáveis. ... 48

Figura 20 - Esquema do sentido de migração da amostra numa tira de membrana imunocromatográfica com partículas de ouro coloidal e anticorpos monoclonais/policlonais específicos para Adenovírus (1) e Rotavírus (2). ... 81

Figura 21 - Sistema integrado Architect Ci8200 da Abbott Diagnostics. ... 90

Figura 22 Esquema explicativo do princípio de deteção do método de CMIA para determinar a presença de antigénios, anticorpos e analitos em amostras. ... 92

Figura 23 - Evolução dos anticorpos Ig M e Ig G, ao longo do tempo, de uma primo-infeção e reinfeção do vírus da rubéola. ... 103

Figura 24 – Esquema de imunoensaio em sandwich realizado no ImmunoCAPTM 250 para a quantificação de Ig E total. ... 105

Figura 25 – Esquema de imunoensaio em sandwich realizado no ImmunoCAPTM 250 para a quantificação de Ig E específica. ... 105

Figura 26 - Aparelho automático para eletroforese capilar, MINICAP da Sebia. ... 107

Figura 27 - Electroforegrama normal de proteínas do soro humano usando MINICAP da Sebia. ... 108

Figura 28 - Esquema do princípio do método de imunofluorescência indireta. ... 112

Figura 29 - Analisador de bancada para a análise totalmente automática de urinas tipo II, URISYS 2400 da Roche Diagnostics. ... 119

Figura 30 - Analisador de partículas da urina automatizado UF-1000i da Sysmex Corporation. ... 124

v

Figura 32 A e B - Diferentes ampliações dos folículos da tiroide. C - Célula folicular: a) superfície apical da célula; b) membrana basal; c) célula capilar; d) gotas coloidais; e) retículo endoplasmático; g) complexo de Golgi; m) mitocôndria; n) núcleo; o) célula endotelial com poro aberto; p) membrana plasmática; r) ribossomas no retículo endoplasmático; v) microvilosidade.(5) ... 144 Figura 33 - Estrutura das hormonas da tiroide e seus percursores. MIT, monoiodotirosina; DIT,

diiodotironina; rT3, 3,3’,5’-L-triiodotironina; T3, 3,5,3’-L-triiodotironina; T4, 3,5,3’,5’-L-tetraiodotironina (4) ... 145 Figura 34 - Síntese das hormonas da tiroide nas células foliculares O iodo circulante é capturado pela

glândula da tiroide que se concentra nas células foliculares e é transportado pata o coloide. A TPO catalisa a iodação dos resíduos de tirosina no esqueleto da Tg, para formar MIT e DIT. Quando as células foliculares são estimuladas, gotículas de coloide são envolvidas por endocitose que, por sua vez, funde com lisossomas onde são quebradas as ligações peptídicas entre os resíduos iodados e Tg, de modo a libertar T3 e T4.(8) ... 146 Figura 35 - Reações básicas de desiodinases.A D1 catalisa tanto a desiodação do anel externo (ORD)

como do anel interno (IRD) dos vários derivados de iodotironinas; D2 tem apenas atividade ORD, com afinidade ligeiramente superior para a T4 em relação a rT3; D3 tem apenas atividade IRD e catalisa a inativação da T3 de uma forma mais eficiente que a T4.(10) ... 147 Figura 36 - Regulação das hormonas da tiroide no eixo hipotálamo-hipófise-tiroide e mecanismos de

feedback envolvidos (12) A principal regulação da atividade das hormonas da tiroide é efetuada através da secreção da TSH pela hipófise que, por sua vez, é regulada pela TRH, libertada pelo hipotálamo. Um aumento de TRH vai estimular a libertação da TSH.(1, 2) A TSH liga-se ao recetor específico TSHr, na membrana da tiroide, ativando o AMPc que, por sua vez, tem um efeito direto na produção de T3 e T4. Os níveis de T4 e T3 em circulação têm um efeito de feedback negativo inibindo diretamente a secreção de TSH, ou indiretamente através da regulação da biossíntese de TRH no hipotálamo.(2, 14) ... 149 Figura 37 - Relação inversa entre TSH no soro (expresso em log10) e fT4 em eutiroides, hipotiroide

(primária), hipertiroide, e indivíduos eutiroides T4 suprimidos. Com a diminuição de T4, há um aumento dos níveis de TSH como resposta compensatória pela glândula pituitária. Por outro lado, com o aumento de T4 a glândula responde com a diminuição de TSH.(12) ... 150 Figura 38 - Alterações dos níveis das hormonas da tiroide durante a gravidez. O aumento acentuado de

hCG estabelece uma reação cruzada com TSHr, levando a um ligeiro aumento de fT4 e uma diminuição de TSH na primeira metade de gestação. O aumento acentuado de estrogénio estimula a produção de TBG e consequentemente o aumento de T4 total (TT4). Tg e o volume da tiroide (TV) mantêm-se praticamente inalterados ao longo da gestação.(12) ... 161 Figura 39 - Variação dos níveis de hCG e TSH durante a gestação. No primeiro trimestre, há um aumento

significativo na produção de hCG pela placenta, atingindo o seu pico máximo entre as 9 e 11 semanas de gestação. A concentração de hCG começa a diminuir gradualmente até atingir o ponto mais baixo às 20 semanas, teor que se mantém até ao final da gravidez. Ao longo da gravidez, a TSH tem uma evolução inversa. TSH diminui até às 10 semanas, a partir da qual começa a aumentar.(43) ... 162 Figura 40 - Metabolismo do iodo na grávida. A necessidade aumentada no abastecimento de iodo, para

responder às necessidades de produção das hormonas da tiroide, deve-se ao aumento na produção das hormonas, na depuração renal de iodo elevada e à transferência transplacentária de hormonas e iodo. (9)... 163 Figura 41 - Algoritmo usado na avaliação de hipertiroidismo durante a gravidez.(10) ... 165 Figura 42 - Algoritmo usado na avaliação de hipotiroidismo durante a gravidez.(10) ... 168 Figura 43 - Transferência das hormonas maternas com um papel fundamental no desenvolvimento

neurológico do feto.(10) A placenta é permeável à passagem da iodotironina T4 mas é impermeável a TSH e T3.(35) Uma vez atravessada a barreira transplacentária, as hormonas da tiroide são transportadas pela TBPA para o cérebro do feto.(10) ... 172 Figura 44 - Os gráficos A – F correspondem aos diferentes parâmetros da tiroide desde as 12 semanas

após conceção até ao nascimento. Estes resultados foram obtidos in vivo por cordocentese, sem interferir com a ligação normal entre a mãe e o feto. As áreas sombreadas nos gráficos A e B

vi

mostram que T4 e fT4 fetal atingem concentrações maternas após o segundo trimestre, enquanto T3 e, especialmente, fT3 permanecem baixas durante toda a gravidez. O gráfico E chama especial atenção para os níveis muito elevados de TSH fetal que, na sua maioria, estão sempre superiores

aos níveis maternos.(56) ... 175

Í

T

Tabela 2 - Equipamentos disponíveis na secção de Hematologia. ... 5

Tabela 3 - Métodos de deteção usados nos aparelhos Sysmex XE-2100 e XE-5000 para diferenciar e contabilizar as diferentes populações. ... 8

Tabela 4 - Canais de diferenciação por citometria de fluxo por laser semicondutor. ... 10

Tabela 5 - Alguns exemplos de flags dado pelo aparelho Sysmex e alarmes no SIS. ... 16

Tabela 6 - Alguns cenários que exigem confirmação por esfregaço de sangue. ... 20

Tabela 7 - Caraterísticas macroscópicas avaliadas no exame macroscópico do líquido seminal.(6, 7)... 24

Tabela 8 - Caraterísticas microscópicas avaliadas no líquido seminal. ... 25

Tabela 9 - Possíveis células observadas no citoesfregaço do líquido pleural, associado a parâmetros bioquímicos, e respetivas considerações clínicas.(8) ... 30

Tabela 10 - Possíveis células observadas no citoesfregaço do líquido ascítico, associado a parâmetros bioquímicos, e respetivas considerações clínicas.(8) ... 30

Tabela 11 - Possíveis células observadas no citoesfregaço do líquido sinovial, associado a parâmetros bioquímicos, e respetivas considerações clínicas.(9) ... 31

Tabela 12 - Valores de referência de velocidades de sedimentação.(10) ... 32

Tabela 13 - Alguns parâmetros metabólicos de interesse da gasimetria. ... 38

Tabela 14 - Situações clínicas associadas às trocas gasosas e parâmetros metabólicos. ... 38

Tabela 15 - Possíveis causas associadas à rejeição de controlo... 39

Tabela 16 - Controlo de qualidade interno dos aparelhos usados na Hematologia. ... 40

Tabela 17 - Equipamentos disponíveis na secção de Microbiologia. ... 41

Tabela 18 - Critério de classificação das contagens de colónias nas placas de amostras de urina. ... 48

Tabela 19 - Meios a semear após positividade nos diferentes frascos de hemocultura. ... 57

Tabela 20 - Principais infeções oculares e auriculares e respetivos agentes etiológicos responsáveis. (27) . 64 Tabela 21 - Alguns dos possíveis organismos fúngicos que podem causar infeção no Homem e as suas formas clínicas encontradas nos diferentes tipos de amostra. (28) ... 72

Tabela 22 - Locais de infeção onde possíveis parasitas podem ser encontrados, desde trofozoítos, cistos, oócitos, esporos, formas adultas, larvas ou ovos, amastigotas e tripomastigotas. (29) ... 77

Tabela 23 - Equipamentos disponíveis na secção de Imunoquímica. ... 88

Tabela 24 - Parâmetros e respetivas metodologias processados nos aparelhos de química clínica Architect Ci8200 #1 e #2 da Abbott Diagnostics. ... 93

Tabela 25 - Considerações clínicas de alguns parâmetros de bioquímica geral. ... 95

Tabela 26 - Considerações clínicas de algumas enzimas... 96

Tabela 27 - Considerações clínicas de alguns eletrólitos e iões. ... 97

Tabela 28 - Alguns parâmetros do metabolismo do ferro, estudo de anemias não-ferropénicas e ósseo, assim como respetivas considerações clínicas. ... 98

Tabela 29 - Marcadores cardíacos e respetivas considerações clínicas. ... 98

Tabela 30 - Marcadores tumorais e respetivos cancros onde os marcadores podem estar presentes. ... 99

vii

Tabela 32 - Parâmetros da função tiroideia, fertilidade e gravidez, DPN e serologia infeciosa analisados por CMIA no Architect i2000 e Ci8200 da Abbott Diagnostics, e por EQL no COBAS e411 da

Roche Diagnostics. ... 100

Tabela 33 - Possíveis doenças da função tiroideia diagnosticada com o auxílio dos parâmetros da função tiroideia. ... 101

Tabela 34 - Diferentes sintomas com causas alérgicas e possíveis Ig E específicos. ... 106

Tabela 35 - Zonas proteicas individuais e respetivas concentrações relativas (percentagem), detetadas por eletroforese capilar a 200 nm, no aparelho Minicap Sebia. ... 108

Tabela 36 Diferentes frações separadas por eletroforese capilar das proteínas do soro e respetivas considerações clínicas.(32) ... 109

Tabela 37 - Listagem de autoanticorpos quantificados por ELISA e autoanticorpos pesquisados e titulados por IFI em lâmina. ... 111

Tabela 38 - Padrões de reconhecimento dos anticorpos antinucleares (ANA) em células HEp-2. Estes padrões podem incluir padrões homogéneos, periféricos, pontilhado e nucleolares. ... 114

Tabela 39 - Alguns dos autoanticorpos detetados e titulados por IFI a partir das lâminas com secções criostáticas de tecidos de rim, fígado e estômago de rato. ... 116

Tabela 40 - Possíveis resultados das caraterísticas macroscópicas da urina tipo II, obtidos pelo aparelho URISYS 2400, e respetivas considerações clínicas. ... 121

Tabela 41 - Considerações clínicas e caraterísticas macroscópicas da urina tipo II, obtidos pelo aparelho URISYS 2400, e respetivas considerações clínicas.(33) ... 122

Tabela 42 - Possíveis elementos figurados na urina observados no sedimento urinário e respetivas considerações clínicas.(34) ... 125

Tabela 43 - Testes por aglutinação direta para a pesquisa de antigénios febris segundo o kit Serodiagnóstico Febril da BioSystems S.A.. ... 132

Tabela 44 - Calibração e Controlo de Qualidade Interno dos aparelhos usados na Imunoquímica. ... 134

Tabela 45 - Diagnóstico diferencial de tirotoxicose derivado da hiperfunção da tiroide e excesso de hormonas livre da tiroide em circulação não derivado da hiperfunção da glândula.(19) ... 152

Tabela 46 - Diagnóstico diferencial de hipotiroidismo primário e hipotiroidismo secundário.(19) ... 153

Tabela 47 - Intervalos de referência da função da tiroide recomendados para grávidas.(34, 38) ... 160

Tabela 48 - Principais alterações encontradas na função da tiroide ao longo da gravidez.(10) ... 160

Tabela 49 - Riscos de doença na população associado à disponibilidade de iodo fora do intervalo recomendado.(17) ... 171

Tabela 50 - Limites para suficiência de iodo numa população baseado na média da concentração de iodo urinário.(69) ... 188

viii

A

ABBA Anticorpos anti-banda em escova AMA Anticorpos anti-mitocôndrias AMP Anfetaminas

ANA Anticorpos anti-nucleares

ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutrófilos APCA Anticorpos anti-parietais

ARA Anticorpos anti-reticulina ASMA Anticorpos anti-músculo liso ATPase Adenosina Trifosfatase - B -

BAR Barbitúricos

BAAR Bacilos álcool-ácido resistentes BASO Basófilo

BD Becton-Dickinson

BHI Caldo de enriquecimento (Brain and Heart Infusion) BNP Péptido natriurético cerebral (Brain Natriuretic Peptide) bpm Batimentos por minuto

BZO Benzodiazepinas - C - Ca2+ Cálcio Ionizado CA 15.3 Antigénio hidrocarbonado 15.3 CA 19.9 Antigénio hidrocarbonado 19.9 CA 125 Antigénio hidrocarbonado 125 cAMP Adenosina monofosfato cíclica

cANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutrófilos com padrão citoplasmático CBC Contagem de Sangue Completo (Cell Blood Count)

CEA Antigénio carcinoembrionário CIN Gelose Yersinia

Cl- Ião cloreto

CLED Cystine Lactose Electrolyte Deficient

CLSI Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (Clinical and Laboratory Standards

Institute)

CMI Concentração mínima inibitória

CMIA Imunoensaio de micropartículas por quimioluminescência (Chemiluminescent

Microparticles Immunoassay)

CMZ Carbimazol CO2 Dióxido de Carbono

COC Cocaína

COHb Carboxi-hemoglobina COS Gelose de sangue

CQE Controlo de Qualidade Externo CQI Controlo de Qualidade Interno

ix

- D -

D1 Iodotironina desiodase tipo I D2 Iodotironina desiodase tipo II D3 Iodotironina desiodase tipo III DC Corrente Contínua (Direct Current) DI Deficiência em Iodo

DIT Diiodotirosina

DNA Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid) DPN Diagnóstico Pré-Natal

- E -

EBV Vírus de Epstein-Barr (Epstein-Barr Virus) EDTA K3 Ácido etilenodiamino tetra-acético tripotássico

ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) EO Eosinófilo

EQL Eletroquimioluminescência

EUCAST Comité Europeu de Avaliação de Susceptibilidade Antimicrobiana (European

Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)

- F -

FSH Hormona Foliculoestimulante fT3 Triiodotironina livre

fT4 Tiroxina livre - G -

GALT Galactose-1-fosfato uridil-transferase GGT Gama-glutamil transferase GVPC Gelose Legionella - H - H2O Água H2O2 Peróxido de hidrogénio H2S Sulfeto de hidrogénio Hb Hemoglobina Hb A1c Hemoglobina Glicada HBG Hemoglobina

hCG Gonadotrofina Coriónica Humana (Human Chorionic Gonadotropin) HCO3- Ião Bicarbonato

HCT Hematócrito

HDF Focagem Hidrodinâmica (Hydrodynamic Focusing) HDL Lipoproteínas de alta densidade (High Density Lipoprotein) Hekt Gelose Hektoen

HFR Taxa de Alta Fluorescência (High Fluorescence Ratio) HG Hiperémese Gravídica (Hyperemesis gravidarum) HHb Deoxi-hemoglobina ou Hemoglobina Reduzida

HIV Vírus da imunodeficiência humana (Human Immunodeficiency Virus) HPC Células Progenitoras Hematopoiéticas

HPLC Cromatografia Líquida de alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography)

HSV Vírus Herpes Simplex

x

- I -

I Intermédio

ICCIDD International Council for the Control of Iodine Deficiency Disorders

ICT Tecnologia de chip integrado (Integrated Chip Technology) IFI Imunofluorescência Indireta

Ig Imunoglobulina

IMC Índice de Massa Corporal

IRD Desiodação do anel interno (Inner ring deiodination)

IRF Fração de Reticulócitos Imaturos (Immature Reticulocyte Fraction) iQM Gestão Inteligente da Qualidade (Intelligent Quality Management) IMI Canal das Células Progenitoras Hematopoiéticas

IG Granulócito Imaturo (Immature Granulocyte) ITU Infeção do Trato Urinário

- K -

K+ Ião potássio KDa KiloDalton - L -

LB Lavado brônquico LBA Lavado broncoalveolar

LCR Líquido cefalorraquidiano ou Liquor LED Díodo emissor de luz (Light Emitting Diode) LES Lúpus Eritematoso Sistémico

LH Hormona Luteinizante

LFR Taxa de Fluorescência Baixa (Low Fluorescence Ratio) LJ-T Meio de Lowenstein-Jensen

LYMPH Linfócitos - M -

MCH Hemoglobina Globular Média (Mean Corpuscular Hemoglobin)

MCHC Concentração de Hemoglobina Média (Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration)

MCK Gelose MacConkey

MCV Volume Globular Médio (Mean Corpuscular Volume) MDMA Metilenodioximetanfetamina

MET Metanfetaminas MetHb Metemoglobina

MFR Taxa de Fluorescência Média (Middle Fluorescence Ratio)

MGIT Tubos indicadores de crescimento de micobactérias (Mycobacteria Growth Indicator

Tube)

MH2 Gelose Mueller Hinton 2 MIT Monoiodotirosina MMZ Metimazol MONO Monócito

MPV Volume Plaquetário Médio (Mean Platelet Volume)

MTD Metadona

- N -

Na+ Ião sódio NaCl Cloreto de Sódio

xi

NaOH Hidróxido de sódio nDNA DNA nativo NEUT Neutrófilos

NH3 Amónia

NRBC Eritroblastos - O -

O2Hb Oxi-hemoglobina

OMS Organização Mundial de Saúde

OPI Opiáceos

ORD Desiodação do anel externo (Outter ring deiodination) OTV Antibióticos oxicilina, teicoplanina e vancomicina - P -

pANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutrófilos com padrão perinuclear

PAPP-A Proteína plasmática A associada à gravidez (Pregnancy-associated plasma protein A) pCO2 Pressão parcial de dióxido de carbono

PCT Plaquetócrito (Plateletcrit)

PDW Coeficiente de Dispersão Plaquetária (Platelet Distribution Width) PLT Plaquetas

PLT-O Contagem Ótica de Plaquetas pO2 Pressão parcial de oxigénio

PTH Hormona Paratiroide

PVX Gelose de chocolate e PolyViteX - R -

R Resistente

RBC Eritrócitos (Red Blood Cells)

RDW Coeficiente de Dispersão Eritrocitária (Red Cell Distribution Width) RET Reticulócitos

RF Corrente Radio-frequência (Radio-frequency)

RIQAS Esquema de Avaliação de Qualidade Internacional da Randox (Randox International

Quality Assessment Scheme)

RNA Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid) rpm Rotações por minuto

RSV Vírus Sincicial Respiratório (Respiratory Syncytial Virus) rT3 Triiodotironina Reversa (3,3’,5’-L-triiodotironina) - S -

S Sensível

SB Secreções Brônquicas

SCS Gelose Schaedler + 5% de Sangue de Carneiro SGC Gelose Sabouraud Gentamicina Cloranfenicol SIS Programa de Validação Automática de Resultados SLS Surfatante Laurilsulfato de Sódio

SMAC Gelose SMAC (MacConkey com sorbitol) SNC Sistema Nervoso Central

- T -

T2 Diiodotironina (3,3’-diiodotironina) T3 Triiodotironina (3,5,3’-L-triiodotironina)

xii

T4 Tiroxina (3,5,3’,5’-L-tetraiodotironina) TACSP Técnica de Análises Clínicas e Saúde Pública

TBG Globulina de ligação à Tiroxina (Thyroxine-Binding Globulin)

TBPA Transtiretina ou Pré-albumina de ligação à Tiroide (Thyroid-Binding Prealbumin) TCA Antidepressivos tricíclicos

TCBS Meio TCBS (Tiossulfato, citrato, bílis e sacarose) TFG Taxa de filtração glomerular

Tg Tiroglobulina TgAb Autoanticorpo de Tg tHb Hemoglobina Total THC Tetrahidrocanabinol TPO Tiroperoxidase TPOAb Autoanticorpo de TPO

TRE Elemento Sensível da Tiroide (Thyroid Responsive Elements) TRH Hormona de libertação de Tirotropina (Tiroliberina)

TSH Hormona Tiroestimulante (Tirotropina) TSHr Recetor da Hormona Tiroestimulante TSHrAb Autoanticorpos de TSHr

TSS Técnica Superior de Saúde

TT4 T4 Total

- U -

UFC Unidades Formadoras de colónias ULSAM Unidade Local de Saúde do Alto Minho

UK NEQAS Serviço Nacional de Avaliação de Qualidade Externa do Reino Unido (United

Kingdom National External Quality Assessment Service)

UNICEF United Nations Children’s Fund - V -

VCA3 Gelose Chocolate e PolyViteX VCAT3 VS Velocidade de Sedimentação

- W -

WBC Leucócitos (White Blood Cells) WHO World Health Organization

- Z -

1

R

O estágio profissional em Análises Clínicas, como parte integrante do plano de estudos do curso de Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, teve lugar no Serviço de Patologia Clínica integrado na Unidade Local de Saúde do Alto Minho - ULSAM, em Viana do Castelo. Consistiu num período de trabalho nas áreas de Hematologia, Microbiologia e Imunoquímica.

O presente relatório tem como objetivo, transmitir a experiência adquirida, ao longo de mais de sete meses (aproximadamente 1080 horas), na execução das técnicas laboratoriais associada a todo o conhecimento teórico para permitir a interpretação dos resultados. Estão descritos todas as metodologias e fundamentos do laboratório nas diferentes áreas.

A

The internship in Clinical Laboratory, integrated in the studies plan of the Master course in Clinical Laboratory from the Faculty of Pharmacy of the University of Lisbon, took place in the Clinical Pathology Service integrated in the Alto Minho’s Local Health Unit - ULSAM, in Viana do Castelo. It consisted in a working period in the Hematology, Microbiology and Immunochemistry sections.

This report intends to transmit the acquired experience, throughout more than seven months (approximately 1080 hours), on carrying out the laboratory techniques associated with all the theoretical knowledge to allow the interpretation of results. All the methodologies are described as well as the laboratory grounds in the different sections.

2

I

G

O Serviço de Patologia Clínica do ULSAM é constituído por quatro secções: Hematologia, Microbiologia, Imunoquímica e Imuno-Hemoterapia, que tem como diretor de serviço o Doutor José António Mota Freitas. Aquando do estágio, a secção de Hematologia estava sob a orientação da Doutora Maria José Gaião, a secção de Microbiologia da Doutora Adelina Santos, a secção de Imunoquímica da Doutora Cristina Maldonado e a secção de Imuno-Hemoterapia da Doutora Graça Soberal. Além das secções descritas, o serviço conta com a colaboração do pessoal administrativo, sala de colheitas, receção, gabinete do Diretor Técnico, biblioteca e armazém.

A principal função do Serviço de Patologia clínica consiste em dar resposta aos pedidos solicitados pelos clínicos, executando ensaios laboratoriais de forma fiável e atempada, assim como esclarecer os clínicos a nível do painel analítico, princípios de metodologia de diagnóstico e colaboração na interpretação dos resultados analíticos.

No ULSAM está integrado o Hospital de Dia, de modo que amostras vindas deste serviço têm prioridade para assegurar que os doentes se encontram nas condições ideais antes de iniciar os tratamentos. Além do hospital de dia, outros serviços poderão apresentar urgência nas amostras vindas dos cuidados intensivos e intermédios e unidade polivalente.

1. P

-A

A fase pré-analítica compreende a preparação do doente, a anamnese, a colheita, o registo, a triagem e armazenamento das amostras, ou seja, todo o processo que antecede o processamento das amostras. Regra geral, é na fase pré-analítica que ocorre um maior número de erros daí que é necessário tomar as devidas precauções para os evitar. No laboratório cada fase é importante visto que os erros poderão levar a alterações dos resultados e, consequentemente, a sua interpretação será errada.

3

1.1.COLHEITA DE AMOSTRAS

O processo de colheita de amostras é um dos passos mais importantes a executar (Tabela 1). Qualquer erro neste processo vai originar resultados não reais podendo levar a falsos diagnósticos. No caso particular de colheita de uma amostra para exame microbiológico deve se ter os devidos cuidados de assepsia, de forma a reduzir possíveis contaminações e ser representativa do local em estudo; e deve ser transportada em tempo adequado ao laboratório em meio e recipiente estéril.

Tabela 1 Procedimentos de colheitas para os diferentes tipos de amostras.

Amostras Procedimento de Colheita

Sangue

 A colheita é feita por punção venosa pela técnica de colheitas. Deve garrotar o braço acima da zona da punção e selecionar uma veia palpável. Desinfeta-se o local da punção com álcool a 70% e introduz-se a agulha num ângulo de 15 a 45º. Assim que o tubo começar a fluir para o tubo, o doente deve abrir a mão. Assim que possível retirar o garrote (o braço não deve permanecer garrotado mais de 1 minuto). Após colher a quantidade necessária, retirar a agulha e fazer pressão sobre a punção com uma compressa.

Urina

 Jacto médio: Imediatamente após a higiene com água e sabão não desinfetante, rejeitar o primeiro jacto para remover a maioria dos contaminantes da uretra; colhe-se o segundo jacto sem interrupções da micção para um recipiente estéril;

 Saco coletor: É ideal para crianças. Após lavagem cuidada adapta-se o coletor aos genitais. Deverão ser substituídos a cada 30 minutos, procedendo sempre a nova lavagem;

 Algaliação: A colheita é feita através de cateterização uretral. Colhe-se diretamente do tubo da algália e nunca do saco coletor. Deve-se clampear o cateter, nunca por mais de 30 minutos, desinfetar o local da amostragem para punção com álcool a 70% e colher a urina. Transfere-se a urina para um recipiente estéril;

 Punção suprapúbica: Para colheitas difíceis procede-se à punção externa do abdómen para a bexiga, após desinfeção com álcool. Para exame bacteriológico, fornece uma amostra completamente livre de contaminações. Esta é a única amostra própria para cultura de anaeróbios.

Fezes

 Sempre que possível colher três amostras em dias consecutivos, do tamanho de uma noz, para uma embalagem esterilizada ou em zaragatoa rectal.

 Transporte: enviar para o laboratório dentro de uma hora para ser processado.

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Tabela 1 (Continuação)

Amostras Procedimento de Colheita

Vias Respiratórias

 Secreções brônquicas: são feitas em frascos esterilizados, podendo ou não ser induzida com soro fisiológico mas o importante é não conter saliva.

 Transporte: enviados para o laboratório no máximo até uma hora. Se o envio para o laboratório for superior a uma hora, devem ser refrigeradas a 4º a 8º C, no máximo durante 24h.

Hemoculturas

 Amostras colhidas por punção venosa após desinfeção da zona a picar com álcool e de seguida, com solução iodada. Antes de injetar o sangue nos frascos, desinfeta-se a boca do frasco com álcool (ANEXO 1);  Nos adultos são colhidos três frascos, um frasco para anaeróbios e dois

frascos para aeróbios, aproximadamente 8 mL cada. Nas crianças é colhido apenas um frasco para aeróbios, aproximadamente 3 mL.

LCR

 Colheita por punção lombar entre a terceira, quarta ou quinta vertebra lombar, ou por punção suboccipital. Este procedimento é feito pelo clínico ou outro profissional competente. São colhidos três tubos estéreis, o primeiro para a bioquímica, o segundo para hematologia e o terceiro para a microbiologia (amostra menos contaminada).

 Transporte: Devem ser enviados imediatamente para o laboratório para serem processados.

Líquidos Ascítico, Pleural e Sinovial

 Colheita por meio de punção na cavidade peritoneal (paracentese), na cavidade pleural (toracentese) e na cavidade da articulação (artrocentese) efetuada pelo próprio clínico ou profissional competente para a função.

 Transporte: Devem ser enviados de imediato para o laboratório para serem processados.

Exsudados Vaginais e Endocervicais

 A mulher não deve fazer a sua higiene íntima de manhã, não deve usar cremes vaginais na véspera e abster-se de relações sexuais nas 24h precedentes;

 Nos exsudados cérvico-vaginais, as secreções vaginais são obtidas por zaragatoa, que é inserida no meio de transporte adequado, enquanto exsudados endocervical, a mucosa ectocervical é obtido por zaragatoa, com o colo do útero exposto com um espéculo;

 Transporte: Devem ser transportadas de imediato para o laboratório.

Exsudados Purulentos

 Muitas vezes, a quantidade de amostra possível a colher é muito pequena, daí que é preferível obter a amostra por aspiração, biopsia ou raspagem do que por zaragatoa, após desinfeção para aspiração (processo fechado) ou lavagem das infeções superficiais com soro fisiológico (processo aberto).

Cateter Intravenoso

 Desinfeta-se a pele junto ao cateter com solução de iodo e remove-se do cateter. Este é enviado ao laboratório em frasco esterilizado. Este procedimento é realizado por um profissional competente.

5

1.2.CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO

Antes de processar qualquer amostra, é necessário confirmar que determinadas condições são cumpridas, nomeadamente requisição completa idealmente com as indicações clínicas do diagnóstico e terapêutica; produtos devidamente identificados e acondicionamentos em recipientes estéreis e bem fechados; transporte para o laboratório em tempo adequado; amostras não contaminadas como, por exemplo, urina contaminada com fezes ou vice-versa; uso de anticoagulantes corretos e volume adequado Amostras hemolisada ou lipémicas passam nos critérios. Caso algum destes critérios não seja cumprido, a amostra é rejeitada e não processado devendo pedir-se nova amostra.

2. H

À secção de Hematologia chegam vários tipos de amostras biológicas para análise, desde tubos de sangue total em EDTA tripotássico (EDTA K3) para contagens

hematológicas e quantificação de hemoglobina glicada (Hb A1c), em citrato para

velocidades de sedimentação, tubos de heparina lítio para quantificação de cálcio ionizado (Ca2+) e gasimetrias; amostras de líquidos biológicos patogénicos (ascítico, sinovial e pleural) em tubos com EDTA K3 e ainda, líquidos biológicos (liquor e seminal) em tubos e frasco estéreis, respetivamente.

Esta secção encontra-se dividida em duas salas: a sala principal onde estão disponibilizados todos os equipamentos para análise (Tabela 2) e a sala de microscópios para observação de esfregaços de sangue.

Tabela 2 - Equipamentos disponíveis na secção de Hematologia.

Equipamento Funcionalidade

AdamsTM A1c HA-8160 Hb A1c; Frações de Hb

GEM Premier 3500

Gasimetria

GEM Premier 4000

Hematek® Corar esfregaços de sangue

Shadon Cytospin 2 Citocentrífuga

Sysmex XE-2100 Contagem celulares: Hemograma

Sysmex XE-5000 Contagens celulares: Hemograma; Líquidos Biológicos

6 Durante o período de tempo na secção foi possível integrar a rotina manuseando os diferentes equipamentos, tanto no processamento das amostras, como na sua manutenção na execução e observação de esfregaços de sangue periférico e dos diversos líquidos biológicos.

A secção de Hematologia é constituída por dois Técnicos Superiores de Saúde (TSS) e dois Técnicos da Análises Clínicas e Saúde Pública (TACSP). As funções estão distribuídas, mais ou menos, de igual forma pelos técnicos. Os TACSP têm como função a verificação da integridade e qualidade das amostras, assim como, a triagem das amostras e distribuição das mesmas pelos diferentes aparelhos automáticos. Coram e observam lâminas de esfregaços de sangue e líquidos biológicos. Procedem à manutenção dos aparelhos e executam os respetivas CQI. Asseguram ainda, a execução analítica das amostras mediante as listas de trabalho e validam os vários resultados, assim como verificam as faltas no final do dia ou turno, para garantir que todos os testes foram efetuados. Finalmente, devem garantir que as amostras são devidamente acondicionadas e conservadas. Relativamente aos TSS, além das funções mencionadas anteriormente, estes têm responsabilidade de organizar e coordenar a secção, assim como tomar notas das ocorrências ao longo do dia. Avaliam os resultados do controlo de qualidade e, sempre que necessário, entram em contato com os vários representantes dos sistemas utilizados no laboratório.

2.1.HEMOGRAMA

O hemograma é dos testes mais solicitados e mais completos na hematologia. Este fornece informações qualitativas e quantitativas sobre as características das células sanguíneas de um indivíduo. A análise do sangue periférico pretende responder a questões como; se a medula está a produzir um número suficiente de células maduras das diferentes linhagens; se os processos de proliferação, diferenciação e aquisição de funções de cada tipo celular estão a desenvolver-se de maneira adequada. O hemograma permite a contagem, o estudo da morfologia e constituição dos diferentes elementos figurados no sangue.

A amostra é colhida segundo o Manual de Colheitas em tubos de EDTA K3, devidamente identificado com etiqueta com código de barras para facilitar a leitura pelo

7 equipamento automatizado. Os aparelhos destinados para os hemogramas são o Sysmex

2100 (Figura 1) e 5000, ambos acoplados a um computador. 2100 e XE-5000 fornecem uma contagem completa do sangue com o diferencial dos leucócitos,

incluindo granulócitos imaturos, células progenitoras hematopoiéticas, e ainda glóbulos vermelhos nucleados e parâmetros de reticulócitos.

Figura 1 - Analisador automático de hemogramas Sysmex XE-2100.

As amostras são processadas no Sysmex XE-2100 para obter hemogramas e contagem de plaquetas, mas na suspeita da presença de células vermelhas imaturas ou por pedido do clínico, são processados no Sysmex XE-5000.

2.1.1. Princípio de Funcionamento

O sistema automatizado do XE-2100 e XE-5000 da Sysmex Corporation utiliza o poder das tecnologias de citometria de fluxo fluorescente e focagem hidrodinâmico permitindo classificar populações normais de leucócitos (WBC), eritrócitos (RBC) e plaquetas (PLT), diferenciando-as das populações anormais reduzindo assim o número de intervenções manuais. Dependendo do que é solicitado pelo clínico o processamento da amostra pode ser dividido em 7 partes, com diluições e métodos de deteção diferentes.

8

Tabela 3 - Métodos de deteção usados nos aparelhos Sysmex XE-2100 e XE-5000 para

diferenciar e contabilizar as diferentes populações.

Canal Método de Deteção Parâmetros*

IMI RF/DC HPC RBC/PLT Focagem Hidrodinâmico RBC, HCT, MCV, RDW, PCT, PDW, MPV MCH MCHC HGB SLS-Hb HBG 5Diff Citometria de Fluxo com Laser Semicondutor

NEUT, LYMPH, MONO, EO, IG

WBC/BASO WBC, BASO

NRBC NRBC

RET/PLT-O RET, PLT-O

*Não estão incluídos todos os parâmetros quantificados.

I. Canal IMI - Deteção RF/DC

O aparelho está equipado com um canal de informação mieloide imatura (IMI) onde são detetadas seletivamente células da série granulocítica imatura que, normalmente, não estão em circulação no sangue periférico. Este canal usa rádio-frequência e corrente contínua (RF/DC) como método de deteção (ANEXO 2). As células suspensas em reagente hemolítico atravessam o orifício no interior da câmara de deteção alterando as correntes. O tamanho das células vai alterar a DC enquanto RF é alterada pela estrutura e densidade celular. Estas alterações são detetadas e registadas sob a forma de impulsos elétricos. Por fim, atendendo à amplitude destes impulsos, o detetor combina os métodos de modo a formar um diagrama de dispersão (scattergram), refletindo o tamanho e densidade celular simultaneamente.

O canal IMI explora a diferença entre granulócitos maturos dos imaturos, sendo que estes últimos possuem menor teor em colesterol e maior em fosfolípidos (Figura 2).

Figura 2 - Composição de fosfolípidos nos granulócitos imaturos e maturos.

Após exposição ao reagente hemolítico, a membrana das células granulocíticas é danificada. O surfatante não-iónico polioxietileno e os aminoácidos contendo enxofre

9 presentes repõem a membrana dos imaturos, ficando apenas o núcleo dos maturos exposto, permitindo uma distribuição diferente no scattergram.

II. Canal RBC/PLT - Focagem Hidrodinâmica

O canal RBC/PLT faz a contagem e determina o tamanho dos eritrócitos (RBC) e plaquetas (PLT) usando os métodos de impedância e focagem hidrodinâmica (HDF) (ANEXO 3), tendo como objetivo minimizar os fenómenos de perda e variação de impulsos devido ao fluxo não axial e a recirculação de células.

III. Canal HBG – Método de SLS-Hb

O canal HBG usa o método de SLS-Hb para determinação da hemoglobina. O método utiliza o surfatante Laurilsulfato de Sódio (SLS) livre de cianeto, para não correr o risco de toxicidade. A hemoglobina (Hb) é analisada num canal separadominimizando a interferência de concentrações elevadas de leucócitos.

Na presença do reagente hemolítico dá-se a lise dos eritrócitos, a alteração da conformação da molécula de globina, a oxidação do ferro e a formação do complexo SLS-Hb (ANEXO 4). O produto final é um composto colorido que é medido espectrofotometricamente pela leitura da absorvância do pico a 535 nm e do pico adjacente a 560 nm.

IV. Canal 5Diff, WBC/BASO, NRBC e RET/PLT-O - Citometria de Fluxo por Laser Semicondutor

Os canais 5Diff, WBC/BASO, NRBC e RET/PLT-O usam como método de deteção a citometria de fluxo por laser semicondutor (ANEXO 5) com o corante altamente específico de polimetina.

O feixe de laser semicondutor é emitido para as células sanguíneas que atravessam a câmara de fluxo separando-as usando três sinais:

10 - side scatter: indica estrutura interna da célula, como a lobularidade e grânulos no citoplasma, sinal recebido pelo fotomultiplicador;

- side fluorescence: indica a quantidade de material genético presente (DNA e RNA), sinal recebido pelo fotomultiplicador.

A luz recebida pelo detetor é convertida em impulsos elétricos de modo a formar um scattergram para análise de acordo com as diferentes caraterísticas celulares. Os diferentes canais de diferenciação celular usam diferentes sinais para a separação celular (Tabela 4).

Tabela 4 - Canais de diferenciação por citometria de fluxo por laser semicondutor.

Canal Células Diferenciadas Sinais

5Diff Neutrófilos, linfócitos, monócitos,

eosinófilos e granulócitos imaturos. Side scatter e side fluorescence

WBC/BASO Diferenciação entre as células

leucocitárias e os basófilos Forward scatter e side scatter

NRBC Eritroblastos (NRBC) Side fluorescence e forward scatter

RET Reticulócitos Forward scatter e side fluorescence

Canal 5Diff

No canal 5Diff é feita a diferenciação leucocitária em linfócitos, neutrófilos, eosinófilos, monócitos e granulócitos imaturos. Neste canal são analisados sinais de side

scatter e side fluorescence.

O reagente hemolítico leva à lise completa dos eritrócitos e plaquetas e à lise parcial das células leucocitárias. Um segundo reagente, com corante de polimetina, cora os ácidos nucleicos e organelos citoplasmáticos dos leucócitos. Um ácido orgânico presente no reagente liga-se aos grânulos dos eosinófilos, permitindo a sua diferenciação dos neutrófilos, por meio de um sinal de side scatter maior.

Quando as células são expostas ao laser a 633 nm, a intensidade do sinal side scatter é tanto maior quanto maior a complexidade nuclear e de granulação, assim como o side

11

Figura 3 - Mecanismo de ação do canal 5Diff.

Canal WBC/BASO

No canal WBC/BASO é feito a diferenciação entre as células leucocitárias e os basófilos usando sinais forward scatter e side scatter.

Um reagente hemolítico com pH ácido causa a lise e redução do volume dos eritrócitos, plaquetas e células brancas à exceção dos basófilos. São produzidos eritrócitos e plaquetas fantasmas e os núcleos dos leucócitos ficam desprotegidos (Figura 4).

Figura 4 - Mecanismo de ação no canal WBC/BASO.

Assim sendo, os basófilos e as outras células são diferenciadas pelas diferenças volumétricas encontradas e o total da contagem de leucócitos resulta do somatório de basófilos e núcleos desprotegidos.

12

Canal NRBC

No canal NRBC é feito a diferenciação dos eritroblastos (NRBC) em circulação no sangue periférico usando a informação de side fluorescence e forward scatter.

O reagente hemolítico com pH ácido causa a redução do volume dos eritrócitos e plaquetas, e lise parcial da membrana dos leucócitos. A membrana dos eritroblastos é hemolisada ficando apenas o núcleo (Figura 5). Um segundo reagente, com corante fluorescente polimetina, cora os ácidos nucleicos das células brancas e eritroblastos. Deste modo, com base nas diferenças da intensidade de fluorescência, surgem duas populações distintas.

Figura 5 - Mecanismo de ação no canal NRBC.

Este canal permite a separação dos leucócitos e eritroblastos de forma confiável, dado que os leucócitos apresentam uma maior quantidade de material genético e, consequentemente, maior fluorescência que os eritroblastos, recebida pelo side

fluorescence. Por outro lado, como os eritroblastos são menores do que os leucócitos, na

separação destas populações resulta um padrão distinto. O equipamento tem a particularidade de corrigir automaticamente a contagem de WBC e linfócitos quando os eritroblastos estão presentes.

Canal RET

No canal RET são diferenciados os reticulócitos em circulação usando os sinais

forward scatter e side fluorescence. Não havendo interferências na análise por células

nucleadas como leucócitos, eritroblastos e inclusões citoplasmáticas como é o caso de corpúsculos de Howel-Jolly, a contagem de reticulócitos torna-se mais precisa.

13 Os corantes presentes no reagente penetram a membrana das células corando o RNA nos reticulócitos e DNA/RNA nas restantes células nucleadas (Figura 6). Os reticulócitos são separados das células vermelhas maturas de acordo com as diferenças no conteúdo em RNA e das células nucleadas pelas diferenças no conteúdo em DNA/RNA.

Figura 6 - Mecanismo de ação do canal RET.

Quanto maior a quantidade em ácidos nucleicos numa célula, mais forte será o sinal side fluorescence. Por sua vez, quanto maior a célula, mais forte será o sinal de

forward scatter. A quantidade de RNA presente nos reticulócitos provoca diferenças

nas quantidade de fluorescência útil para diferenciar os reticulócitos imaturos (IRF), parâmetro útil para fornecer informação sobre a atividade medular. Além disso, a contagem ótica de plaquetas (PLT-O) permite uma contagem mais precisa das plaquetas quando o método de impedância apresenta interferências, tais como, plaquetas gigantes e/ou eritrócitos macrocíticos.

2.1.2. Interpretação de Histograma

A interpretação de um hemograma (Figura 7), tanto na série vermelha como na série branca ou até plaquetária, pode ajudar a estabelecer diagnóstico. Pode ser útil no seguimento de tratamentos como radio ou quimioterapia e, é um indicador de bom prognóstico na terapêutica de alguns destes estados patológicos. O resultado de um hemograma é composto por eritrograma, leucograma, plaquetas, reticulócitos e granulócitos imaturos.

14

Figura 7 - Exemplo de um resultado de hemograma de uma amostra normal: (1) Dados de

análise; (2) Diagrama de dispersão 5Diff; (3) Diagrama de dispersão WBC/BASO; (4) Diagrama de dispersão IMI; (5) Diagrama de dispersão NRBC; (6) Diagrama de dispersão RET; (7) Diagrama de dispersão PLT-O; (8) Histograma de RBC; (9) Histograma de PLT; (10) Mensagem do sistema de WBC; (11) Mensagem do sistema de RBC/RET e (12) Mensagem do sistema de PLT.

Por sua vez, os resultados de hemograma são construídos a partir de histogramas (Figura 7(8)). Estes histogramas correspondem a representações gráficas de frequência de células versus tamanho fornecendo informações sobre as diferentes populações celulares, podendo retratar a presença de subpopulaçõesservindo como meio de comparação dos tamanhos de células do paciente com os da população normal. Desvios num sentido ou outro da média pode ser importante para o diagnóstico. Numa

população de células homogénea a curva assume uma distribuição gaussiana.(1)

Na presença de eritrócitos maiores do que o normal a curva do histograma está mais desviada para a direita, como acontece em anemias megaloblásticas. Se os eritrócitos são menores que o normal, a curva está mais desviada para a esquerda, como

15 é o caso de anemia ferropénica não tratada que pode ser confirmada com hemoglobina e hematócrito baixo. Após tratamento adequado a curva move-se em direção da normalidade. Uma distribuição bimodal pode ser vista em situações de doença de aglutininas frias, após uma transfusão de eritrócitos normal numa pessoa com eritrócitos

com tamanho anormal, na presença de fragmentos eritrocitários ou aglutinação.(1)

Os índices hematimétricos são úteis na avaliação e no acompanhamento destas alterações eritrocitárias. O conhecimento dos valores de referência permite classificar tais aumentos ou diminuições em qualquer um desses parâmetros e associá-los a alguma eventual patologia.

O equipamento quantifica os parâmetros RBC, hematócrito (HCT), volume globular médio (MCV) por HDF e HGB por SLS-Hb necessários para a determinação da hemoglobina globular média (MCH) e a concentração de hemoglobina globular média (MCHC). O coeficiente de dispersão eritrocitária (RDW) em conjunto com MCV refletem variações no tamanho dos eritrócitos onde estão correlacionados em vários tipos de anemias. Eritrócitos com RDW normal são de natureza homogénea e apresentam muito pouca anisocitose no esfregaço de sangue periférico. Eritrócitos com

RDW aumentado são heterógenos e exibem um elevado grau de anisocitose.O RDW

encontra-se aumentado em situações de deficiência de ferro, vitamina B12 e ácido fólico.

Em hemoglobinopatias, o RDW encontra-se aumentado em proporção do grau de

anemia que acompanha a doença.(1)

Quanto à série branca, apesar de todos os leucócitos agirem na defesa do organismo, as suas funções diferem e permitem diferenciar estados infeciosos, leucémicos ou traumatológicos. Nos diagramas de dispersão existe uma correlação entre os sinais recebidos e a distribuição das populações. Os linfócitos são tipicamente pequenos e com forma regular. Em comparação com as outras células, são menores em volume e absorvem menos daí que se encontram distribuídos na parte inferior do

scattergram. Nos neutrófilos a absorvância é tanto maior quanto maior for a presença de

grânulos citoplasmáticos e núcleos segmentados.(1)

Nos resultados do hemograma aparecem as mensagens do sistema quando são ativados flags, os quais alertam para resultados fora dos valores de referência ou para alterações nos histogramas que evidenciam possíveis alterações morfológicas. A continuação do estudo do hemograma é feita, quando necessário, através da observação

16 de esfregaço de sangue periférico e por interação com resultados obtidos nas outras secções.

2.1.3. Gestão de Resultados

Quando os resultados obtidos no Sysmex XE-2100 e/ou XE-5000 se encontram fora dos limites de referência para qualquer dos parâmetros, pode ser necessário repetir a análise, de preferência no XE-5000, para confirmação ou rejeição do resultado. O equipamento para além de sinalizar os parâmetros quando se encontram altos ou baixos também apresenta flags para diversas patologias associadas. Os delta checks são outro método de controlo para comparação dos leucócitos, hemoglobina, MCV e valores de plaquetas dos pacientes com resultados anteriores. Se a diferença entre as duas leituras for maior que os limites definidos pelo laboratório, o resultado é marcado e retido na bolsa do SIS para revisão.

Foram estabelecidos uma série de regras como critérios de validação para detetar irregularidades e quando uma regra é violada é ativado um alarme no SIS. Assim, um resultado fora dos intervalos de referência ativa flags no aparelho e/ou alarmes no SIS (Tabela 5). Estes resultados ficando presos na bolsa do SIS para se proceder à devida ação e ser validado manualmente pela técnica. Se não for detetada nenhuma irregularidade pelo aparelho, nem nenhuma regra violada no SIS, todos os resultados serão validados automaticamente.

Tabela 5 - Alguns exemplos de flags dado pelo aparelho Sysmex e alarmes no SIS.

Flags/Alarmes Valores Observações

Microcitose MCV < 70 fL - Macrocitose MCV > 110 fL - Hipocromia MCHC < 290 g/L - Anemia HGB < 100 g/L - Eritrocitose RBC > 6,50 1012/L - Agregação RBC? MCHC > 40 g/dL _{RBC ≤ 0,5 10}12

/L Repetir amostra após aquecimento a 37ºC.

Interferência de HGB/turvação?

MCHC > 365 g/L (Sem aglutinação)

HGB falsamente elevado devido a lípidos elevados, proteínas no plasma, WBC elevado. Causas prováveis: hemólise, lipémia, RBC: aglutininas frias.

17

Tabela 5 (Contiunação)

Flags/Alarmes Valores Observações

Deficiência em ferro? MCHC < 310 g/L MCV < 75fL RDW > 15,0% - Deficiência em HGB? RDW ≤ 15,0% MCV < 75fL -

Fragmentos? - Fazer esfregaço para observar a morfologia dos eritrócitos.

Trombocitose PLT >450 109/L Pseudotrombocitose: devido a fragmentos RBC ou extrema microcitose.

Trombocitopenia PLT ˂ 150 109/L

Possível aglutinação plaquetária. Fazer esfregaço. Pseudotrombocitopenia: devido a plaquetas gigantes ou agregados de plaquetas.

Agregados

plaquetários? - Fazer esfregaço.

Blastos? - Fazer esfregaço.

IG? >3% Fazer esfregaço.

Desvio à esquerda? - Possível presença de neutrófilos em banda. Fazer esfregaço.

Delta check + MCV -

Confirmar a identidade do doente. Erro pode ser devido a má agitação, erros de aspiração ou aglutininas frias. Deve-se confirmar a

identidade pois pode corresponder a uma troca de amostra.

2.2.ESFREGAÇOS DE SANGUE PERIFÉRICO

Sempre que necessário, quer seja a pedido do clinico devido a alarmes dado pelo equipamento ou outras suspeitas, é efetuado o esfregaço de sangue periférico e a observação ao microscópio ótico com contagem manual do diferencial leucocitário e observação da morfologia celular. A observação microscópica do esfregaço de sangue fornece informação relevante sobre todos os elementos figurados no sangue.

É importante ter em atenção alterações nas três linhagens. Na linhagem eritrocitária podem observar-se alterações morfológicas, nomeadamente no tamanho, cor e presença de inclusões e alterações no estado de maturação. Na linhagem leucocitária faz-se a contagem leucocitária e observam-se alterações morfológicas, como tamanho, aspeto da cromatina, forma do núcleo, presença de nucléolos, razão núcleo/citoplasma, presença ou ausência de grânulos, basofilia do citoplasma e o estado de maturação dos leucócitos. Na linhagem plaquetária, observam-se alterações

18 morfológicas, como o tamanho, a presença de agregados plaquetários e alterações relativamente ao número de plaquetas.

2.2.1. Preparação de Esfregaço de Sangue

Podem ser usadas amostras de sangue fresco ou então com anticoagulante EDTA K3. No caso deste último, idealmente, o esfregaço deve ser feito até 1 – 2h após colheita, caso contrário, os elementos figurados do sangue total começam a ficar distorcidos quando expostos ao anticoagulante durante muito tempo. Antes de preparar o esfregaço de sangue a amostra deve estar entre 18ºC a 25ºC e devidamente homogeneizada.

Numa lâmina devidamente identificada coloca-se na margem uma gota de sangue, usando um aplicador de gota (Figura 8).

Figura 8 - Esfregaço de sangue periférico com o auxílio de um aplicador de gota de sangue com

espalhador, Haemo-Diff da SARSTEDT. 1. Colocar aplicador no tubo; 2. Tudo é invertido para dispensar uma gota de sangue na lâmina; 3. Usar o espalhador para fazer o esfregaço.(2)

Os aplicadores Haemo-Diff da SARSTEDT têm uma cânula que penetra a membrana na tampa do tubo de colheita onde dispensa uma gota de sangue na lâmina. A utilização destes aplicadores eliminam a necessidade de abrir os tubos de colheita e contaminar a amostra e o desperdiço de mais material para transferir a gota.(2)

Um esfregaço bem preparado deve apresentar as margens da lâmina livres, deve ficar mais fino desde o ponto de origem até a extremidade e terminar em franja (Figura 9).(3)

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Figura 9 - (A) Esfregaço bem preparado; (B) e (C) Esfregaços mal preparados.(2)

Ao exercer muita pressão sobre o espalhador a maioria dos leucócitos podem ser arrastados para a extremidade da lâmina, afetando deste modo a distribuição dos diferentes tipos de leucócitos e diminuindo a contagem de leucócitos no resto do esfregaço.(2)

2.2.2. Princípio da Coloração de Lâminas

A coloração usada para a observação microscópica dos elementos figurados do sangue é do tipo Romanowsky, baseado em soluções alcoólicas com componentes básicos e acídicos. Este, consiste num método de coloração policromático contendo azul-de-metileno e/ou os seus produtos de oxidação, como o Azur B (Trimetiltionina) e,

um corante de halogenado de fluoresceína, normalmente eosina Y

(Tetrabromofluoresceína). O efeito de Romanowsky concede uma cor típica a determinados componentes celulares e reflete a ação combinada da coloração contida no corante a pH compreendido entre 6,7 e 7,0. O núcleo celular cora de roxo, o citoplasma de azul e rosa, e os diferentes grânulos de outras cores específicas.(3)

O azul-de-metileno é um corante básico que cora o núcleo e algumas estruturas citoplasmáticas de azul ou roxo. Estas estruturas coradas são estruturas basófilas, como é o caso de DNA e RNA. Por sua vez, a eosina é um corante acídico que cora algumas estruturas citoplasmáticas de vermelho alaranjado. Estas estruturas coradas são acidófilas, como é o caso de algumas proteínas. Quando ambos os componentes, básico e acídico, coram uma estrutura citoplasmática este adquire a cor rosa ou lilás.(3)

Atendendo ao fluxo diário de amostras recebidas no laboratório a secção de Hematologia tem à sua disposição um corador de lâminas automático Hematek. Trata-se de um aparelho de bancada totalmente automatizado que transporta, fixa e cora lâminas de esfregaços. A coloração utilizada com o aparelho automático é o método de Wright modificado que contem uma combinação de azul-de-metileno e eosina, e metanol como fixador.