Efeito de Matriz em Plasma de Rato

O estudo do efeito de matriz é a análise da possível interferência da matriz biológica na ionização/eluição do composto de interesse no método analítico utilizado (FDA, 2001).

A determinação do efeito de matriz foi realizada apenas em plasma de rato utilizando-se o método de adição pós-extração. Para tanto, amostras de plasma branco adicionados de ácido acético 0,56M foram extraídas conforme descrito na seção 4.15.3 e ressuspensas em solução padrão de miricitrina, preparada em metanol, nas concentrações correspondentes as amostras QC. Os resultados obtidos foram comparados com a análise das amostras padrão de miricitrina, nas mesmas concentrações das amostras QC, as quais foram preparadas em metanol. As amostras foram injetadas no equipamento (LC-MS/MS) e analisadas conforme método descrito na seção 4.15.2. As amostras foram preparadas em quintuplicata. Desta forma, para calcular o efeito de matriz, o resultado gerado da área do pico da miricitrina (QC) quando adicionada após extração, foi comparado com a área do pico gerado para amostras QC preparadas apenas em solvente orgânico, através da equação 3, sendo que, neste caso, o “Valor obtido” corresponde a área do pico obtido da miricitrina, quando adicionada após o procedimento de extração do plasma branco, e o “Valor real” corresponde a área do pico obtido da miricitrina quando a mesma foi apenas diluído em solvente orgânico.

O ensaio do efeito de matriz também foi realizado para o PI em plasma de rato. Para tanto, o plasma branco de rato foi processado conforme descrito anteriormente e, após o procedimento de extração, o resíduo foi ressuspendido com solução padrão do PI (para uma concentração final de 0,200 µg/mL) preparada em metanol. Além disso, amostras contendo o PI, na mesma concentração acima descrita, foram preparadas apenas em metanol. As amostras foram preparadas em quintuplicata. O cálculo do efeito de matriz do PI em plasma de rato foi realizado da mesma forma que para o cálculo do efeito de matriz da miricitrina.

4.16.6 Precisão

Para verificar a precisão dos métodos analíticos empregados para análise da miricitrina em plasma de camundongo e no plasma de rato, foram preparadas as soluções de trabalho para a curva analítica, e, soluções de trabalho para as amostras QC conforme descrito na seção 4.15.1. O plasma branco dos roedores foi enriquecido com as respectivas soluções de trabalho da curva analítica e amostras QC (contendo os respectivos PIs, nas concentrações finais de 0,20 e 0,25 µg/mL para plasma de rato e camundongo), e, em seguida, submetidas ao processo de extração de acordo com o método descrito na seção

4.15.3. Após processamento das amostras, as mesmas foram analisadas no equipamento conforme método já descrito (seção 4.15.2). As amostras QC foram processadas em quintuplicata (plasma de camundongo) ou em sextuplicatas (plasma de rato), enquanto que a curva de calibração, para ambos os métodos, foi preparada em duplicata. Para determinação da repetibilidade que analisa a precisão entre as amostras de mesma concentração processadas no mesmo dia (precisão intra-dia), utilizou-se o cálculo do coeficiente de variação (% CV). Para tanto, primeiramente a curva de calibração resultante para plasma de camundongo e plasma de rato foi calculada, e, a partir da equação da reta gerada pela curva de calibração foi possível determinar a concentração encontrada de cada amostra QC injetada. Após calcular a concentração de cada amostra injetada, a média e o desvio padrão da média, para cada nível de QC (LLOQ, LQC, MQC, HQC e Dil-QC), foram calculados. De posse desses dados, foi possível determinar a precisão intra-dia através do emprego do cálculo do CV:

%CV = [s/M] x 100 (equação 4)

Onde,

s = desvio padrão da concentração determinada entre as amostras de um

mesmo nível de concentração, e

M = média da concentração determinada para as amostras de um mesmo

nível de concentração.

Para a determinação da precisão inter-dia (precisão intermediária), as amostras foram preparadas em três dias diferentes como descrito acima, injetadas no equipamento e analisadas separadamente. A partir da curva de calibração, a equação da reta foi gerada para cada dia de análise, e utilizada para calcular as concentrações de cada amostra injetada, e, em seguida, a média obtida para cada nível de QC. Desta forma, no final de 3 dias, foram geradas 3 médias para cada nível de concentração, uma para cada dia de análise (M1, M2, M3). A partir da média obtida em cada dia de análise, foi possível calcular uma nova média (M4) e o desvio padrão entre essas médias (sdM4), para cada nível de concentração. Sendo assim, a precisão inter-dia, ou, precisão intermediária após 3 dias de análise, foi calculada, de acordo com a equação abaixo:

4.16.7 Exatidão

Para determinação da exatidão dos métodos analíticos empregados para análise da miricitrina em plasma de rato e camundongo, foram utilizadas amostras QC nas mesmas concentrações utilizadas na análise da precisão. As amostras da curva de calibração foram analisadas e a equação da reta gerada, foi utilizada para calcular a concentração de cada amostra QC injetada. A partir da determinação da concentração calculada das amostras, foi possível determinar a média desta concentração para cada nível de concentração. Desta forma, os valores obtidos (calculados) foram comparados com os valores teóricos (nominal), para cada concentração avaliada, de acordo com a equação 6: Exatidão = [Concentração média calculada (QC)] x 100 (6)

Concentração nominal

Para a determinação da exatidão inter-dia, as amostras foram preparadas em três dias diferentes conforme descrito anteriormente para determinação da precisão inter-dia. Desta forma, a injeção das amostras gerou, para cada dia de análise, uma ‘concentração calculada média’ para cada nível de concentração, e no final de 3 dias, foi possível obter uma nova média. A partir dos dados obtidos após 3 dias de análise, foi possível calcular a exatidão intermediária utilizando a mesma equação descrita acima para determinar a exatidão intra-dia (equação 6). Nesse caso, a ‘concentração calculada’ refere-se à média final encontrada após os 3 dias de análise, para cada nível de concentração das amostras QC.