No 7o dia após a imunização, não foi detectada IgG1 anti-OVA no soro dos animais imunizados com OVA solúvel ou emulsificada com IFA e tratados ou não com o extrato hidroetanólico de L. pacari (dados não mostrados). Como seria esperado, já que o adjuvante incompleto de Freund estimula a produção de IgG1, no 14o(Figura 8A) e no 21o(Figura 8B), dia após a imunização inicial, os animais imunizados com OVA emulsificada com IFA produziram IgG1 em níveis significantemente mais elevados do que os camundongos sensibilizados com OVA solúvel. Esses resultados foram
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independentes dos animais terem sido tratados ou não com o extrato hidroetanólico de L. pacari. Os anticorpos da subclasse IgG2a não foram detectados nos soros dos animais imunizados com OVA solúvel ou emulsificada com IFA durante todo o período do experimento (dados não mostrados).
Figura 8: Efeito da L. pacari sobre a produção de IgG1 anti-OVA. Camundongos
C57BL/6 foram imunizados com OVA solúvel ou emulsificada com IFA e tratados ou não com o extrato hidroetanólico de L. pacari. IgG1 específica para OVA foi dosada por ELISA, no soro de cada animal individualmente, diluído 400 vezes, apresentando no 14o (A) e no 21o(B) dia após a imunização níveis significativamente mais elevados de IgG1 nos animais imunizados com esse antígeno emulsificado com IFA comparados àqueles dos camundongos sensibilizados com OVA solúvel. Os dados são mostrados como média ± desvio padrão. * p = 0,0567 e ** p = 0,0001 em relação aos valores de IgG1
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anti-OVA verificados nos animais imunizados com OVA solúvel e tratados ou não com o extrato hidroetanólico de L. pacari.
5 DISCUSSÃO
Os resultados obtidos a partir da contagem de leucócitos totais e subpopulações dessas células no sangue periférico de camundongos C57BL/6 imunizados com OVA solúvel ou OVA/IFA mostram que não houve diferenças estatisticamente significantes do número dessas células, comparando-se os animais tratados com aqueles não tratados com o extrato hidroetanólico de L. pacari. Considerando as subpopulações de leucócitos no sangue periférico, não houve diferenças estatísticas da quantidade dessas células no sangue periférico dos animais sensibilizados com OVA solúvel ou emulsificada com IFA comparando-se os animais que receberam o extrato hidroetanólico de L. pacari com aqueles que não foram tratados com o respectivo extrato. Esses resultados corroboram os dados de um outro estudo pré-clínco, no qual foi mostrado que o extrato metanólico da entrecasca da L. pacari não alterou nos parâmetros anátomo-macroscópicos, hematológicos e bioquímicos41.
Já foi também mostrado que o extrato metanólico de L. pacari não altera os valores normais do hemograma, lipidograma nem das enzimas hepáticas e renais de pacientes humanos51. Os dados do presente trabalho estão de acordo com resultados pré- clínicos e clínicos mostrando que o extrato metanólico de L. pacari não altera os níveis de leucócitos totais e subpopulações destas células no sangue periférico41,50. Em conjunto, esses resultados associados aos do presente estudo demonstram, pelo menos quanto aos leucócitos do sangue periférico a falta de efeitos tóxicos pelo uso de L. pacari para fins medicinais.
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Sob as mesmas condições experimentais, não se observa diferença estatística do número de células esplênicas entre os animais que receberam o extrato da L. pacari e aqueles que não o receberam, quando foram avaliados no final do tratamento. Considerando os resultados do presente trabalho e aqueles da literatura mostrando que extratos da entrecasca do caule da L. pacari não alteram significativamente a quantidade de células maduras do sistema imune, pode-se sugerir que a L. pacari é uma planta medicinal que em sendo usada na forma de macerado aquoso, não deve alterar quantitativamente as células maduras do sistema imune. Vale ressaltar que o extrato hidroetanólico usado no presente estudo não continha esteróides, pelo menos em quantidade detectável pela reação de Lieberman-Buchard usada na análise fitoquímica. Os resultados da falta de efeitos imunossupressores do extrato hidroetanólico de L. pacari, usado nesse trabalho pode estar associada à ausência de esteróides no extrato usado. Pode-se também postular que o efeito anti-inflamatório da L. pacari não está associado à redução do número de células maduras do sistema imune.
Solon et al. (2000)49 isolaram do extrato metanólico da casca do caule de L. pacari o ácido elágico e demonstraram a atividade antioxidante deste metabólito. A amplitude dos efeitos biológicos benéficos do ácido elágico faz da casca de L. pacari uma importante fonte medicinal. Mesmo havendo inúmeras e complexas substâncias químicas nessa droga vegetal, a comparação das atividades terapêuticas do ácido elágico com o uso medicamentoso da casca de L. pacari sugerem a atuação dessa substância como principal composto químico ativo.
O baço não apresenta modificação quanto ao peso, porém o fígado dos animais que receberam somente o extrato hidroetanólico da L. pacari apresentou redução significativa do peso, quando comparado ao dos animais que não receberam o extrato, independente de terem sido ou não imunizados com OVA solúvel ou emulsificada com IFA. Até onde se sabe, não havia na literatura dados mostrando que extratos da L. pacari
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reduzem significantemente o peso do fígado de camundongos. No presente estudo, não foi esclarecido o mecanismo pelo qual o extrato hidroetanólico de L. pacari reduz significantemente o peso do fígado de camundongos, necessitando neste caso de novos estudos sobre uma possível hepatotoxicidade da L. pacari.
Em relação aos níveis de IgG1 anti-OVA determinados no soro dos animais imunizados com esse antígeno solúvel ou emulsificado com IFA, aos resultados da resposta primária, 7o dia após a imunização inicial, mostram que o extrato hidroetanólico de L. pacari, não altera a cinética de produção dessa subclasse de IgG visto que, independente dos animais terem sido tratados ou não com L. pacari, não houve alteração dos níveis de IgG1 anti-OVA comparados àqueles dos camundongos não imunizados. A partir desses dados pode-se concluir que a L. pacari não altera a cinética da resposta de linfócitos B e T maduros que estão respondendo à OVA, visto que a IgG1 específica é normalmente produzida por camundongos somente na resposta secundária61,62,63A hipótese de que a L. pacari não altera a cinética da resposta humoral contra um Ag T-dependente é reforçada pelos resultados mostrando que, no 14º e 21º dia após a imunização inicial, os animais imunizados com OVA solúvel independente de terem sido tratados ou não com L. pacari, não apresentaram aumento significante dos níveis de IgG1 anti-OVA. Como seria esperado, visto que o IFA é um adjuvante que estimula a produção de anticorpos64,65,66,67 os níveis de IgG1 anti-OVA verificados no 14o e no 21o dia após a imunização inicial, os animais imunizados com OVA emulsificada com IFA são significantemente mais elevados comparados àqueles dos camundongos sensibilizados com OVA solúvel. Embora já tenhamos mostrado que o extrato etanólico de L. pacari estimula a produção de Ig anti-OVA em camundongos Swiss68, naquele estudo, além dos animais usados serem “outbred” a dose do antígeno era alta. Assim, sendo, ainda não se pode afirmar que os resultados do presente estudo contradizem ao que havia sido previamente mostrado por nosso grupo. A confirmação ou não da ação adjuvante de extratos hidrofílicos de L. pacari requer um estudo usando
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diferentes doses do mesmo antígeno e camundongos da mesma linhagem. A partir dos resultados, pode-se apenas concluir que o extrato hidroetanólico de L. pacari não estimula a produção de IgG1, quando camundongos C57BL/6 são imunizados com uma baixa dose de OVA solúvel ou emulsificada com IFA.
6 CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que o extrato hidroetanólico de L. pacari, na dose de 200 mg/kg/dia, não altera o número de leucócitos totais e subpopulações dessas células no sangue periférico nem a quantidade de esplenócitos. Pode-se também concluir que, sob as mesmas condições experimentais, o extrato hidroetanólico de L. pacari, não altera a cinética nem os níveis de IgG1 anti-OVA, sugerindo que a L. pacari não tem efeitos significantes sobre as células maduras do sistema imune, inclusive aquelas que estão respondendo à ovalbumina.
Neste caso o presente estudo contribui e reforça dados científicos de outros estudos, que a L. pacari tradicionalmente usada pela população tradicional matogrossense para fins medicinais, não apresenta efeitos adversos de toxicidade.
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