JULIANA LOBO DE SANTANA
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DE Lafoensia pacari SOBRE A RESPOSTA IMUNE
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DE Lafoensia pacari SOBRE A RESPOSTA IMUNE
JULIANA LOBO DE SANTANA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Faculdade de Medicina, como requisito final para a obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde - Área de Concentração: Doenças Infecciosas e Tropicais
Orientador: Profª. Drª. Deijanira Alves de Albuquerque
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
L799a Lobo de Santana, Juliana.
Avaliação do efeito do extrato hidroetanólico de Lafoensia pacari sobre a resposta imune / Juliana Lobo de Santana. -- 2012
49 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientador: Profa. Dra. Deijanira Alves de Albuquerque. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Cuiabá, 2012.
Inclui bibliografia.
1. Lafoensia pacari. 2. Ovalbumina. 3. Adjuvante Incompleto de Freund. 4. Resposta imune. I. Título.
Agradeço a Deus e aos condutores espirituais pelas boas energias enviadas nos momentos de luta, derrota e vitória, sei que estiveram ao meu lado sempre.
DEDICATÓRIA
A minha grandiosa família, meus pais Heloísa e Charles pelo exemplo de amor, trabalho, persistência e determinação nos caminhos da vida, vocês foram e ainda são meu alicerce.
A meus irmãos Carla, André e Diogo pelo carinho, apoio e paciência, vocês me ensinaram o que é ter e ser família.
Ao meu namorado Jeison Tuesta que há 5 anos é parte integrante da minha vida, obrigada por fazer parte dessa conquista , te amo muito.
Ao meu primo Dr. Hebert Donizeti Salerno por ter me ajudado a construir uma vida profissional em uma terra desconhecida, minha querida Cuiabá.
Aos meus familiares distantes, minha querida avó Luci, meus tios e primos pelos conselhos a mim enviados.
AGRADECIMENTOS
A minha professora orientadora, Dr.ª Deijanira Alves de Albuquerque, pelos preciosos ensinamentos transmitidos durante a condução desta pesquisa. Agradeço imensamente pela oportunidade, confiança, carinho, respeito e apoio em todos os momentos do projeto.
As mestrandas Deborah de Arruda Isoton e Jacqueline Castilho pelo companheirismo e ajuda incondicional durante a execução dos experimentos, o apoio e a amizade de vocês foram fundamentais em várias etapas do projeto.
Ao técnico Ivan Lopes pela coleta da planta Lafoensia pacari.
Ao prof. Dr. Germano Guarim Neto, do Departamento de Botânica e Ecologia, do Instituto de Biociências da UFMT, pela ratificação taxonômica.
A Prof.ª Dr.ª Virgínia Cláudia da Silva pela abordagem fitoquímica do extrato hidroetanólico.
A Profa. Dra. Nair Honda e ao técnico Air pela trituração das entrecascas da L. pacari. A Prof.ª Dr.ª Maria Luzinete Alves Vanzeler pela liberação do espaço físico do Laboratório de Psicofarmacologia da UFMT para a experimentação com os camundongos.
A Médica Veterinária Danúbia de Souza Fontana pela participação no projeto durante o protocolo de anestesia e eutanásia com os animais, bem como no fornecimento da maravalha utilizada na pesquisa.
Ao técnico Celso Roberto Afonso do laboratório LAPA pela ajuda constante no fornecimento de materiais de uso durante as experimentações.
A Keylla Okada, secretária do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, pela disposição constante em todos os momentos em que mais precisei.
A minha banca examinadora composta pelos professores, Dr. Amílcar Sabino Damazo, Dra. Maria Luzinete Alves Vanzeler, e Dr. Rogério Alexandre Nunes dos Santos pelas valiosas contribuições durante as correções da dissertação nos momentos da qualificação e defesa.
A minha querida comadre e amiga Daiane Beatriz Martins Cunha por me encorajar a nunca desistir do caminho a trilhar.
Aos meus amigos, Profa. Dra. Natascha Slhessarenko, Keuma Jardins, Maria Paula Franco, Marli Pasinato, Raquel Vanessa de Faria, Mariana Zacarias, Lucilla Paula Altimari, Francyslene Rosa, Itamar Tuca, Soraia Oberherr, Maria de Fátima Silva, Hadyson Sá Neide Lopes, Fernando Jorge Rodrigues de Oliveira, Ricardo Moura Aguiar, pela amizade construída e por terem sido minha segunda família quando em Cuiabá cheguei.
Ao Centro Universitário Cândido Rondon – UNIRONDON e Centro Técnico Matogrossense - CETEM do qual faço parte do quadro de docente, pela concessão da licença para a qualificação profissional.
A Profa Liziane Cristina de Almeida, coordenadora do Curso de Biomedicina pela amizade e incentivo ao aprimoramento do conhecimento.
A Profa Sueli Medrado, coordenadora do Curso Técnico em Análises Clínicas pela confiança em todos os momentos.
Aos meus queridos alunos fonte de inspiração, pelo carinho e respeito constante. Aos animais utilizados no projeto, que deram suas vidas em troca do meu conhecimento.
RESUMO
Avaliação do efeito do extrato hidroetanólico de Lafoensia pacari sobre a resposta imune
A Lafoensia pacari St. Hil. (Lythraceae) é uma espécie da flora do cerrado, usada tradicionalmente em Mato Grosso para emagrecimento, cicatrização de feridas externas, tratamento de dores e úlceras gástricas e como agente anti-inflamatório. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do extrato hidroetanólico da L. pacari sobre o número de leucócitos do sangue periférico, esplenócitos e sobre a produção de IgG1 em camundongos imunizados ou não com uma baixa dose de ovalbumina (OVA) emulsificada ou não com o adjuvante incompleto de Freund. Para tanto, foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem C57BL/6 adultos, fêmeas, distribuídos de forma aleatória em seis grupos, com 4-5 animais por grupo, os quais receberam 200 mg/kg/dia do extrato hidroetanólico de L. pacari, durante 21 dias. Os resultados mostram que o extrato hidroetanólico de L. pacari administrado por um período de 21 dias não altera o número de leucócitos totais, as subpopulações dessas células no sangue periférico, nem a quantidade de esplenócitos. Os resultados também indicam que o extrato hidroetanólico de L. pacari, não altera a cinética de produção nem os níveis de IgG1 anti-OVA, sugerindo que a L. pacari não tem efeitos significantes sobre as células maduras do sistema imune, inclusive aquelas que estão respondendo ao estímulo imunogênico da ovalbumina.
Palavras-chave: Lafoensia pacari, ovalbumina, adjuvante incompleto de Freund, resposta
ABSTRACT
Evaluation the hydroethanolic extract of Lafoensia pacari on immune response
Lafoensia pacari St. Hil. (Lythraceae) is a specie of the “cerrado” flora, traditionally used in Mato Grosso for loosing weight, healing external wounds, treatment pain and gastric ulcers and as an anti-inflammatory agent. The objective of this study was to evaluate the effect of the hydroethanolic extract of L. pacari on the number of peripheral blood leukocytes, spleen cells and the production of IgG1 in mice immunized or not with a low dose of antigen in the presence or absence of incomplete Freund’s adjuvant. For this purpose, we used inbred mice of the C57BL/5 strain, adult, females, randomly distributed into six groups with 4-5 animals per group which received 200 mg/kg/day of the hydroethanolic extract of L. pacari for 21 days. The results show that the hydroethanolic extract of L. pacari administered for 21 days does not alter the total number of white cells and also the number of subpopulations of these cells in peripheral blood and spleen. Our results indicate that the hydroethanolic extract of L. pacari does not alter the kinetics or the levels of anti-OVA IgG1, suggesting that L. pacari does not have significant effects on mature cells of the immune system, including those that are responding to ovalbumin.
Lista de abreviaturas e siglas
Ac: Anticorpo Ag: Antígeno
ANOVA: Análise de variância BSA: Albumina bovina sérica
EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético H. pylori: Helicobacter pylori
IFA: Adjuvante incompleto de Freund
ELISA: Enzimaimunoensaio (Enzyme Llinked Immunosorbent Assay) H2SO4: Ácido sulfúrico
H2O2: Peróxido de hidrogênio Ig: Imunoglobulina
L. Pacari: Lafoensia pacari OPD: Ortofenileno-diamino OVA: Ovalbumina
PBS: Salina tamponada com fosfato RPM: Rotação por minuto
SUMÁRIO Lista de figuras 14 Lista de tabela 15 1 Introdução 16 2 Objetivo 20 3 Material e métodos 20
3.1 Coleta do material botânico 20
3.2 Preparo do extrato hidroetanólico 21
3.3 Análise fitoquímica preliminar por via úmida 21
3.4 Animais 21
3.5 Antígeno e adjuvante 22
3.6 Preparo da emulsão OVA/IFA para a imunização dos camundongos 22 3.7 Teste de estabilidade da gotícula (droplet teste) 23 3.8 Imunização e tratamento dos animais com o extrato hidroetanólico de L. pacari 24
3.9 Coleta de sangue 25
3.10 Contagem dos leucócitos totais do sangue periférico 26 3.11 Contagem das subpopulações de leucócitos do sangue periférico 26
3.12 Preparo das suspensões de esplenócitos 26
3.13 Contagem dos esplenócitos 27
3.14 Quantificação de anticorpos séricos anti-OVA 27
3.15 Análise estatística 28
4.1 Análise fitoquímica por via úmida do extrato hidroetanólico de L. pacari 28
4.2 Avaliação do efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o número de leucócitos
totais no sangue periférico 29
4.3 Avaliação do efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre as subpopulações de
leucócitos no sangue periférico 30
4.4 Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o número de esplenócitos 32
4.5 Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o peso do baço 32
4.6 Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o peso do fígado 33
4.7 Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre a produção de IgG1 34
5 Discussão 36
6 Conclusão 39
7 Referências bibliográficas 40
8 Apêndice 1 48
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Instrumentos usados para o preparo da emulsão OVA/IFA 23
Figura 2: Gotícula estável da OVA emulsificada com IFA 24
Figura 3: Avaliação do efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o número de
leucócitos no sangue periférico 30
Figura 4: Efeito ação do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre as populações de
neutrófilos e linfócitos no sangue periférico 31
Figura 5: Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o número de esplenócito32
Figura 6: Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o peso do baço 33
Figura 8: Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre a produção de IgG1 anti-OVA
35
LISTA DE TABELA
16
1 INTRODUÇÃO
Evidências encontradas em escavações paleolíticas mostram que o conhecimento das plantas com atividades medicinais existe há pelo menos 60.000 anos1 e, por muito tempo, as plantas, alguns minerais e produtos de origem animal foram os únicos elementos utilizados pela população humana para o tratamento de doenças2.
O aumento da popularidade e da influência da medicina convencional ocasionou um declínio na terapia com base nas plantas medicinais, a revolução industrial e o desenvolvimento da química orgânica contribuíram para a preferência de uso de produtos sintéticos no tratamento farmacológico. As razões para tal preferência podem ser explicadas pela obtenção mais facilmente de compostos puros, modificações estruturais produzindo medicamentos mais ativos e seguros e o aumento do poder econômico das indústrias farmacêuticas3.
O uso de plantas medicinais pela população mundial tem aumentado significativamente nos últimos tempos. Estima-se que cerca de 80% da população dos países subdesenvolvidos e em desenvolvimento são dependentes da medicina caseira, pois se utilizam destas espécies medicinais para a tentativa de cura dos seus mais variados males4. A Organização Mundial de Saúde (OMS) confirma estes dados e complementa afirmando que, desse total, pelo menos 30% ocorreram por indicação médica. Esta prática tem inclusive recebido incentivo da própria OMS. Desta forma, são muitos os fatores que vêm colaborando no desenvolvimento de práticas de saúde que incluem plantas medicinais, principalmente, em termos econômicos e sociais5.
Apesar do surgimento dos inúmeros medicamentos sintéticos, as plantas medicinais continuam sendo extensivamente estudadas, tendo em vista a grande biodiversidade da flora do nosso planeta, em especial dos países tropicais6, e além do
17
intuito de se desenvolver fitoterápicos e fitofármacos seguros, eficazes, de baixo custo e com efeitos colaterais menores do que aqueles dos medicamentos sintéticos7. A presença de metabólitos especiais em muitas plantas tradicionalmente usadas como medicinais indicam ações antibacteriana8,9, anti-helmíntica10, anti-séptica11,12,
anti-inflamatória13,14,15 e imunoreguladora 16,17,18,19,20.
Além da importância científica de se conhecer potenciais ações imunoreguladoras de plantas medicinais, outro fator que impulsiona a pesquisa cientifica nessa área é o crescimento do número de espécies vegetais utilizadas na medicina popular para o tratamento de doenças que comprometem o sistema imunitário21.
No Brasil, as plantas medicinais ainda são largamente usadas pela população tradicional para o tratamento de algumas enfermidades e manutenção da saúde22, estando essa prática intimamente associada à cultura indígena23. O Brasil possui uma farmacopéia popular muito diversa, baseada em plantas medicinais, resultante de uma miscigenação cultural, envolvendo africanos, europeus e indígenas, e introdução de espécies exóticas, pelos colonizadores, imigrantes e escravos24.
Em nosso estado, além dos índios, a população tradicional matogrossense detém um amplo conhecimento de várias espécies de plantas medicinais que são largamente usadas como alternativa terapêutica para o tratamento de suas enfermidades25. Entre as plantas medicinais do cerrado matogrossense, destaca-se a Lafoensia pacari como sendo uma das espécies mais importantes para o uso medicinal pela população tradicional26.
A Lafoensia pacari, St. Hil. (Lythraceae) é uma planta que mede até 18 m de altura, com tronco medindo de 30 a 60 cm de diâmetro, estando presente em florestas de altitude, no cerrado e na arborização ornamental urbana27,28,29,30. A L. pacari pertence à família Lythraceae, a qual é representada por cerca de 600 espécies distribuídas principalmente nos trópicos31,32. Popularmente, a L. pacari é conhecida como mangava brava33, mangaba, pacari 34,35,36,37,38, dedaleira, dedal39, entre outros. Em Mato Grosso, a
18
L. pacari é tradicionalmente usada para emagrecimento, cicatrização de feridas externas e tratamento de distúrbios estomacais28,26.
Lafoensia pacari - Foto: Vânia Tonello
A população tradicional matogrossense usa a entrecasca de L. pacari na forma de macerado aquoso para o tratamento da úlcera gástrica36. O efeito gastroprotetor da L. pacari foi cientificamente mostrado em ensaios pré-clínicos, usando extratos metanólico, hexânico e diclorometânico para tratar úlceras gástricas induzidas por metanol em Rattus novergicus40,41. Em outros estudos pré-clínicos foi mostrado que o ácido elágico inibe significativamente a secreção ácida e a ocorrência de lesões gástricas induzidas por estresse (imersão/retenção)42, etanol43 e isquemia/reperfusão44, corroborando assim o uso popular da entrecasca de L. pacari para o tratamento de enfermidades estomacais45. Já foi também mostrado que o ácido elágico, purificado a partir do extrato metanólico da L. pacari, é um potente antioxidante frente ao radical difenil-picril-hidrazila e à enzima xantina-oxidase46.
A análise fitoquímica dos extratos metanólico, hexânico e diclorometânico preparados a partir de entrecascas do caule da L. pacari mostrou que esses extratos contém esteróides, saponinas, taninos pirogálicos, triterpenóides, fenóis simples, ácidos fixos fortes e compostos fenólicos47,48,41,46. Dentre os compostos fenólicos encontrados,
19
está o ácido elágico que é um marcador químico da L. pacari 41,46,49 e tem atividade antioxidante, antitumoral e inibitória do Helicobacter pylori49. No entanto, segundo o estudo clínico de Mota-Menezes et al. (2006)50, o extrato metanólico de L. pacari não tem atividade anti-H. pylori. Declara-se também a ação antimicrobiana dos extratos das folhas e da casca sobre Cândida albicans e Staphylococcus aureus51. Segundo os autores, aos extratos obtidos a partir da casca possuem atividade positiva sobre Cândida albicans e os extratos da folha são ativos sobre os dois micro-organismos testados. A potente ação antibacteriana do extrato hidroalcoólico de L. pacari contra bactérias multiresistentes de origem hospitalar também foi registrada52.
Os primeiros estudos realizados por nosso grupo, há mais de uma década, mostraram que o extrato etanólico da entrecasca do caule de L. pacari reduz o recrutamento de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos injetados com carragenina53, corroborando assim o uso tradicional da L. pacari como anti-inflamatório. Nós também já mostramos que os extratos etanólico e aquoso da L. pacari inibem a hipersensibilidade tardia induzida por hemácias de carneiro e TNP no modelo murino54, enquanto o extrato etanólico estimula a produção de anticorpos contra antígeno T-dependente55. Todas as atividades biológicas dos extratos hidrofílicos observadas no modelo murino são dependentes da dose do extrato e do tempo de tratamento dos animais.
Empregando o modelo de toxocaríase em camundongos, nós também mostramos que o extrato etanólico da entrecasca do caule de L. pacari reduziu o número de eosinófilos no sangue periférico, na medula óssea, cavidade peritoneal e no lavado broncoalveolar56. Nós já mostramos também que o extrato etanólico de L. pacari inibe a produção de IL-5, migração e maturação de eosinófilos no modelo de asma murino57,58.
Considerando a relevância do conhecimento científico de atividades de plantas medicinais sobre o sistema imunitário e o fato de estudarmos, há mais de dezesseis anos
20
as potenciais atividades da L. pacari sobre o sistema imunitário, o presente trabalho tem por objetivo:
Avaliar o efeito do extrato hidroetanólico da L. pacari sobre a quantidade de leucócitos periféricos, esplenócitos, peso do baço e do fígado e sobre a produção de IgG1 em camundongos imunizados ou não com uma baixa dose de Ag em presença ou não do adjuvante incompleto de Freund.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta do material botânico
As entrecascas do caule de L. pacari usadas nesse trabalho foram coletadas em 23 de junho de 2011 às 14:00 h, de uma árvore adulta, medindo cerca de 4 metros de altura, nativa, crescida em terreno arenoso, coordenadas 15°40'08.34''S 55°57'12.75''O elevação de 190 m (Google Earth, acesso em 05 de junho de 2012). A coleta foi realizada por Ivan da Costa Lopes, técnico do Departamento de Botânica e Ecologia (BOTECO) do Instituto de Biociências (IB) da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT). Foram coletados 500 gramas de entrecascas e uma amostra, contendo caule, folhas e frutos, foi encaminhada ao Herbário Central da UFMT para identificação botânica pelo Prof. Dr. Germano Guarim Neto, estando a exsicata de número 39560 depositada no Herbário Central da UFMT (Apêndice 1).
21
3.2 Preparo do extrato hidroetanólico
Antes do preparo do extrato hidroetanólico, as entrecascas do caule da L. pacari foram limpas e colocadas para secar à temperatura ambiente durante duas semanas até a obtenção de um material totalmente seco. Posteriormente, as entrecascas foram trituradas em moinho elétrico de facas (Willye, Modelo STAR FT-60 Macro, Fortinox) até a consistência de pó, o qual foi colocado em maceração em álcool etílico a 70% (10% p/v) por sete dias, a 4ºC para se obter o extrato hidroetanólico. Após filtração do macerado e lavagem da torta com álcool etílico a 70% para a retirada do solvente, o solvente foi evaporado à temperatura ambiente sob ventilação continua e o extrato hidroetanólico seco assim obtido foi acondicionado a 4ºC até o uso.
3.3 Análise fitoquímica preliminar por via úmida
A análise fitoquímica do extrato hidroetanólico de L. pacari foi realizada por via úmida conforme descrito anteriormente por Matos, (2009)59. A análise foi realizada sob a supervisão da Prof.ª Dr.ª Virgínia Cláudia Silva, no Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais, do Departamento de Química da UFMT.
3.4 Animais
Os camundongos isogênicos da linhagem C57BL/6, fêmeas, empregados nesta pesquisa foram comprados do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB), da Universidade de Campinas
22
(UNICAMP), Campinas, SP. Os animais foram mantidos no laboratório de Psicofarmacologia do Departamento de Ciências Básicas em Saúde, da Faculdade de Medicina da UFMT em caixas de polipropileno, em ambiente com temperatura de 25ºC e ciclo de claro e escuro de 12 h com livre acesso a água autoclavada e ração (Labina® Purina). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da UFMT, protocolo No23108.029551/11-0. (Anexo 1), contando com a responsabilidade técnica da Medica Veterinária Danúbia de Sousa Fontana, CRMV 03792.
3.5 Antígeno e adjuvante
Foi utilizado como antígeno padrão a ovalbumina (OVA, grau III, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) e como adjuvante foi usado o adjuvante incompleto de Freund, à base de óleo mineral (IFA, Sigma®).
3.6 Preparo da emulsão OVA/IFA para a imunização dos camundongos
A emulsão usada para a imunização inicial dos animais dos grupos 5 e 6 foi preparada na proporção de 1:1 (v/v) da solução de OVA e IFA. A emulsão foi feita manualmente, conforme descrito por Moncada et al (1993)60, modificada para o uso de seringas de vidro adaptadas com um “three way” (conector de três vias, Figura 1 ).
23
Figura 1: Instrumentos usados para o preparo da emulsão OVA/IFA.
3.7 Teste de estabilidade da gotícula (“droplet test”)
A estabilidade da emulsão foi testada conforme descrito por Moncada et al.
(1993)60e foi considerada adequada para as imunizações quando gotejada em água destilada gelada não se dispersou por período de até 2 min (Figura 2).
24
Figura 2: Uma gotícula estável da OVA emulsificada com IFA.
3.8 Imunização e tratamento dos animais com o extrato hidroetanólico de L. pacari
No início do experimento, os animais estavam com nove semanas de idade e foram divididos, de forma aleatória, em seis grupos, com 4-5 animais por grupo, os quais estão detalhadamente descritos abaixo:
Grupo 1: Os animais foram tratados por três semanas com extrato hidroetanólico de L. pacari (200 mg/kg/dia; v.o.). O extrato foi adicionado à água de beber, na dosagem de 5 mg/5 mL de água, considerando que cada animal bebe 5 mL de água por dia. A água de todos os animais foi medida e trocada diariamente e, quando necessário, a quantidade de extrato colocado na água foi ajustada;
Grupo 2: Os camundongos foram imunizados por via intraperitoneal (IP) com 10 g de OVA dissolvida em 100 L de salina;
25
Grupo 3: Os camundongos foram imunizados intraperitonealmente com OVA, como descrito para o grupo 2, e tratados por três semanas com extrato hidroetanólico de L. pacari conforme descrito para o grupo 1;
Grupo 4: Os animais foram deixados sem tratamento e sem imunização, chamado de grupo naïve;
Grupo 5: Os camundongos foram imunizados por via intraperitoneal com 10 g de OVA dissolvida em 50 L de salina emulsificada com 50 L do adjuvante incompleto de Freund Grupo 6: Os camundongos foram imunizados por via intraperitoneal com 10 g de OVA dissolvida em 50 L de salina emulsificada com 50 L de IFA e tratados por três semanas com extrato hidroetanólico de L. pacari, como descrito anteriormente.
No 14º dias após a primeira imunização, os animais dos grupos 2, 3, 5 e 6 receberam um reforço, por via intraperitoneal, com 10 g de OVA dissolvida em 100 L de salina.
3.9 Coleta de sangue
Amostras de sangue foram coletadas por punção venosa do plexo retro-orbital de cada animal individual com o auxílio de pipetas Pasteur, no dia zero, ou seja, imediatamente antes da primeira imunização e nos dias 7, 14 e 21. O sangue coletado foi colocado em tubos cônicos e deixado em repouso por 2 h à temperatura ambiente para a retração do coágulo. Em seguida, as amostras de sangue foram centrifugadas a 2.000 g por 20 min e os soros obtidos foram acondicionados a -20°C para análise posterior da presença de anticorpos específicos para OVA.
26
3.10 Contagem dos leucócitos totais do sangue periférico
Para a contagem dos leucócitos totais, 20 µL do sangue foram diluídos a 1:20 em solução de Turk. A contagem foi realizada câmara de Neubauer com objetiva de 40x e os resultados estão expressos como leucócitos x 106/mL.
3.11 Contagem das subpopulações de leucócitos do sangue periférico
A contagem das subpopulações de leucócitos do sangue periférico foi realizada em esfregaços sanguíneos corados com corante panótico rápido (Instant Prov, Newprov ®). A contagem foi realizada em objetiva de 100x em óleo de imersão e os resultados foram expressos em %.
3.12 Preparo das suspensões de esplenócitos
No final do experimento, os animais foram sacrificados e seus baços foram coletados e divulsionados em 3 mL de meio por baço (DMEM; Invitrogen), para se obter as suspensões de esplenócitos. As suspensões de células foram colocadas em tubos cônicos, deixadas em repouso, no gelo, durante 2 h para posteriormente serem quantificadas.
27
3.13 Contagem dos esplenócitos
Para a contagem dos esplenócitos, 20 µL de cada suspensão celular foram diluídos a 1:20 em solução de Turk. A contagem foi realizada câmara de Neubauer em objetiva de 40x e os resultados expressos como esplenócitos x 106/mL.
3.14 Quantificação de anticorpos séricos anti-OVA
Os soros obtidos dos animais imunizados com OVA ou OVA/IFA e tratados ou não com extrato hidroetanólico de L. pacari, foram analisados através do ensaio de Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), a fim de se pesquisar a presença de IgG1 e IgG2a anti-OVA, conforme descrito anteriormente62. Resumidamnete: As reações foram realizadas em microplacas de poliestireno (Corning Incorporated Costar, USA) com 96 poços e fundo plano. As placas foram sensibilizadas com OVA a 20 g/mL (50 L/poço) dissolvida em tampão carbonato-bicarbonato, pH 9.0 e incubadas por cerca de 18 h a 4°C. Após a sensibilização, descartou-se o excesso de antígeno, lavou-se cada placa 3 vezes com salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7.2, contendo Tween-20 (Sigma) a 0,05% (PBS-Tween) e as ligações inespecíficas foram bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA, Sigma) a 1% em PBS durante 1 h, à temperatura ambiente. Em seguida, o excesso de solução bloqueadora foi descartado, os soros diluídos a 1/400 foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas novamente por cerca de 18 h a 4°C. Removeu-se o excesso dos soros, lavando as placas 5 vezes com PBS-Tween, adicionou-se 50 µL por poço de anticorpo monoclonal anti-IgG1 ou
28
anti-IgG2A (Zymed®) marcados com peroxidase, na diluição de 1/4000 e as placas foram incubas por 1 h à temperatura ambiente. O excesso de Ac-enzima foi descartado lavando a placa 6 vezes com PBS-Tween e a reação Ag-Ac foi revelada adicionando água oxigenada (H2O2) com o cromógeno ortho-phenyldiamine (OPD; Sigma Aldrich® USA). As placas foram incubadas por 20 min à temperatura ambiente no escuro e a reação enzima-substrato foi interrompida adicionando 50 µL de H2SO4 2N. As reações foram determinadas em leitor de microplacas de ELISA (Thermo Plate modelo TP READER NM) a 492 nm e os resultados expressos em valores de absorbância.
3.15 Análise estatística
Os dados foram tratados por análise de variância (ONE WAY ANOVA), seguido do teste Tukey, para comparações múltiplas, utilizando o software GraphPad Prism 5. O nível de significância foi de p<005. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão.
4 RESULTADOS
4.1 Análise fitoquímica por via úmida do extrato hidroetanólico de L. pacari
A análise fitoquímica, feita pela via úmida, do extrato hidroetanólico de L. pacari mostrou que esse extrato contém os seguintes metabólitos secundários: taninos, flavonóides, saponinas e ácidos fixos fortes (Tabela 1). No mesmo extrato analisado
29
pela via úmida, usando a reação de Lieberman-Buchard não foi detectada a presença de esteróides
Tabela 1: Análise fitoquímica, pela via úmida, do extrato hidroetanólico de L. pacari
Metabólitos especiais Reações de identificação Resultados
Taninos Teste com cloreto férrico ++++
Flavonóides Reação de Shinoda ++++
Saponinas Teste de espuma ++++
Ácidos fixos fortes
Esteróides
Ensaio com reagente de Nessler Reação de Lieberman Burchard
+++
-4.2 Avaliação do efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o número de leucócitos totais no sangue periférico
Os resultados mostrados na figura 3 revelam que o extrato hidroetanólico de L. pacari, na dose de 200 mg/kg/dia, não altera o número de leucócitos totais no sangue periférico nos dias 7, 14 e 21 após o início do tratamento. Esses resultados são independentes dos animais terem sido imunizados ou não com uma dose baixa de ovalbumina (OVA) solúvel ou emulsificada com adjuvante incompleto de Freund (IFA).
30
Figura 3: Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o número de leucócitos no
sangue periférico.
4.3 Ação do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre as subpopulações de leucócitos no sangue periférico
Os resultados apresentados nas figuras 4A e 4B mostram que o extrato hidroetanólico de L. pacari, na dose de 200 mg/kg/dia, não altera a percentagem das subpopulações de leucócitos no sangue periférico de camundongos C57BL/6 adultos, nos dias 7, 14 e 21 após o início do tratamento. Esses resultados são independentes dos animais terem sido imunizados ou não com uma dose baixa de OVA solúvel ou emulsificada com IFA.
31
Figura 4: Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre as subpopulações de
neutrófilos e linfócitos no sangue periférico.
B A
32
4.4 Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o número de esplenócitos
Os dados expressos na figura 5 mostram o extrato hidroetanólico de L. pacari, na dose de 200 mg/kg/dia, não altera o número de células esplênicas de camundongos. Esses resultados são independentes dos animais terem sido imunizados ou não com uma dose baixa de OVA solúvel ou emulsificada com IFA.
Figura 5: Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o número de esplenócitos
4.5 Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o peso do baço
O extrato hidroetanólico de L. pacari, na dose de 200 mg/kg/dia, não altera estatisticamente o peso do baço de camundongos C57BL/6 adultos, independentes dos
33
animais terem sido imunizados ou não com uma dose baixa de OVA solúvel ou emulsificada com IFA (Figura 6).
Figura 6: Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o peso do baço. Após
21 dias de tratamento, administrados por via oral, com o extrato hidroetanólico de L. pacari os animais foram sacrificados, seus baços foram retirados e pesados imediatamente. Os dados estão expressos como a média ±desvio padrão.
4.6 Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o peso do fígado
O peso do fígado dos animais tratados com o extrato hidroetanólico de L. pacari, na dose de 200 mg/kg/dia, teve uma redução significantemente (p = 0,015) comparado ao peso do fígado dos camundongos dos demais grupos de animais (Figura 7).
34
Figura 7: Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre o peso do fígado de camundongos. Após 21 de tratamento administrados por via oral, com o extrato
hidroetanólico de L. pacari os animais foram sacrificados, o fígado de cada animal foi retirado e pesado imediatamente. Os dados estão expressos como média ±desvio padrão
4.7 Efeito do extrato hidroetanólico de L. pacari sobre a produção de IgG1 e IgG2a
No 7o dia após a imunização, não foi detectada IgG1 anti-OVA no soro dos animais imunizados com OVA solúvel ou emulsificada com IFA e tratados ou não com o extrato hidroetanólico de L. pacari (dados não mostrados). Como seria esperado, já que o adjuvante incompleto de Freund estimula a produção de IgG1, no 14o(Figura 8A) e no 21o(Figura 8B), dia após a imunização inicial, os animais imunizados com OVA emulsificada com IFA produziram IgG1 em níveis significantemente mais elevados do que os camundongos sensibilizados com OVA solúvel. Esses resultados foram
35
independentes dos animais terem sido tratados ou não com o extrato hidroetanólico de L. pacari. Os anticorpos da subclasse IgG2a não foram detectados nos soros dos animais imunizados com OVA solúvel ou emulsificada com IFA durante todo o período do experimento (dados não mostrados).
Figura 8: Efeito da L. pacari sobre a produção de IgG1 anti-OVA. Camundongos
C57BL/6 foram imunizados com OVA solúvel ou emulsificada com IFA e tratados ou não com o extrato hidroetanólico de L. pacari. IgG1 específica para OVA foi dosada por ELISA, no soro de cada animal individualmente, diluído 400 vezes, apresentando no 14o (A) e no 21o(B) dia após a imunização níveis significativamente mais elevados de IgG1 nos animais imunizados com esse antígeno emulsificado com IFA comparados àqueles dos camundongos sensibilizados com OVA solúvel. Os dados são mostrados como média ± desvio padrão. * p = 0,0567 e ** p = 0,0001 em relação aos valores de IgG1
A
36
anti-OVA verificados nos animais imunizados com OVA solúvel e tratados ou não com o extrato hidroetanólico de L. pacari.
5 DISCUSSÃO
Os resultados obtidos a partir da contagem de leucócitos totais e subpopulações dessas células no sangue periférico de camundongos C57BL/6 imunizados com OVA solúvel ou OVA/IFA mostram que não houve diferenças estatisticamente significantes do número dessas células, comparando-se os animais tratados com aqueles não tratados com o extrato hidroetanólico de L. pacari. Considerando as subpopulações de leucócitos no sangue periférico, não houve diferenças estatísticas da quantidade dessas células no sangue periférico dos animais sensibilizados com OVA solúvel ou emulsificada com IFA comparando-se os animais que receberam o extrato hidroetanólico de L. pacari com aqueles que não foram tratados com o respectivo extrato. Esses resultados corroboram os dados de um outro estudo pré-clínco, no qual foi mostrado que o extrato metanólico da entrecasca da L. pacari não alterou nos parâmetros anátomo-macroscópicos, hematológicos e bioquímicos41.
Já foi também mostrado que o extrato metanólico de L. pacari não altera os valores normais do hemograma, lipidograma nem das enzimas hepáticas e renais de pacientes humanos51. Os dados do presente trabalho estão de acordo com resultados pré-clínicos e pré-clínicos mostrando que o extrato metanólico de L. pacari não altera os níveis de leucócitos totais e subpopulações destas células no sangue periférico41,50. Em conjunto, esses resultados associados aos do presente estudo demonstram, pelo menos quanto aos leucócitos do sangue periférico a falta de efeitos tóxicos pelo uso de L. pacari para fins medicinais.
37
Sob as mesmas condições experimentais, não se observa diferença estatística do número de células esplênicas entre os animais que receberam o extrato da L. pacari e aqueles que não o receberam, quando foram avaliados no final do tratamento. Considerando os resultados do presente trabalho e aqueles da literatura mostrando que extratos da entrecasca do caule da L. pacari não alteram significativamente a quantidade de células maduras do sistema imune, pode-se sugerir que a L. pacari é uma planta medicinal que em sendo usada na forma de macerado aquoso, não deve alterar quantitativamente as células maduras do sistema imune. Vale ressaltar que o extrato hidroetanólico usado no presente estudo não continha esteróides, pelo menos em quantidade detectável pela reação de Lieberman-Buchard usada na análise fitoquímica. Os resultados da falta de efeitos imunossupressores do extrato hidroetanólico de L. pacari, usado nesse trabalho pode estar associada à ausência de esteróides no extrato usado. Pode-se também postular que o efeito anti-inflamatório da L. pacari não está associado à redução do número de células maduras do sistema imune.
Solon et al. (2000)49 isolaram do extrato metanólico da casca do caule de L. pacari o ácido elágico e demonstraram a atividade antioxidante deste metabólito. A amplitude dos efeitos biológicos benéficos do ácido elágico faz da casca de L. pacari uma importante fonte medicinal. Mesmo havendo inúmeras e complexas substâncias químicas nessa droga vegetal, a comparação das atividades terapêuticas do ácido elágico com o uso medicamentoso da casca de L. pacari sugerem a atuação dessa substância como principal composto químico ativo.
O baço não apresenta modificação quanto ao peso, porém o fígado dos animais que receberam somente o extrato hidroetanólico da L. pacari apresentou redução significativa do peso, quando comparado ao dos animais que não receberam o extrato, independente de terem sido ou não imunizados com OVA solúvel ou emulsificada com IFA. Até onde se sabe, não havia na literatura dados mostrando que extratos da L. pacari
38
reduzem significantemente o peso do fígado de camundongos. No presente estudo, não foi esclarecido o mecanismo pelo qual o extrato hidroetanólico de L. pacari reduz significantemente o peso do fígado de camundongos, necessitando neste caso de novos estudos sobre uma possível hepatotoxicidade da L. pacari.
Em relação aos níveis de IgG1 anti-OVA determinados no soro dos animais imunizados com esse antígeno solúvel ou emulsificado com IFA, aos resultados da resposta primária, 7o dia após a imunização inicial, mostram que o extrato hidroetanólico de L. pacari, não altera a cinética de produção dessa subclasse de IgG visto que, independente dos animais terem sido tratados ou não com L. pacari, não houve alteração dos níveis de IgG1 anti-OVA comparados àqueles dos camundongos não imunizados. A partir desses dados pode-se concluir que a L. pacari não altera a cinética da resposta de linfócitos B e T maduros que estão respondendo à OVA, visto que a IgG1 específica é normalmente produzida por camundongos somente na resposta secundária61,62,63A hipótese de que a L. pacari não altera a cinética da resposta humoral contra um Ag T-dependente é reforçada pelos resultados mostrando que, no 14º e 21º dia após a imunização inicial, os animais imunizados com OVA solúvel independente de terem sido tratados ou não com L. pacari, não apresentaram aumento significante dos níveis de IgG1 anti-OVA. Como seria esperado, visto que o IFA é um adjuvante que estimula a produção de anticorpos64,65,66,67 os níveis de IgG1 anti-OVA verificados no 14o e no 21o dia após a imunização inicial, os animais imunizados com OVA emulsificada com IFA são significantemente mais elevados comparados àqueles dos camundongos sensibilizados com OVA solúvel. Embora já tenhamos mostrado que o extrato etanólico de L. pacari estimula a produção de Ig anti-OVA em camundongos Swiss68, naquele estudo, além dos animais usados serem “outbred” a dose do antígeno era alta. Assim, sendo, ainda não se pode afirmar que os resultados do presente estudo contradizem ao que havia sido previamente mostrado por nosso grupo. A confirmação ou não da ação adjuvante de extratos hidrofílicos de L. pacari requer um estudo usando
39
diferentes doses do mesmo antígeno e camundongos da mesma linhagem. A partir dos resultados, pode-se apenas concluir que o extrato hidroetanólico de L. pacari não estimula a produção de IgG1, quando camundongos C57BL/6 são imunizados com uma baixa dose de OVA solúvel ou emulsificada com IFA.
6 CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que o extrato hidroetanólico de L. pacari, na dose de 200 mg/kg/dia, não altera o número de leucócitos totais e subpopulações dessas células no sangue periférico nem a quantidade de esplenócitos. Pode-se também concluir que, sob as mesmas condições experimentais, o extrato hidroetanólico de L. pacari, não altera a cinética nem os níveis de IgG1 anti-OVA, sugerindo que a L. pacari não tem efeitos significantes sobre as células maduras do sistema imune, inclusive aquelas que estão respondendo à ovalbumina.
Neste caso o presente estudo contribui e reforça dados científicos de outros estudos, que a L. pacari tradicionalmente usada pela população tradicional matogrossense para fins medicinais, não apresenta efeitos adversos de toxicidade.
40
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Summer J. The natural history of medicinal plants. Portland, Oregon: Timber Press; 2000. p.16.
2. Rates SMK. Plants as source of drugs. Elsevier Toxicon 2001 Apr;39:603-13.
3. Hamburger M, Hostettmann K. Bioactivity in plants: the link between phytochemistry and medicine. Phytochem, New York, v.30, n.12, p.3864-74, 1991.
4. Braz-Filho R. Importância, interdisciplinaridade, dificuldades e perspectivas do estudo químico de produtos naturais. In: Morais SM, Braz-Filho R. Produtos naturais: estudos químicos e biológicos. Fortaleza. ed UECE, 2007. p.13-45.
5. Martins ER, Castro DM, Castellani DC, Dias JE. Plantas medicinais. Viçosa: UFV; 2000.
6. Gilani AH, Rahmanb A. Trends in ethnopharmacology. J Ethnopharmac. 2005 Aug;100:43-9.
7.Berg MEVD. Plantas medicinais na Amazônia: contribuição ao seu conhecimento sistemático; 2 ed. Belém Rev. E aum-Belém: Museu Paraense Emílio Goeldi, 1993.
8. Lemos, TGL, Matos FJA, Alencar JW, Craveiro AA, Clark AM, Mcchesney JD. Antimicrobial activity of sessential oils of Brazilian plants. Phytotherapy Research1990 Apr;4:82-4.
9. Shapiro S, Meier A, Guggenheim B. The antimicrobial activity of essential oils and essential components towards oral bacteria. Oral Microbiol Immunol.1994 Aug;9(4):202-8.
41
10. Kalyani GA. In vitro antihelmintic activity of essential oil from the fruits of Sonthoxylum limonella. Fitoterapia. 1989;60:160-2
11. Lacoste E, Chaumont JP, Mandim D, Plumel MM, Matos FJ. Antiseptic properties of essential oil of Lippia sidoides Cham. Aplication to the cutaneous microflora. Ann Pharm Fr. 1996;54(5):228-30.
12. Morais SM. Preparação e avaliação clínica de um novo anti-séptico bucal à base de óleo essencial de Lippia sidoides Cham. Encontro de Pesquisadores e V Encontro de Iniciação Científica da UECE, Fortaleza, 1996. p.441.
13. Martin S, Padilia E, Ocete MA, Galvez J, Jiménez J, Zarzuelo A. Antiinflammatory activity of the essential oil of Bupleurum fruticescens. Planta Med. 1993 Dec;59(6):533-6.
14. Hutter JAM, Salman WB, Stavinoha N, Satsangi RF, Williams RT, Streeper, Weintraub ST. Antiinflammatory C-glucosyl chromone from Aloe barbadensis. J Nat Prod. 1996 May;59(5):541-3.
15. Vasquez B, Avila G, Segura D, Escalante B. Antiinflammatory activity of extracts from Aloe vera gel. J of Ethnopharmacology. 1996 Dec;(55):69-75.
16. Sigler NA, Vaillant AL, Acosta MR. Efecto immunomodulador del Aloe barbadensis en el paciente quirúrgico grave. Veritas Cuba Medica Milenar. 1997;(27):87-93.
17. Mathew S, Kuttan G. Immunmodulatory and antitumour activities of Tinospora cordifolia. Fitoterapia. 1999;(70):35-43.
18. Kang BY, Chung SW, Kim SH, Ryu SY, Kim TS. Inhibition of interleukin-12 and interferon- production in immune cells by tanshinones from Salvia miltiorrhiza. Immunopharmacology. 2000 Sep;49(3):355-61.
42
19. Abuharfeil NM, Maraqa A, Kleist SV. Augmentation of natural killer cell activity in vitro against tumor cells by wild plants from Jordan. J Ethnopharmacol.2000 Jul;71(1-2):55-63.
20. Zvetkova E, Wirleitner B, Tram NTN, Schennach H, Fuchs D. Aqueous extracts of Crinum latifolium (L.) and Camélia sinensis show immunomodulatory properties in human peripheral blood mononuclear cells. Int Immunopharmacol. 2001 Nov;1(12):2143-50.
21. Yamaguchi, H. Immunomodulation by medicinal plants. Adv Exp Med Biol. 1992;319:287-97.
22. Holetz FB, Pessini GL, Sanches NR, Cortez DAG, Nakamura CV, Dias Filho BP. Screening of some plants used in the brazilian folk medicine for the treatment of infectious diseases. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002 Oct;97(7):1027-31.
23. Simões CMO, Mentz LA, Schenkel EP, Irgang BE, Sterhmann Júnior. Plantas da Medicina Popular no Rio Grande do Sul. 5. Ed. Porto Alegre: UFRGS; 1998.
24. Martins ER, Castro DM, Castellani DC. et al. Plantas medicinais.Viçosa, MG: UFV, 2003.
25. Gilani AH, Rahman A. Trends in ethnopharmacology. J Ethnopharmac 2005; 100:43-9
26. Tonello VM. Estrutura de Populações de Lafoensia Pacari St. Hil. e Dados Etnobotânicos e Fenológicos em Nossa Senhora do Livramento-MT .Dissertação (Mestrado em Ecologia e Conservação da Biodiversidade)- Instituto de Biociências. Cuiabá. Universidade Federal de Mato Grosso; 1997.
27. Carvalho PER. Comparação de espécies nativas, em plantio em linhas em capoeira, na região de Irati-PR – resultados aos sete anos. Bol. Pesq. Fl,Colombo. Dez;1982(5):53-68.
43
28. Guarim-Neto G. Plantas utilizadas na medicina popular do estado de Mato Grosso. Brasília: CNPq Assessoria Editorial; 1987.
29. Lorenzi H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. Nova Odessa: Plantarum; 1998.
30. Barreira S, Botelho AS, Scolforo Júnior, Mello JM. Efeito de diferentes intensidades de corte seletivo sobre a regeneração natural de cerrado. Cerne, Lavras. 2000;6:40-51.
31. Barroso G M. Sistemática de angiospermas do Brasil. UFV, Viçosa. 1991;(2):107-12.
32. Judd WS, CS. Campbell EA. Kellogg PF. Stevens. Plant systematics - a phylogenetic approach, Sinauer, Sunderland; 1999:30-2.
33. Solon S, Lopes L, Teixeira SP Júnior, Scmeda-Hirschmann G. Free radical scavenging activity of Lafoensia pacari. J. Ethnopharmacol. 2000,72:173-8.
34. Hoehne FC. Plantas e substâncias vegetais tóxicas e medicinais.1939; 206-9.
35. Arruda JB. Utilização popular de plantas medicinais no município de Rio Branco, Estado de Mato Grosso. Cuiabá. Monografia (Especialização em Ecologia e Conservação da Biodiversidade) - Departamento de Botânica. Cuiabá. Universidade Federal de Mato Grosso; 1994.
36. De La Cruz MGF. Plantas medicinais utilizadas por raizeiros: uma abordagem etnobotânica no contexto da saúde e doença. Dissertação (Mestrado em Saúde e Ambiente) - Instituto de Saúde Coletiva. Cuiabá. Universidade Federal de Mato Grosso; 1997.
37. Somavilha NS. Utilização de plantas medicinais por uma comunidade garimpeira do sudoeste Mato Grossense, Alto Poxoréu - MT. Dissertação (Mestrado em Saúde e Ambiente) - Instituto de Saúde da Coletiva. Cuiabá. Universidade Federal de Mato Grosso; 1998.
44
38. Gonçalves MIA. Plantas usadas como medicinais pelos moradores da área urbana do município de Santo Antônio do Leverger – Mato Grosso. Tese (Doutorado em Saúde e Ambiente) – Instituto de Saúde Coletiva. Cuiabá. Universidade Federal de Mato Grosso; 1999.
39. Resende UM, Nunes GP, Silva MF, Siqueira JM. Plantas medicinais comercializadas por raizeiros no centro de Campo Grande, Mato Grosso do Sul. Rev. Bras. Farmacognosia, Maringá-PR. 2003;13(12):83-92.
40. Sartori NT. Triagem de plantas medicinais popularmente utilizadas como antiúlcera em Mato Grosso e avaliação do efeito antiúlcera da fração diclorometânica (DCM2) de Calophyllum brasiliense Camb. (guanandi). Dissertação (Mestrado em Saude e Ambiente) - Faculdade de Ciências Médicas. Cuiabá. Universidade Federal de Mato Grosso; 1997.
41.Tamashiro-Filho P. Validação pré-clínica da atividade antiúlcera do extrato bruto metanólico de Lafoensia pacari St.Hil. (Mangava brava). Dissertação (Mestrado em Saúde e Ambiente) - Instituto de Saúde Coletiva. Cuiabá. Universidade Federal de Mato Grosso; 1999.
42. Murakami S, Isobe Y, Higima H, Nagai H, Muramatu M, Otomo S. Inibition of gastric H+K+ ATPase and acid secretion by ellagic acid. Planta med. 1991;57(4):305-8.
43. Iino T, Nakahara, K. MW, Kiso Y, Ogawa Y, Kato S, Takeuchi K. Less damaging effect of whisky in rat stomachs in comparison with purê ethanol. Role of ellagic acid, the nonalcoholic component. Digestion.2001;64(4):214-21.
44. Iino T, Tashima K, Umeda M, Ogawa Y, Takeeda M, Takata K, Takeuchi K. Effect of ellagic acido n gastric damage induced in ischemic rat stomachs following ammonia or reperfusion. Life Sci. 2002 Jan 25;70(10):1139-50.
45. Chung JG. Inhibitory actions of ellagic acido n growth and arylamine N-acetyltransferase activity in strins of Helicobacter pylori from peptic ulcer patients. Micróbios. 1998;93(375):115-127
45
46. Solon S. Alguns aspectos químico-farmacológicos da entrecasca do caule de Lafoensiapacari St. Hil (mangava-brava, Lythraceae) Dissertação (Mestrado em Saúde e Ambiente)- Instituto de Saúde Coletiva. Cuiabá. Universidade Federal de Mato Grosso; 1999.
47. Honda NK et al. Estudo químico de plantas de Mato Grosso do Sul I: triagem fitoquímica. Revista Científica Cultural. 1990;5:37-46.
48.Souza Júnior PTO, Rudolf S. Estudo químico preliminar dos constituintes farmacologicamente ativos da casca do caule da Lafoensia pacari St. Hil. (mangava brava). In:Encontro de Iniciação Científica da UFMT, 4., Cuiabá, 1996. Resumos. Cuiabá: UFMT. MCT/CNPq, 1996. p. 65.
49. Solon S, Lopes L, Souza Júnior PT, Schmeda-Hirschmann G. Free radical scavenging activity of Lafoensia pacai. J Ethnopharmacol. 2000 Sep;72(1-2):173-8.
50. Mota-Menezes V, Atallah NA, Lapa AJ, Catapani WR. Assessing the therapeutic use of Lafoensia pacari St. Hil. extract (mangavabrava) in the eradication of Helicobacter pylori: double-blind randomized clinical trial. Helicobacter. Helicobacter. 2006 Jun;11(3):188-95.
51. Pires LL, Lima MRF, Araújo CWG, Porfírio Z. Avaliação da atividade antimicrobiana de frações de Lafoensia pacari Saint. Hil – LYTHRACEAE em linhagens de micro-organimos patogênicos humanos. In: Jornada Científica de Farmácia 1, Maceió. Resumos: UFAL, 2003, p.11.
52. Melo-Filho GC, Lima MRF, Porfírio Z. Estudo da atividade antibacteriana de extrato hidroalcoólico de Lafoensia pacari Saint. Hil contra bactérias multiresistentes de origem hospitalar. In: Jornada Científica de Farmácia 1, Maceió. Resumos: UFAL, 2003. p.15.
53. Albuquerque DA, Juliani JM, Santos JA, Hosida PY, Borges S, Borralho CT. Efeito do extrato etanólico de Lafoensia pacari sobre a peritonite aguda em camundongos. 3ª Reunião Especial da SBPC, Florianópolis - SC, 1996. p.518.
54. Albuquerque DA, Lopes L. Modulation of Delayed-Type Hypersensitivity by Lafoensia pacari St. Hil. Boll. Chim. Farmacêutico. 1999;2(138):120.
46
55. Albuquerque DA, Hosida PY, Juliani JM, Borralho CT, Borges S, Santos JA. Efeito do Extrato Etanólico de Lafoensia pacari sobre a Produção de Anticorpos in vivo. 3ª Reunião Especial da SBPC, Florianópolis,1996. p.518.
56. Rogério AP, Sá-Nunes A, Albuquerque DA, Anibal FF, Medeiros AI, Machado ER et al. Lafoensia pacari extract inhibits IL-5 production in toxocariasis. Parasite
Immunol.2003 Jul;25(7):393-400.
57.Rogerio AP, Numnes AS, Albuquerque DA, Anibal FF, Medeiros AI, Souza AO, Prado Jr JC, Faccioli LH. Lafoensia pacari extract inhibits IL-5 production in toxocariasis. Parasite Immunol. 2003 Jul;25(7):393-400.
58. Rogerio AP, Sá-Nunes A, Albuquerque DA, Soares EG, Faccioli LH. Anti-eosinophilic effect of Lafoensia pacari in toxocariasis. Phytomedicine. 2008 May;15(5):348-57.
59. Matos FJA. Introdução a fitoquímica experimental. Fortaleza: Ed UFC; 2009.
60. Moncada C. et al. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of immunological methods. 1993;162:133-40.
61. Buus SS, Colon C, Smith JH, Freed C, Miles HM Grey. Interaction between a processed ovalbumin peptide and Ia molecules. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 83:3968-74, 1986.
62.Renz HK, Bradley GL, Larsen C, McCall EW Gelfand. Comparasion of the
allergenicity of ovalbumin and ovalbumin peptide 323-339: differential expansion of V β –expressing T cell populations. J. Immunol. 151:7206-13, 1993.
63.Djurup R. The subclass and nature of the IgG antibody response in patients undergoing allergen specific immunotherapy. Allergy. 40:469-86, 1985.
64. Freund J, Casals J, Hosmer EP, sensitization and antibody formation after injection of tubercle bacilli and paraffin oil. Proc. Soc. Exp. Biol.Med, 37:509-16, 1937.
47
65.Freund J The effect of paraffin oil and mycobacteria on antibody formation and sensitization. Am. J. Clin. Phatol, 21:645-56, 1951.
66.Bomford R. The comparative selectivity of adjuvants for humoral and cell-mediated immunity. I effect on the antibody response to bovine serum albumin and sheep red blood cells of Freund´s incomplete and complete adjuvants, alhydrogel,
Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis, muramyl dipeptide and saponin. Clin. Exp. Immunol, 39:426-34, 1980.
67.Sanchez V, Ionescu MI, Dreesman GR, Kramp W, Siz HR, Hollinger FB, Melnick JL. Humoral and cellular immunity to hepatitis B virus derived antigens: comparative activity of Freund´s complete adjuvant, allumen and liposomes. Infect. Immunity, 30:728-33, 1980.
68.Albuquerque DA, Oliveira SS. Atividades do extrato etanólico de Lafoensia pacari sobre a hipersensibilidade tardia.VII Encontro de Iniciação Científica, CNPq/UFMT, Cuiabá-MT, 1999, p.259.
48
8 APÊNDICE 1
Lafoensia pacari St. Hil. (Lythraceae)
Local de coleta: Rodovia BR 070, Lado direito do loteamento Nova Esperança, município de Cuiabá-MT, coordenadas 15°40'08.34''S 55°57'12.75''O elevação de 190 m (Google Earth, acesso em 05 de junho de 2012).
Data da coleta: 23/06/2011 Exsicata n°: 39560
Identificador: Prof. Dr. Germano Guarim Neto
Herbário Central da Universidade Federal de Mato Grosso Foto: Luiz Carlos de Oliveira Borges – SECOMM/CJI/UFMT
49
