Efeito da APDC na inativação de E coli em purê de abóbora Um procedimento de seleção foi inicialmente realizado para

determinar que variáveis e níveis destas variáveis resultariam em uma melhor condição experimental para inativação de E. coli em purê de abóbora, como apresentado na Tabela 4 (seção 4.5), que apresenta os resultados em função da pressão e da proporção de volume entre purê de abóbora e solvente através de um delineamento 2² com triplicata no ponto central. Nesta mesma Tabela 4 (seção 4.5), os resultados mostram uma tendência de maior redução no número de micro-organismos conforme a pressão aumenta, em acordo com o relatado também por Erkmen (2001a) e Silva et al. (2013), que ressaltaram a importância de taxas de ciclos de pressão e despressurização na inativação de E. coli. Ainda na Tabela 5 da seção 4.5, pode ser observada a mesma tendência quando o volume de proporção entre soluto e solvente são equivalentes. A melhor condição experimental escolhida para realizar a cinética é a de 275 bar e razão 1:1 (m/m), que obtiveram uma redução de 2,04 ciclos log em purê de abóbora. Soares et al. (2013) relataram que um aumento da proporção de CO2 no sistema favorece a inativação de micro-organismos. Estes autores citam Erkmen (2001a, 2001b, 2001c), que explica que o aumento da concentração de CO2 permite uma melhor difusão através das membranas celulares, facilitando o rompimento das células durante a despressurização, quando a expansão do CO2 ocorre, levando à melhoria da eficiência da inativação. Em concordância, Yuk et al. (2010) verificaram que o efeito da APDC de modo contínuo (vazão de amostra de 1 L min-1) na inativação de E. coli K12 em sidra foi determinada como uma função da concentração do CO2 e temperatura, ou seja, o grau de inativação microbiana aumentou significativamente (p < 0,05) com o aumento da concentração de CO2 em cada temperatura de aquecimento na saída.

Na Tabela 13 e na Figura 33, pode ser observada uma tendência de maior redução microbiana à medida que o tempo de processo

aumenta. Cada ponto do processo esteve sob as mesmas condições de pressão e temperatura durante todo o processamento via APDC.

Tabela 14 - Efeito do tratamento via APDC sobre E. coli em purê de abóbora a 275 bar de pressão e razão (m CO2 / m purê de abóbora) 1:1 em função do tempo de tratamento (t). Resultados são médias baseadas em dados de três experimentos a 32 °C e desvios padrão são apresentados com o Teste de Tukey (p < 0,05).

Experimento t (h) - log (N/N0) 1 1 1,101 ± 0,077 c 2 2 1,377 ± 0,194 c 3 3 1,701 ± 0,060 c 4 4 2,663 ± 0,093 b 5 5 2,529 ± 0,450 b 6 6 3,054 ± 0,130ab 7 8 3,186 ± 0,077 a

* Valores na mesma coluna com diferentes letras sobrescritas possuem diferença significativa (p < 0,05) de acordo com o teste de Tukey

Figura 33 - Efeito do tratamento por APDC sobre a inativação de E.

coli em purê de abóbora sob pressão de 275 bar, 32 °C e razão (v CO2 / v purê de abóbora) 1:1 em função do tempo.

A Figura 33 ilustra os dados experimentais e preditos pelo modelo de primeira ordem para 275 bar. Pode-se observar que a inativação da E. coli com dióxido de carbono supercrítico segue uma

-4 -3 -2 -1 0 0 2 4 6 8 10

log

(N/N

)

t (h)

cinética de primeira ordem, confirmada pelo bom ajuste dos dados experimentais. Como proposto por Silva et al. (2013), o efeito da pressão na inativação de E. coli com CO2 supercrítico é dado pela Equação 16.

onde

é a contagem microbiana (N e N0) obtidas no tempo

inicial (t0) e no tempo final (t) e k é uma constante de inativação, dada

pela linearização da Equação 16. O valor da constante da inativação (k) depende do tipo de micro-organismo, do meio, da pressão e da temperatura.

O coeficiente de correlação (R²) foi de 0,90 nesta etapa, semelhante ao obtido por Silva et al. (2013). Estes autores relataram que a constante de inativação aumenta com a pressão, indicando que altas pressões aceleram a taxa de inativação enquanto o tempo de redução decimal (D) diminui com o aumento de pressão, o que é esperado.

Nesta etapa com purê de abóbora, k a 275 bar foi de 0,018 min-1 e D foi de 125,53 min. O valor de k foi menor e, consequentemente, o D foi maior do que o encontrado por Silva et al. (2013). Estes valores podem ser explicados pela diferença entre as matrizes usadas para APDC. Pela complexidade química do purê de abóbora, talvez somente pressões elevadas não sejam suficientes para atingir uma alta taxa de inativação e assim, é necessário um estudo da variação de outros parâmetros. Como ilustrado na Figura 33 e na Tabela 13, a redução máxima atingida pela APDC no purê de abóbora foi de 3,19 ± 0,08 ciclos log após 8 h de processo.

A contagem de E. coli diminui quando o tempo de exposição ao processo aumenta, mas não atinge total inativação. Este comportamento está em acordo com diversas publicações (KARAMAN et al., 2001; SPILIMBERGO et al., 2003; LIAO et al., 2007; SILVA et al., 2013; SOARES et al., 2013). Ballestra et al. (1996) relataram que um pouco mais de 3 ciclos log de redução de E. coli em caldo TSB (soja tripticaseína) foram obtidos após 60 minutos a 120 bar e 45 °C. Os fatores envolvidos na inativação por APDC de acordo com Ortuño et al. (2012) são: nível de pressurização, acidificação, extração de substâncias da célula e disfunções na permeabilidade da membrana.

De acordo com estes resultados, pode ser deduzido que o abaixamento do pH é uma das causas da inativação microbiana por APDC (BALLESTRA et al., 1996; ERKMEN, 2001a, 2001b, 2001c; KIM et al., 2007; ORTUÑO et al., 2012). A dissolução do CO2 na suspensão, que resulta em formação de ácido carbônico, pode causar uma mudança no equilíbrio em direção a geração de mais íon hidretos, uma vez que o ácido carbônico é dissociado (KIM et al., 2007; ORTUÑO et al., 2012). Também tem sido sugerido por Lin et al. (1994), Ballestra et al. (1996) e Erkmen (2001a, 2001b, 2001c) que CO2 em altas pressões pode extrair constituintes vitais, incluindo fosfolipídeos e componentes hidrofóbicos das membranas celulares, o que causaria a inativação microbiana com a ruptura das paredes celulares. Garcia-González et al. (2010) concluíram que o papel do decréscimo do pH no meio suspenso em inativação por APDC não deve ser negligenciado devido à sua contribuição para causar mudanças conformacionais no DNA.

A penetração do CO2 através da célula microbiana pode ser o passo controlador na inativação e a extração dos conteúdos extracelulares é um possível mecanismo de inativação. A desnaturação de proteína, inativação enzimática e mudanças nas fases lipídicas podem perturbar a morfologia celular, mecanismos genéticos e reações bioquímicas (HAAS et al., 1989; LIN et al., 1992a, 1992b; BALLESTRA et al., 1996; ERKMEN 2001a, 2001b, 2001c; KARAMAN et al., 2001; LIAO et al., 2007; GARCIA-GONZÁLEZ et al., 2007).

Além do efeito da pressão e da concentração do CO2, diversos estudos sugerem que a elevação de temperatura também melhora o efeito letal do CO2 sobre os micro-organismos (LIN et al., 1992a, 1992b; BALLESTRA et al., 1996; ERKMEN, 2001a, 2001b, 2001c; SPILIMBERGO et al., 2003; YUK et al., 2010). Hong et al. (1997) concluíram que altas temperaturas podem aumentar a difusividade e poderiam facilitar que o CO2 penetre na membrana da bactéria pelo aumento na fluidez.

Kim et al. (2007) relataram que um período de 20 minutos foi suficiente para inativar completamente 108 UFC mL-1 de E. coli em caldo via APDC com pressões variando entre 80 a 150 bar a 40 °C. A 35 °C, 120 bar foram suficientes para obter completa inativação. Com o aumento da temperatura de 35 para 40 °C e de 40 para 45 °C, o tempo para completa inativação diminui de 30 para 20 minutos e de 20 para 15 minutos, respectivamente, sendo estimado pela modelagem dos dados experimentais.

Erkmen (2001a) mostrou que os efeitos da inativação do CO2 foram melhorados com o aumento da temperatura de 20 para 40 °C, demonstrando que a temperatura tem uma relação próxima com as características de transferência de massa do CO2 estimulando a fluidez da membrana celular para facilitar a sua penetração, também em concordância com o que relatou Hong et al. (1997). Em suco de cenoura com pH de 6,80, a maior inativação atingida via APDC foi de 7,37 ciclos log em 60 min a 37 °C e 30 minutos a 45 °C, todos em 5 MPa (BI et al., 2011).

García-Gonzalez et al. (2010) afirmam que o aumento da temperatura e da pressão causam altos níveis de inativação de micro- organismos, como aconteceu em seu trabalho com E. coli. Yuk et al. (2010) mostraram que uma elevação significante da temperatura (p < 0,05) melhorou o efeito bactericida via APDC em modo contínuo sobre a E. coli K12 em constantes níveis de CO2.

Ferrentino et al. (2009), quando avaliaram a inativação da microbiota natural microbiana em suco de maçã, observaram que era necessário aumentar a temperatura até 60 °C por 40 minutos para atingir 5 ciclos log de inativação microbiana via APDC. Um aumento na pressão de 70 para 160 bar a 35 °C não apresentou uma grande melhoria na redução microbiana (2,5 ciclos log em 140 min). Estes autores concluíram que a temperatura de 35 °C não foi capaz de produzir uma redução log relevante embora em pressões de 160 bar, que foi a maior pressão testada no referido trabalho.

A insuficiente redução microbiana pode também estar relacionada ao aumento de TSS e ART. Os dados indicam que existe uma alta disponibilidade de nutrientes para a E. coli. É observado que as mudanças físico-químicas podem ser correlacionadas melhor com a resistência/sensibilidade dos micro-organismos em que pH e acidez ajudam na redução da contagem, mas não o suficiente pela disponibilidade de nutrientes que o processo acarreta. Adicionalmente, a natureza dos sólidos solúveis e suspensos nesta matriz pode ter exercido efeito físico protetor sobre os micro-organismos.

A contagem inicial de E. coli pode também afetar os resultados. Quando o número inicial de micro-organismos é alto, isto pode ser atribuído a aglutinação (clumping) de células como um resultado do aumento da hidrofobicidade durante o processo. A taxa de formação de aglutinações (clumps) é proporcional ao número inicial. A aglutinação de micro-organismos dificulta a inativação porque a aglutinação forma uma barreira protetora (FURUKAWA, 2002; LIAO et al., 2007). Além disso, alguns estudos têm mostrado que a E. coli é capaz de liberar

algumas substâncias protetoras quando estão em alta densidade através do quórum-sensing, o que talvez possa ter ocorrido neste trabalho (SWIFT et al., 2001; PILLAI et al., 2006; AMMOR et al., 2008; SCHERTZE et al., 2009; BAI et al., 2011).

5.3.3 Microscopia ótica

A observação dos efeitos do tratamento do purê de abóbora por APDC sobre a microestrutura desta matriz podem contribuir para o conhecimento deste processo. As Figuras 34 – 38 ilustram as imagens obtidas em microscopia ótica com 400 vezes de aumento (400 ×) da abóbora como matéria prima, com detalhes dos elementos de vaso (xilema) (Figura 34); células de parênquima com amiloplastos intactos na matéria prima (Figura 35); purê de abóbora pressurizado (Figura 36); pequenas deformações nas paredes (A) e ruptura dos grânulos de amido (B); purê de abóbora imediatamente após cozimento (Figura 37) onde a seta em (C) destaca o tubo crivado por onde passa a seiva (floema); e o purê de abóbora estéril (Figura 38).

Figura 34 - Células do parênquima com amiloplastos intactos na matéria prima íntegra (abóbora in natura) aumentada 400 ×. Seta: elementos de vasos (xilema).

Figura 35 - (A), (B), (C), (D), (E) e (F): Células do parênquima com amiloplastos intactos na matéria prima íntegra (abóbora in natura) aumentada 400 ×.

Figura 36 - Purê de abóbora após processo de APDC aumentado 400 ×: pequenas deformações nas paredes (A) e ruptura dos grânulos de amido (B).

Figura 37 - (A), (B), (C), (D) e (E): purê de abóbora imediatamente após cozimento, aumentado 400 ×. Seta em (C): elemento de tubo crivado (floema).

Figura 38 - (A) e (B): purê de abóbora esterilizado aumentado 400 ×.

Poucas mudanças histológicas significativas nas células da abóbora foram observadas. Comparando os tratamentos à abóbora in

natura, parece que o tratamento preservou a estrutura celular e a

integridade da parede celular. O processamento só danificou o amido, o que era esperado porque o produto é decorrente de um cozimento, primeiramente. As amostras sujeitas à alta pressão apresentaram algumas poucas descontinuidades nas paredes celulares, mas rompimentos não foram observados. Não há dados na literatura apresentando as mudanças de um purê em geral, através de um tratamento por alta pressão. A maioria das análises microscópicas tem por objetivo observar os danos nas células dos micro-organismos e não no ambiente em que eles estão inseridos. Estes resultados levam a crer que o processamento via APDC dentro de uma segurança microbiológica alvo preserva mais a integridade do produto que está sendo submetido a tal processo.

5.4 TRATAMENTO NÃO TÉRMICO DO PURÊ DE ABÓBORA