4 Material e métodos
4.3 Análise estatística
5.1.6.1 Efeito do XF-OE sobre a viabilidade celular de miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia
A exposição do XF-OE (81 μg/mδ) no período de 2 horas, tempo superior ao contato entre o órgão e o XF-OE nos experimentos funcionais, não induziu morte celular dos miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia (Gráfico 7, n = 3).
Souza, I. L. L. 85
Resultados
Gráfico 7 - Efeito do XF-OE (81 μg/mδ) sobre a viabilidade celular dos miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia.
Cont role XF-O E 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 * A b so rb ân ci a (5 40 n m )
As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente (n = 3). Teste t, *p < 0,05 (controle vs. XF-OE).
5.1.6.2 Avaliação do efeito do XF-OE sobre a [Ca2+]c
O controle de fluorescência foi obtido através da estimulação das células com 10-6 M de histamina (n = 3). Após o período de 20 s de exposição das células à histamina, o pico de fluorescência foi obtido, mantendo-se elevada durante todo o tempo de duração da estimulação (220 s) (Figura 12a e Gráfico 8). Após a indução do aumento da fluorescência por 10-6 M de histamina (100% de fluorescência), no período de 110 s, o XF-OE (81 µg/mL) foi adicionado e observou-se a diminuição da intensidade de fluorescência, mantendo essa redução durante todo o tempo, até o término dos 240 s (Figura 12B e Gráfico 8). A intensidade de fluorescência foi reduzida 97,0 ± 3,0%, indicando uma diminuição [Ca2+]c em miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia. Resultados semelhantes foram observados após a exposição das células ao verapamil (10-6 M), um bloqueador dos CaV1, quando a intensidade de fluorescência foi reduzida para 65,5 ± 4,1% (Figura 12C e Gráfico 8). O declínio de fluorescência observado durante os primeiros 20 s de exposição das células ao óleo essencial é um artefato, visto que na presença do HBSS (veículo), o mesmo perfil de queda da fluorescência foi observado, porém após esse tempo, a intensidade de fluorescência foi reestabelecida e se manteve constante (Figura 12D e Gráfico 8).
Souza, I. L. L. 87
Resultados
Figura 12 - Registros representativos do controle (A), do efeito de 81 µg/mL do XF-OE (B), de 10-6 M de verapamil (C) e do veículo (D) sobre o sinal de cálcio citosólico em
células musculares lisas da camada longitudinal do íleo de cobaia estimuladas com 10-6 M de histamina e marcadas com fluo-4.
Gráfico 8 - Efeito de 81 µg/mL do XF-OE sobre a intensidade de fluorescência emitida por estimulação com 10-6 M de histamina de miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia. Cont role XF-O E vera pam il HBSS 0 25 50 75 100
***
***
In te n si d ad e d e flu o re sc ên ci a (% )As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente
(n = 3). Teste t; ***p < 0,001 (controle vs. XF-OE e controle vs. verapamil).
Neste trabalho, foi investigado o mecanismo de ação espasmolítica do óleo essencial das folhas de Xylopia frutescens Aubl. (XF-OE) em íleo de cobaia, e demonstra-se pela primeira vez que o XF-OE inibe o influxo de Ca2+, via CaV1 e a mobilização de Ca2+ dos estoques intracelulares, o que leva a redução dos níveis citosólicos desse íon e, consequente relaxamento do músculo liso intestinal.
O principal impacto das doenças gastrintestinais é a sua morbidade (FARTHING, 2000). A alteração da contratilidade intestinal é um dos processos fisiológicos que caracterizam a cólica intestinal, diarreia e constipação. Clinicamente, a dor causada pelos espasmos intestinais é geralmente tratada com drogas que induzem o relaxamento da musculatura lisa (SATO et al., 2007). Dessa forma, o músculo liso intestinal apresenta-se como um modelo experimental para a investigação de novas drogas que possam minimizar as disfunções orgânicas que acometem essa musculatura.
Há relatos da utilização popular de espécies do gênero Xylopia para o tratamento de desordens intestinais (ASFAW; DEMISSEW, 1994; DUKE; VASQUEZ, 1994). A própria espécie X. frutescens é utilizada popularmente como antidiarreica (DUKE; VASQUEZ, 1994) e relatada na literatura como sucedânea da pimenta-do-reino (Piper nigrum), que também é utilizada popularmente com a mesma finalidade (RAO et al., 2011).
Diversos óleos essenciais com atividade sobre musculatura lisa intestinal são descritos na literatura, dentre eles os óleos essenciais de Lippia
microphylla Cham. (OLIVEIRA, 2013), Lippia alba (BLANCO et al., 2013), Ocimum gratissimum e de espécies do gênero Pelargoniums (Geraniaceae)
(LIS-BALCHIN; HART; ROTH, 1997; MAGALHÃES; LAHLOU;
LEAL-CARDOSO, 2004; MADEIRA et al., 2005), Rollinia leptopetala, X.
langsdorfiana e X. frutescens (CORREIA, 2013).
Em estudo anterior realizado por Correia (2013), verificou-se que o XF-OE exerce efeito espasmolítico não seletivo sobre aorta de rato, útero de rata, traqueia e íleo de cobaia, apresentando maior eficácia e potência espasmolítica na musculatura lisa intestinal. Diante dessas premissas,
Souza, I. L. L. 91
Discussão
decidiu-se avaliar o mecanismo de ação pelo qual o XF-OE exerce efeito espasmolítico em íleo de cobaia.
Em estudos preliminares realizados por Correia (2013), verificou-se que o XF-OE inibe de maneira dependente de concentração as contrações fásicas induzidas por carbacol (CCh) ou por histamina em íleo de cobaia, e apresenta maior potência em antagonizar as contrações induzidas por histamina quando comparadas ao CCh, semelhante ao observado para o óleo essencial de R.
leptopetala. Dessa forma, levantou-se a hipótese do XF-OE estar agindo nos
receptores histaminérgicos para promover sua ação espasmolítica. Para confirmar ou descartar essa proposição, decidiu-se verificar o efeito inibitório do XF-OE frente às curvas concentrações-resposta cumulativas à histamina. Nesse protocolo experimental, observou-se um desvio para direita das curvas controles cumulativas à histamina, de forma não paralela e com redução do Emax (Gráfico 1 e Tabela 6), descartando, dessa forma, um antagonismo do tipo competitivo.
O antagonismo do tipo não competitivo pode ocorrer quando há ligação do antagonista ao mesmo sítio de ligação do agonista (antagonismo pseudo-irreversível) ou em um sítio distinto (antagonismo alostérico) (BLUMENTHAL; GARRISON, 2011). O perfil do Gráfico 1 representa um antagonismo pseudo-irreversível, uma vez que não houve saturação do efeito, ou seja, a inibição da resposta contrátil da histamina na presença do XF-OE não atingiu um valor limitante, característica observada no antagonismo alostérico.
Resultados semelhantes foram observados por Vieira (2005) com a clemastina e a pirilamina, por Macêdo (2008) com o diterpeno labdano-302, por Santos et al. (2012b) com os diterpenos traquilobano-360 e traquilobano-318, e por Correia (2013) com o óleo essencial de R. leptopetala, que demonstraram efeito espasmolítico em músculo liso gastrintestinal também através de antagonismo do tipo não competitivo.
O músculo liso apresenta uma resposta bifásica atribuída à fonte dual de Ca2+, e é sugerido que a contração fásica é causada por liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares (ABDEL-LATIF, 1989; KOBAYASHI et al., 1989), enquanto que a contração tônica é atribuída ao influxo de Ca2+ através dos
CaV, uma vez que a utilização do verapamil, um bloqueador dos CaV, suprimiu esse componente da contração muscular lisa (JIM et al., 1981). Em íleo de cobaia, agentes contráteis como a histamina (TRIGGLE et al., 1989) e o KCl (TRIGGLE; TRIGGLE, 1976) causam uma resposta contrátil bifásica, que consiste em uma contração inicial transiente, cuja duração é de menos de 30 segundos, designada componente fásico, seguido por uma contração sustentada, que se desenvolve lentamente ao longo de 15 minutos e é mantida durante o período de exposição ao agente contrátil, denominada componente tônico (TRIGGLE; TRIGGLE, 1976; VAN BREEMEN; AARONSON; LOUTZENHISER, 1979; BOLTON, 1979).
Particularmente, em músculo liso de íleo de cobaia, tanto a contração fásica como a tônica são dependentes do Ca2+ extracelular, visto que ambas as contrações foram inibidas na ausência de Ca2+ extracelular (HONDA; TAKANO; KAMIYA, 1996). A remoção de íons Ca2+ do meio externo bloqueia totalmente a resposta contrátil tanto a agentes despolarizantes como a agonistas em poucos segundos, sugerindo que as fontes intracelulares de Ca2+ não contribuem significativamente para o nível de tensão atingido (NOUAILHETAS et al., 1985). No entanto, a influência do Ca2+ extracelular é relativamente maior na resposta contrátil tônica comparado com a fásica (BOLTON, 2006).
No músculo liso intestinal, a camada longitudinal apresenta células dispostas em paralelo ao eixo longo do intestino, já na camada circular, mais interna, as células estão em paralelo com a circunferência intestinal. Dessa forma, essa musculatura lisa apresenta-se em duas camadas separadas por um sistema de neurônios, conhecido como plexo mioentérico (MAKHLOU; MURTHY, 1997).
Como o óleo essencial foi menos potente em relaxar o órgão pré-contraído por KCl (Gráfico 2) e, tendo em vista que os inibidores dos canais de K+ são conhecidos por apresentarem uma menor potência em situações de aumento na [K+]e (SIQUEIRA et al., 2011), decidiu-se verificar a participação dos canais de K+ no mecanismo de ação relaxante promovido pelo XF-OE.
É relatado na literatura que os canais de K+ desempenham um papel chave na regulação do potencial de membrana e na excitabilidade celular, sendo a contração do músculo liso dependente do balanço entre o aumento da
Souza, I. L. L. 93
Discussão
condutância a esse íon, levando a uma repolarização/hiperpolarização, e a diminuição da condutância a esse íon, levando a uma despolarização (KNOT; BRAYDEN; NELSON, 1996). Esses canais estão envolvidos em diversas funções fisiológicas, destacando-se a regulação do potencial de membrana celular, a secreção de hormônios e de neurotransmissores, além da regulação da [Ca2+]c. Sua atividade pode ser regulada por voltagem, por Ca2+ ou por neurotransmissores (ALEXANDER; MATHIE; PETERS, 2011).
Uma vez que o fluxo dos íons K+ por canais presentes na membrana plasmática regula a abertura e o fechamento dos CaV (THORNELOE; NELSON, 2005), levantou-se a hipótese de que o XF-OE poderia estar inibindo o influxo de Ca2+ de maneira indireta através da modulação positiva dos canais de K+ e, dessa forma, aumentaria o efluxo desse íon, ocasionando a hiperpolarização da membrana com consequente bloqueio dos CaV.
Para testar essa hipótese, o CsCl foi utilizado como ferramenta farmacológica para bloquear os canais de K+ de maneira não seletiva (CECCHI et al., 1987). Caso essa hipótese fosse verdadeira, a curva de relaxamento do óleo essencial seria desviada para direita de maneira significante. Porém, observou-se que a curva de relaxamento obtida para o XF-OE não foi alterada na presença do bloqueador (Gráfico 3). Sendo assim, a participação dos canais de K+ no mecanismo de ação espasmolítica do XF-OE foi descartada.
Resultados diferentes foram observados por Macêdo (2008) com o diterpeno labdano-302, por Santos et al. (2012c) com o diterpeno traquilobano-318, ambos diterpenos isolados der X. langsdorfiana, e por Correia (2013) com o óleo essencial de R. leptopetala em músculo liso gastrintestinal que têm como alvos farmacológicos, em nível funcional, os canais de K+, para exercer seus efeitos espasmolíticos.
Como o bloqueio indireto dos CaV por modulação positiva dos canais de K+ foi descartado, decidiu-se verificar se o óleo essencial estaria inibindo o influxo de cálcio através dos CaV. Para isso, foram realizadas curvas concentrações-resposta cumulativas ao CaCl2 em meio despolarizante nominalmente sem Ca2+, na ausência e na presença de diferentes concentrações do XF-OE. Este protocolo se baseia no fato de que a contração ocorre, quase que exclusivamente, pelo Ca2+ proveniente do meio extracelular,
já que a despolarização promovida pela elevada [K+]e induz a abertura dos CaV (REMBOLD, 1996).
A hipótese do bloqueio do influxo de Ca2+ através dos CaV, pelo óleo essencial, foi confirmada pela observação do desvio para direita das curvas cumulativas ao CaCl2, bem como da redução do seu Emax (Gráfico 4 e Tabela 8).
Os CaV foram inicialmente classificados nos subtipos L, N, P/Q, R e T, de acordo com as suas propriedades eletrofisiológicas e farmacológicas (CATTERALL et al., 2005). Os CaV do tipo L (CaV1.1, 1.2, 1.3 e 1.4), P/Q (CaV2.1), N (CaV2.2) e R (CaV2.3) são ativados por alta voltagem. Os CaV do tipo T, são ativados por baixa voltagem e compreendem três membros, os CaV3.1, 3.2 e 3.3. A subunidade 1 é a formadora de poros e fornece o sítio de ligação extracelular para praticamente todos os agonistas e antagonistas desses canais (ALEXANDER; MATHIE; PETERS, 2011).
No músculo liso, a subfamília dos CaV1 é a principal responsável pelo influxo de Ca2+, cujo sítio de ligação para seus bloqueadores está na subunidade 1, embora nele existam quatro outras unidades complexadas (2 , 1 e 1 ) (VOGALIS et al., 1991; KURIYAMA; KITAMURA; NABATA, 1995; KNOT; BRAYDEN; NELSON, 1996).
Com o intuito de avaliar se o subtipo de CaV envolvido na ação espasmolítica do XF-OE seria o CaV1, avaliou-se o efeito do óleo essencial sobre as contrações tônicas induzidas pelo derivado di-hidropiridínico S-(-)-Bay K8644, um agonista seletivo desse canal, que age por ligação direta na sua subunidade e não por despolarização (SPEDDING; PAOLETTI, 1992). Em estudos anteriores foi demostrado que as respostas contráteis aos ativadores de CaV1, S-(-)-Bay K8644 e FPL 64176, são potencializadas pelo aumento moderado (8-20 mM) da [K]e, concentrações estas superiores àquelas da solução de Krebs modificado (WEI et al., 1986; ZHENG; RAMPE; TRIGGLE, 1991), em decorrência dessa informação, o íleo de cobaia era previamente despolarizado durante esses procedimentos experimentais.
A potência relaxante do XF-OE foi diminuída no órgão pré-contraído com o S-(-)-Bay K8644 quando comparado com a pré-contração com KCl (Gráfico 5). Esses resultados sugerem que o óleo essencial esteja agindo por bloqueio
Souza, I. L. L. 95
Discussão
do influxo de Ca2+, via CaV1. Porém, não se descartam outros mecanismos que possam estar envolvidos no mecanismo de ação espasmolítica do XF-OE em íleo de cobaia, como por exemplo, a participação da via de sensibilização ao Ca2+, envolvendo a translocação e ativação da RhoA cinase, bem como a ativação da proteína cinase II dependente de Ca2+/calmodulina (CaMKII), da proteína cinase regulada por sinal extracelular (ERK) ou a mobilização de cálcio dos estoques intracelulares (RATZ et al., 2005, MURTHY, 2006).
Em ambas as camadas de músculo liso intestinal, agonistas com receptores acoplados a proteína G iniciam a contração por um aumento da [Ca2+]c. Estudos demonstram que a contração inicial e o aumento da [Ca2+]c não foram afetados por bloqueadores de canais de Ca2+ ou por retirada do cálcio extracelular em células musculares lisas da camada circular, mas foram abolidas em células da camada longitudinal (MURTHY; GRIDER; MAKHLOUF,1991). Dessa forma, demonstra-se que os mecanismos de mobilização de Ca2+ em células musculares das camadas circular e longitudinal são diferenciados.
Nas células musculares lisas da camada longitudinal, ocorre preferencialmente a hidrólise do 4-monofosfato de fosfatidilinositol (PIP), uma vez que sua membrana plasmática contém baixas quantidades de PIP2 e gera mínimas quantidades de IP3. Seu RS é desprovido de IP3R de alta afinidade e exibem uma sensibilidade mínima ao IP3. Entretanto, possuem receptores de rianodina de alta afinidade e exibem alta sensibilidade ao cálcio e à ADP-ribose cíclica (MURTHY, 2006), justificando a dependência do Ca2+ extracelular para o desenvolvimento da contração da camada longitudinal do íleo, tanto pelo acoplamento eletro- como fármaco-mecânico.
Tendo em vista que os mecanismos envolvidos na manutenção do componente tônico da contração diferem daqueles que induzem a contração fásica em musculatura lisa intestinal (ABDELLATIF, 1989; KOBAYASHI et al., 1989; HONDA; TAKANO; KAMIYA, 1996), resolveu-se verificar se o XF-OE relaxaria o íleo de cobaia pré-contraído com KCl, um agente contrátil que atua por acoplamento eletromecânico ou, com histamina, um agonista que atua por acoplamento do tipo misto (BOLTON et al., 1981).
No intestino, as células musculares lisas da camada circular apresentam preferencialmente hidrólise de PIP2 com consequente formação de IP3. O RS contêm canais de cálcio que são receptores com alta afinidade para o IP3 e liberam Ca2+ em resposta a baixas concentrações citosólica de IP3. São expressos dois subtipos de receptores de IP3 (IP3R), o IP3R-I e o IP3R-III, mas apenas o IP3R-I é o responsável pela liberação de Ca2+ (MURTHY, 2006). A inibição da formação do IP3 pelo U-73122 (inibidor da PLC) suprime a contração muscular, demonstrando assim que a mobilização do Ca2+ na camada circular do íleo é dependente da formação do IP3 (MURTHY; KUEMMERLE; MAKHLOUF, 1995). O RS também possui canais de cálcio dependentes de Ca2+ que são receptores com alta afinidade pela rianodina e pela cafeína. São expressos dois subtipos de receptores de rianodina (RYR), o RYR-I e o RYR-II, ambos responsáveis pela liberação do Ca2+ (GUERRERO-HERNANDEZ et al., 2002; KOTLIKOFF et al., 2002; BERRIDGE, 2009).
Uma vez que os procedimentos experimentais realizados com o íleo integro favorecem a verificação da contração da camada longitudinal, e como os mecanismos de mobilização de Ca2+ em células musculares das camadas circular são diferentes da longitudinal, hipotetizou-se que o óleo essencial em estudo poderia atuar impedindo a mobilização de Ca2+ dos estoques intracelulares para promover seu efeito espasmolítico em íleo de cobaia.
Dessa maneira, avaliou-se o efeito do XF-OE frente às contrações fásicas induzidas por histamina na camada circular do íleo de cobaia. Observou-se que o óleo essencial inibiu essas contrações de maneira dependente de concentração (Gráfico 6). Esses resultados sugerem que o XF-OE modula negativamente a mobilização de Ca2+ dos estoques intracelulares do íleo de cobaia. Oliveira (2013) descreveu a inibição da liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares pelo óleo essencial de Lippia
microphylla Cham.
Tendo em vista que todos os resultados obtidos até aqui apontam que o XF-OE interfere na sinalização do Ca2+ para exercer seu efeito espasmolítico em íleo de cobaia, decidiu-se comprovar ou refutar esses achados em nível celular, averiguando se o óleo essencial reduziria os níveis citosólicos de Ca2+
Souza, I. L. L. 97
Discussão
utilizando-se, para tanto, a cultura de miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia.
Como já foi demonstrado que o XF-OE apresentou atividades citotóxica frente aos eritrócitos de camundongos e antitumoral frente à células da linhagem sarcoma 180 (LUNGUINHO, 2012), faz-se necessário a avaliação da toxicidade in vitro do óleo essencial sobre miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia, para se ter assim, uma segurança para a continuidade dos experimentos celulares.
Diante disso, avaliou-se a viabilidade dos miócitos na presença e na ausência de 81 µg/mL do XF-OE no período de 2 h (Gráfico 7), utilizando o ensaio de redução do MTT. A concentração do óleo essencial foi escolhida de acordo com os resultados obtidos em nível funcional, por representar a concentração máxima necessária para o íleo relaxar, quando o agonista utilizado foi a histamina.
O MTT é um corante amarelo, que é reduzido por enzimas mitocondriais e citoplasmáticas a um composto azul denominado formazan, insolúvel em solução aquosa. A redução do MTT, principalmente pela enzima mitocondrial succinato desidrogenase (SLATER; SAWYER; STRAULI, 1963), é muito utilizada em ensaios de avaliação de sobrevivência e proliferação celular por causa da relação linear entre atividade celular e absorbância, dessa forma, o crescimento ou taxa de morte de células pode ser mensurado (ATCC, 2013). Sendo assim, a quantidade de formazan produzido é proporcional ao número de células viáveis presentes (MOSMANN, 1983; DENIZOT; LANG, 1986).
Observou-se que não houve morte celular, no período de 2 horas (Gráfico 7), tempo aproximado do contato do XF-OE com o órgão na cuba nos experimentos funcionais. Sugerindo que o XF-OE não interfere com a viabilidade dos miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia. Resultados semelhantes foram observados para os óleos essenciais de R. leptopetala e X.
langsdorfiana (CORREIA., 2013), espécies pertencentes a família Annonaceae.
Uma vez que as células musculares lisas da camada longitudinal do íleo de cobaia mostraram-se viáveis na presença do óleo essencial, passou-se a avaliar se a redução da [Ca2+]c seria o meio pelo qual o XF-OE estaria relaxando as preparações de músculo liso nos experimentos funcionais. Para
testar essa hipótese, o efeito do óleo essencial foi observado sobre a concentração de Ca2+ citosólico marcado com a sonda fluorescente fluo-4 e quantificado em miócitos de íleo de cobaia.
Foi verificado que o XF-OE, na concentração de 81 µg/mL, reduziu de maneira significante os níveis citosólicos de Ca2+, conforme pode ser observado pela redução aproximada de 97% da intensidade de fluorescência emitida pelo fluo-4 (Figura 12, Gráfico 8). Resultados semelhantes foram observados após a exposição dos miócitos à concentração de 10-6 M do verapamil, um bloqueador dos CaV1 (STANEVA-STOYTCHEVA; VENKOVA, 1992) (Figura 12). Essa redução da [Ca2+]c está de acordo com o que foi observado no efeito relaxante do óleo essencial sobre o íleo pré-contraído com histamina, cujo relaxamento máximo (100%) foi induzido por 81 µg/mL (Gráfico 2). Dessa forma, pode-se inferir que o XF-OE atua majoritariamente sobre a sinalização do cálcio para exercer seu efeito espasmolítico.
Resultados similares foram evidenciados com o óleos essenciais de L.
microphylla Cham., X. langsdorfiana e R. leptopetala, assim como os
diterpenos traquilobano-360 e traquilobano-318, obtidos da espécie X.
langsdorfiana, que também reduziram a [Ca2+]c dos miócitos intestinais para exercer seu efeito espasmolítico em íleo de cobaia (SANTOS et al., 2012b; CORREIA, 2013; OLIVEIRA, 2013).
De acordo com os resultados obtidos, sugere-se que o mecanismo de ação pelo qual o XF-OE exerce seu efeito espasmolítico em íleo de cobaia (Figura 13) não envolve a modulação positiva dos canais de K+, mas o antagonismo não-competitivo com os receptores histaminérgicos, a inibição do influxo de Ca2+, via CaV1, e a modulação negativa dos mecanismos de liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, levando a redução da [Ca2+]c e consequente relaxamento da musculatura lisa intestinal.
Souza, I. L. L. 99
Discussão
Figura 13 - Mapa conceitual do mecanismo de ação espasmolítica do XF-OE em íleo de cobaia.
Fonte: SOUZA, 2014
O mecanismo de ação espasmolítica do XF-OE em íleo de cobaia, 1. envolve o antagonismo não-competitivo pseudo-irreversível dos receptores histaminérgicos, 2. não envolve a modulação positiva dos canais de K+, 3. envolve o bloqueio do influxo
de Ca2+, via Ca
V1 e 4. envolve modulação negativa da liberação de Ca2+ dos estoques