UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS
NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
IARA LEÃO LUNA DE SOUZA
A ação espasmolítica do óleo essencial de Xylopia frutescens
Aubl. envolve a redução dos níveis citosólicos de cálcio em
íleo de cobaia
A ação espasmolítica do óleo essencial de Xylopia frutescens
Aubl. envolve a redução dos níveis citosólicos de cálcio em
íleo de cobaia
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de Concentração: FARMACOLOGIA
ORIENTADORA: Profa. Dra. Bagnólia Araújo da Silva
COORIENTADORA: Profa. Dra. Fabiana de Andrade Cavalcante
S729a Souza, Iara Leão Luna de.
A ação espasmolítica do óleo essencial de Xylopia frutescens Aubl. envolve a redução dos níveis citosólicos de
cálcio em íleo de cobaia / Iara Leão Luna de Souza.- João Pessoa, 2014.
124f. : il. Orientadora: Bagnólia Araújo da Silva
Coorientadora: Fabiana de Andrade Cavalcante Dissertação (Mestrado) – UFPB/CCS
1. Produtos naturais. 2. Xylopia frutescens. 3. Óleo
essencial. 4. Atividade espasmolítica. 5. Íleo de cobaia. 6. Cálcio
A ação espasmolítica do óleo essencial de Xylopia frutescens
Aubl. envolve a redução dos níveis citosólicos de cálcio em
íleo de cobaia
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de Concentração: FARMACOLOGIA
Aprovada em 06/03/2014
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________ Profa. Dra. Bagnólia Araújo da Silva
Orientadora
_______________________________________________ Prof. Dr. Amilton da Cruz Santos
(Universidade Federal da Paraíba) Examinador Externo
_______________________________________________ Profa. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz
À Conceição de Maria Luna de Souza, Camila Leão Luna de Souza e Ivan Luna Leão de Souza, que mais do que me proporcionar uma boa infância e vida acadêmica, formaram os fundamentos do meu caráter. Obrigada por serem a minha referência de inúmeras maneiras, a segurança em todos os aspectos e por estarem sempre presentes na minha vida de forma indispensável.
Ao meu inesquecível avô, Sr. Gleuber José de Araújo Luna (in memoriam), por sempre ter
estendido sua mão e seu abraço acolhedor, tendo depositado em mim a sua confiança, possibilitando a concretização dos meus ideais. Mesmo que não possa partilhar fisicamente deste momento junto a mim, creio que também realizou esta conquista.
A minha família pela compreensão nos momentos em que a dedicação aos estudos foi exclusiva, em especial as minhas avós, que não se cansam de me ajudar e torcer para o meu crescimento pessoal e profissional.
nossos sonhos”. Apesar dos planos serem feitos e refeitos, os sonhos devem ser sempre e cada vez mais realizados, pois os sonhos são como rios que fluem ao deságue, e neste longo caminho existem ápices e declives, e em determinados momentos há pontos críticos em sua extensão, e o curso parece se esgotar. É nessa hora que se recebe os afluentes! E muitas vezes não percebemos o quão próximo eles estão e o quão podem mudar e enriquecer nossos cursos.
Hoje, percebo que o rio só segue seu curso porque consegue demolir posições que se estabilizaram como adversidades, adapta-se porque se eleva em qualidades adquiridas com a ajuda dos seus afluentes. Logo, quero tecer o meu agradecimento a todos os meus afluentes. Desejo que os seus rios jamais alcancem o mar, pois só se chega a ele quando todos os sonhos terminaram!
Inicialmente agradeço a Deus, pela sua presença constante na minha vida, por me confortar nas horas mais difíceis, por colocar pessoas especiais em meu caminho, pelo auxílio nas minhas escolhas e por me guiar nos caminhos da vida.
À Bagnólia Araújo da Silva, minha professora, colega de profissão e orientadora, principalmente por ser um exemplo de ser humano transformador, capaz de lapidar o mais duro diamante. São inúmeros momentos que estão marcados na minha vida, os ensinamentos primorosos, a dedicação, a amizade, a paciência, a compreensão e a ajuda incondicional para a conclusão desta etapa da minha vida. Durante todos os anos de convivência foram seus conselhos (e puxões de orelha) que me auxiliaram a crescer pessoal e profissionalmente. Com a certeza que ainda tenho muito a aprender e amadurecer, agradeço a confiança depositada e desejo que todos possam ter um ser humano semelhante em suas vidas.
na elaboração e na correção dessa dissertação. Certamente, é um outro exemplo de mestre presente em minha vida.
Aos Professores Doutores Josean Fechine Tavares e Marcelo Sobral da Silva, por cederem o óleo essencial para a realização desse trabalho.
Ao Doutor Vicente Carlos de Oliveira Costa, pela ajuda na obtenção do óleo essencial, e sobretudo por ser um referencial da fitoquímica com o qual pude contar desde a minha Iniciação Científica. Que nossos caminhos estejam sempre se cruzando.
À Profa. Dra. Alice Ferreira Teixeira do Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) por ceder vários materiais para a execução dos experimentos celulares e aos seus funcionários técnicos, Sandra Claro e Chandler Tahan.
Ao Prof. Dr. Edgar Julian Paredes Gamero da UNIFESP e ao seu doutorando, Marcus Vinícius Buri, pelo auxílio nos experimentos celulares e também por todos os reagentes concedidos.
Aos Professores Doutores Amilton da Cruz Santos e Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz, pela disponibilidade em participar da banca examinadora da defesa de Mestrado, bem como às Professoras Tatiane Santi Gadelha e Bárbara Viviana de Oliveira Santos, como suplentes. Agradeço por suas contribuições a esse trabalho, bem como a participação nessa etapa tão importante na minha formação acadêmica.
Aos professores da graduação em Farmácia da Universidade Federal da Paraíba e do Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos (PPgPNSB). De fato, alguns se destacam por instigar a curiosidade nos alunos, contribuindo para o desenvolvimento desses futuros mestres, dentre estes cito Bagnólia Araújo da Silva, Demétrius Antônio Machado de Araújo, Eduardo de Jesus Oliveira e Luís Fernando Marques Santos.
esse Programa.
À Caroline Mangueira, secretária do PPgPNSB, pela paciência, disponibilidade, dedicação e eficiência com que conduz seu trabalho.
À Ana Carolina de Carvalho Correia, pelos experimentos realizados na UNIFESP e por todos os ensinamentos durante esses anos de convivência.
À Ana Carolina de Carvalho Correia, Rafael de Almeida Travassos, Juliana da Nóbrega Carreiro e Gislaine Alves de Oliveira, pelos primeiros ensinamentos durante a Iniciação Científica, mais do que necessários para o meu crescimento no campo da pesquisa.
A todos os amigos e colegas da equipe “relaxados” que estão ou passaram pelo Laboratório de Farmacologia Funcional Prof. George Thomas, entre eles, Aline de Freitas Brito, Ana Carolina de Carvalho Correia, Ana Caroline de Lima Silva, Anne Kaliery de Abreu Alves, Cibério Landim Macêdo, Cybelle de Arruda Navarro Silva, Fabio de Souza Monteiro, Fernando Ramos Queiroga, Filipe Rodolfo Moreira Borges de Oliveira, Gislaine Alves de Oliveira, Giuliana Amanda de Oliveira, Giulyane Targino Aires Moreno, Hannah Olga
Pereira Rodovalho, Italo Rossi Roseno Martins, Joedna Cavalcante Pereira, José Lucas Ferreira Marques Galvão, José Rabelo, Juliana da Nóbrega Carreiro, Layanne Cabral da Cunha Araújo, Kimã Barbosa Meira, Luiz Henrique Agra Cavalcante Silva, Luiz Henrique César Vasconcelos, Maria Alice Miranda Bezerra Medeiros, Maria da Conceição Correia Silva, Massilon da Silva Moreira dos Santos Júnior, Milena de Melo Medeiros, Paula Benvindo Ferreira, Polyana Cristina Barros Silva, Rafael de Almeida Travassos, Renata de Souza Sampaio, Rosimeire Ferreira dos Santos, Sarah Rebeca Dantas Ferreira e Tamyris Freires Ferreira, pela ajuda, boa convivência, sermões, elogios e pelo apoio característico desta equipe.
cursos, e/ou que visitaram o nosso laboratório, vocês se destacaram e se tornaram peças chaves no meu crescimento pessoal e profissional.
A melhor turma de graduação do mundo, a turma “Tarja Preta” Farmácia
2012.2, por trazerem nos momentos de aperreios, uma solução, por fazerem dos dias cansativos, dias felizes, da espera na fila do Restaurante Universitário, um momento de descontração, enfim, por fazerem parte da minha vida durante o curso de Farmácia. Em especial, Alysson Santiago (meu parceiro), Amanda Pedrosa, Andressa Lira, Danillo Macêdo, Lindemberg Damasceno, Mayza Neves, Priscila Ramos, Priscilla Maria, Rômulo Pereira e Tarliane Pedrosa.
A todos os colegas das turmas de Mestrado e Doutorado do PgPNSB, em especial, a Camila Gurgel, Danilo Lemos, Diego Igor, Evandro Ferreira, Luciano Leite, Rayssa Marques, Jocelmo Leite, Mateus Feitosa, Diogo Vilar e Cris Husein.
Quem foi que disse que não se fazem mais amigos como antigamente? Amigo é aquele que divide as coisas com você, que sabe do que você mais gosta, é aquele que te protege não por obrigação, mas por vontade. “εeus
Luizes” são assim: metade loucura, outra metade santidade. Foram escolhidos não pela pele, mas pela pupila, que tem um brilho questionador e tonalidade inquietante. Meus maiores presentes nesses últimos anos, pois um verdadeiro amigo é aquele que vem quando o resto do mundo está indo embora.
As minhas psicólogas de plantão, Layanne Cabral da Cunha Araújo e Maria da Conceição Correia Silva, que estiveram presentes durante o período da Catharsis, demonstrando que as pequenas coisas são a medida de uma grande alma. São os pequenos atos que valem, aqueles que são espontâneos que mais marcam a nossa vida.
Aos membros do “legais sem futuro”: Ana Caroline, Danilo δemos, δuiz
“Prof. Thomas George” e pelo auxílio técnico ao δaboratório de Farmacologia
Funcional, sempre que solicitado.
Ao Sr. Luís C. Silva e a Adriano S. Cordeiro, pelo trabalho executado no Biotério e pela prestatividade em separar os animais quase que diariamente.
À Mônica R. da Silva, pelo seu trabalho na limpeza, por manter nosso ambiente de trabalho/estudo em condições salutares e, principalmente, por sua alegria contagiante e apoio sempre que necessário.
À Sra. Luzinete, pelo trabalho na limpeza de material e equipamentos úteis à rotina do laboratório.
Ao Professor e Conselheiro Federal de Farmácia, Samuel Meira, pelo apoio financeiro concedido para participação em congressos científicos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa concedida.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pelo suporte técnico-científico através do Portal Periódicos.
À Direção do Centro de Biotecnologia (CBiotec), antigo Laboratório de
Tecnologia Farmacêutica “Prof. Delby Fernandes de εedeiros” (δTF), na pessoa do Prof. Dr. Valdir de Andrade Braga, pelo apoio Institucional.
À Universidade Federal da Paraíba, instituição que me formou como profissional de Farmácia e responsável pelo meu aperfeiçoamento profissional.
A todos que, de maneira direta ou indireta, contribuíram para a produção dessa Dissertação de Mestrado.
“Porque cada um, independente das habilitações que tenha, ao menos uma vez na vida fez ou disse coisas muito acima da sua natureza e condição, e se essas pessoas pudéssemos retirar do quotidiano pardo em que vão perdendo os contornos, ou elas a si próprias se retirassem de malhas e prisões, quantas mais maravilhas seriam capazes de obrar, que pedaços de conhecimento profundo poderiam comunicar, porque cada um de nós sabe infinitamente mais do que julga e cada um dos outros infinitamente mais do que neles aceitamos reconhecer.”
RESUMO
A espécie Xylopia frutescens Aubl., conhecida popularmente como “embira”,
“semente-de-embira” e “embira-vermelha”, é utilizada na medicina popular
como antidiarreica. Das folhas dessa espécie foi extraído o óleo essencial (XF-OE), que, em estudos anteriores, apresentou atividade espasmolítica frente às contrações fásicas induzidas por CCh ou por histamina em íleo de cobaia. Diante dessa premissa, o objetivo desse trabalho foi caracterizar o mecanismo de ação espasmolítica do XF-OE em musculatura lisa intestinal. Para isso, foram utilizadas metodologias funcionais e celulares. O XF-OE inibiu as curvas concentrações-resposta cumulativas à histamina, desviando-as para a direita, de maneira não paralela e com redução do seu Emax, descartando um antagonismo do tipo competitivo, além de relaxar o íleo pré-contraído com KCl (40 mM) ou com histamina (10-6 M). Como a potência relaxante do óleo essencial foi menor quando as contrações foram induzidas por KCl, hipotetizou-se que o XF-OE estaria atuando como um modulador positivo de canais de K+. Na presença do CsCl (5 mM), bloqueador não seletivo desses canais, a potência relaxante do XF-OE não foi alterada, sendo descartada a participação dos canais de K+ no efeito espasmolítico do óleo essencial. Diante disso, decidiu-se verificar se o óleo essencial estaria inibindo o influxo de cálcio através dos CaV, para isso foram obtidas curvas concentrações-resposta cumulativas ao CaCl2 em meio despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem Ca2+ na ausência (controle) e na presença de diferentes concentrações do XF-OE. O óleo essencial deslocou para a direita as curvas controle de CaCl2 com redução do seu Emax, além de relaxar o íleo pré-contraído com o S-(-)-Bay K8644 (3 x 10-7 M), um agonista dos CaV1, demonstrando que o óleo essencial inibe o influxo de Ca2+ através dos CaV1. Sendo os mecanismos de mobilização de Ca2+ em células musculares das camadas circular e longitudinal diferenciados, hipotetizou-se que o XF-OE estaria impedindo a mobilização de Ca2+ dos estoques intracelulares para promover seu efeito espasmolítico. Para testar essa hipótese, em experimentos utilizando a camada circular do íleo, o óleo essencial antagonizou as contrações fásicas induzidas por histamina (10-5 M), modulando negativamente a liberação de Ca2+ para exercer seu efeito espasmolítico. Nos experimentos celulares, a viabilidade dos miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia não foi alterada na presença do XF-OE (81 µg/mL) e a intensidade de fluorescência nos miócitos intestinais estimulados por histamina foi reduzida pelo óleo essencial, indicando a redução na [Ca2+]c. Assim, o mecanismo de ação espasmolítica do XF-OE em íleo de cobaia envolve bloqueio do influxo de Ca2+, via CaV1, além da modulação negativa dos mecanismos de liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, levando à redução dos níveis citosólicos desse íon e, consequente, relaxamento muscular.
Palavras-chave: Xylopia frutescens, óleo essencial, atividade espasmolítica,
íleo de cobaia, cálcio.
A ação espasmolítica do óleo essencial de Xylopia frutescens Aubl. envolve a redução dos níveis citosólicos
de cálcio em íleo de cobaia.
SOUZA, I. L. L. Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,
Abstract
Xylopia frutescens Aubl. species, popularly known as “embira”,
“semente-de-embira” and “embira-vermelha”, is used in folk medicine as antidiarrhoeal. From leaves of these species was extract the essential oil (XF-OE), that in previous studies, showed spasmolytic activity on phasic contractions induced by CCh or histamine on guinea pig ileum. Considering this premise, the aim of this study was to characterize the mechanism of spasmoliytic action of XF-OE on intestinal smooth muscle. For this, were used functional and cellular methodologies. XF-OE inhibited cumulative concentration-response curves to histamine, and these were shifted to the right, in a non-parallel manner, with Emax reduction, discarding thus a competitive type antagonism and relaxed the guinea pig ileum contracted by KCl (40 mM) or histamine (10-6 M). How the relaxant potency of the essential oil was smaller in organ pre-contracted by KCl, it was hypothesized that XF-OE would be acting as a K+ channels positive modulator. In presence of CsCl (5 mM), a non-selective blocker of these channels, the relaxant potency of XF-OE was not altered, showed a non-participation of K+ channels on the essential oil spasmolytic effect. Thus, we decided to check whether the essential oil would prevent calcium influx through CaV, for this were obtained cumulative concentration-response curves to CaCl2 in depolarizing medium (70 mM KCl) nominally without Ca2+ in absence (control) and presence of different concentrations of XF-OE. The essential oil shifted to the right CaCl2 control curves, with reduction of its Emax, in addition to relaxed the ileum pre-contracted by S-(-)-Bay K8644 (3 x 10-7 M), a CaV1 selective agonist, demonstrating that the essential oil inhibited Ca2+ influx through CaV1. As the Ca2+ mobilization mechanisms into circular and longitudinal muscle layers are differentiated, it was hypothesized that XF-OE would preventing Ca2+ mobilization from intracellular stores in order to promote its spasmolytic effect. To test this hypothesis, in experiments with ileum circular layer, the essential oil antagonized phasic contractions induced by histamine (10-5 M), negatively modulates the Ca2+ release to exert their spasmolytic effect. In cellular experiments, the viability of longitudinal layer myocytes from guinea pig ileum was not altered in XF-OE (81 µg/mL) presence and the fluorescence intensity in these intestinal myocytes stimulated by histamine was reduced by the essential oil, indicating a [Ca2+]c reduction. Thus, the XF-OE spasmolytic action mechanism on guinea pig ileum involves blocking the Ca2+ influx, by CaV1, in addition to negative modulation of Ca2+ release mechanisms from intracellular stores, that lead to reduction of this ion cytosolic levels and consequently muscle relaxation.
Keywords: Xylopia frutescens, essential oil, spasmolytic activity, guinea pig
ileum, calcium.
Spasmolytic action of Xylopia frutescens Aubl. essential oil involves the reduction of cytosolic calcium levels
on guinea pig ileum.
SOUZA, I. L. L. Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos,
Figura 1 - Mapa de distribuição da família Annonaceae no mundo, representada pelas áreas coloridas, com gradação de cor segundo a ocorrência... 35
Figura 2 - Mapa de distribuição do gênero Xylopia no mundo, representada
pelas áreas coloridas, com gradação de cor segundo a ocorrência. ... 36
Figura 3 - Foto de Xylopia frutescens Aubl. (A); detalhes de suas folhas (B)..38
Figura 4 - Acoplamento eletromecânico da contração muscular lisa pelo aumento da concentração extracelular de K+. ... 42
Figura 5 - Estrutura dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem (CaV) (A); detalhes de suas subunidades (B). ... 44
Figura 6 - Esquema do mecanismo fármaco-mecânico da contração no músculo liso pela ativação da via Gq/11-PδC 1. ... 45
Figura 7 - Esquema do mecanismo fármaco-mecânico do relaxamento no músculo liso pela ativação da via Gs-AC-PKA e NO-sGC-PKG. ... 49
Figura 8 - Registros representativos do efeito relaxante do XF-OE em íleo de cobaia pré-contraído com 40 mM de KCl (A) e com 10-6 M de histamina (B). . 71
Figura 9 - Registros representativos do efeito relaxante do XF-OE em íleo de cobaia pré-contraído com 10-6 M de histamina na ausência (A) e na presença
(B) de 5 mM de CsCl. ... 74
Figura 10 - Registros representativos do efeito relaxante do XF-OE em íleo de cobaia pré-contraído com 40 mM de KCl (A) e com 3 x 10-7 M de S-(-)-Bay K8644 parcialmente despolarizado com 15 mM de KCl (B). ... 79
Figura 11 - Registros representativos do efeito inibitório do XF-OE frente às contrações fásicas induzidas por 10-5 M de histamina na camada circular do íleo de cobaia. ... 82
Figura 12 - Registros representativos do controle (A), do efeito de 81 µg/mL do XF-OE (B), de 10-6 M de verapamil (C) e do veículo (D) sobre o sinal de cálcio citosólico em células musculares lisas da camada longitudinal do íleo de cobaia estimuladas com 10-6 M de histamina e marcadas com fluo-4. ... 87
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Curvas concentrações-resposta cumulativas à histamina na ausência (controle) () e na presença de XF-OE nas concentrações de 3 (); 9 (); 27 () e 81 (▲) μg/mδ em íleo de cobaia. ... 69
Gráfico 2 - Efeito do XF-OE sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl () e por 10-6 M de histamina () em íleo de cobaia. ... 72
Gráfico 3 - Efeito do XF-OE sobre as contrações tônicas induzidas por 10-6 M de histamina na ausência () e na presença () de 5 mM de CsCl em íleo de cobaia. ... 75
Gráfico 4 - Curvas concentrações-resposta cumulativas ao CaCl2 em meio despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem Ca2+ na ausência (controle) () e na presença de XF-OE nas concentrações de 3 (); 9 (); 27 () e 81 (▲)
μg/mδ em íleo de cobaia. ... 77 Gráfico 5 - Efeito do XF-OE sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl () e por 3 x 10-7 M de S-(-)-Bay K8644 () em íleo de cobaia. ... 80
Gráfico 6 - Efeito do XF-OE frente às contrações fásicas induzidas por 10-5 M de histamina na camada circular do íleo de cobaia. ... 83
Gráfico 7 - Efeito do XF-OE (81 μg/mδ) sobre a viabilidade celular dos miócitos
da camada longitudinal do íleo de cobaia. ... 85
Tabela 1 - Composição da solução de Krebs modificado . ... 55
Tabela 2 - Composição da solução de Krebs modificado despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem cálcio. ... 56
Tabela 3 - Composição da solução salina fisiológica sem cálcio. ... 56
Tabela 4 - Composição da solução tampão fisiológica. ... 56
Tabela 5 - Composição da solução salina balanceada de Hank . ... 57
Tabela 6 - Valores de CE50 (M) e de Emax (%) da histamina na ausência (controle) e na presença do XF-OE em íleo de cobaia . ... 69
Tabela 7 - Valores de CE50 (M) e de Emax (%) do XF-OE sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl ou por 10-6 M de histamina em íleo de cobaia . ... 72
LISTA DE ABREVIATURAS
[Ca2+] Concentração de Ca2+
[Ca2+]c Concentração citosólica de Ca2+
4Ca2+-CaM Complexo cálcio-calmodulina
AC Ciclase de adenilil
ACh Acetilcolina
ANOVA Análise de variância
ATP Trifosfato de adenosina
BKCa Canais de potássio de grande condutância ativados pelo
cálcio
CaM Calmodulina
cAMP Monofosfato cíclico de adenosina
CaV Canais de cálcio dependentes de voltagem
CaV1 Canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo 1
CBiotec Centro de Biotecnologia
CCh Carbacol
CCS Centro de Ciências da Saúde
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
CE50 Concentração de uma substância que produz 50% de seu
efeito máximo
cGMP Monofosfato cíclico de guanosina
CI50 Concentração de uma substância que inibe 50% do efeito
máximo produzido por um agonista
CPI-17 Proteína inibitória de 17 kDa
CsCl Cloreto de césio
DMSO Dimetilsufóxido
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco
e.p.m. Erro padrão da média
Emax Efeito máximo
Gq/11 Proteína Gq ou proteína G11
G12/13 ProteínaG12 ou proteína G13
Gq Subunidade α da proteína Gq
GC Ciclase de guanilil
GPCRs Receptores acoplados à proteína G
GDP Difosfato de guanosina
GTP Trifosfato de guanosina
HBSS Solução salina balanceada de Hank
HEPES Ácido N-[2-hidroxietilpiperazina-N’-[2-etanosulfônico] IP3 1,4,5-trisfosfato de inositol
IP3 R Receptor de IP3
KATP Canais de potássio sensíveis ao ATP
KCa Canais de potássio ativados por cálcio
Kv Canais de potássio dependentes de voltagem
M Concentração molar (mol/L)
MLCK Cinase da cadeia leve da miosina
MLCP Fosfatase da cadeia leve da miosina
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio
MYPT1 Subunidade 1 de ligação da fosfatase da miosina
PBS Solução de tampão fosfato de sódio
PC Fosfatidilcolina
PPgPNSB Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos
PIP 4-monofosfato de fosfatidilinositol
PIP2 4,5-bisfosfato de fosfatidilinositol
PKA Proteína cinase A
PKC Proteína cinase C
PKG Proteína cinase G
PLC Fosfolipase C
PLD Fosfolipase D
PMCA Ca2+-ATPase da membrana plasmática
PP1c Subunidade catalítica da proteína fosfatase 1
PSS Solução salina fisiológica
rMLC Cadeia leve regulatória da miosina
RFU Unidade de fluorescência relativa
RhoA Pequena proteína G ligante de GTP
RhoGEF Fator de troca de nucleotídeo guanina da Rho
ROK Proteína cinase associada à Rho
RS Retículo sarcoplasmático
RyR Receptor de rianodina
SERCA Ca2+-ATPase do retículo endosarcoplasmático
sGC Ciclase de guanilil solúvel
SKCa Canais de potássio de pequena condutância ativados por
cálcio
TEA+ Íon tetraetilamônio
XF-OE Óleo essencial das folhas de Xylopia frutescens
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 28
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 31
2.1 Os produtos naturais e o avanço da fitoterapia no Brasil ... 32
2.2 A família Annonaceae ... 34
2.3 O gênero Xylopia e a espécie Xylopia frutescens Aubl. ... 35
2.4 Os óleos essenciais ... 39
2.5 Regulação da contração e do relaxamento do músculo liso ... 41
3 OBJETIVOS ... 50
3.1 Geral... 51
3.2 Específicos ... 51
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 52
4.1 Material ... 53
4.1.1 Produto-teste ... 53
4.1.2 Animais ... 53
4.1.3 Substâncias e reagentes ... 54
4.1.4 Soluções nutritivas ... 55
4.1.5 Equipamentos ... 57
4.2 Métodos ... 58
4.2.1 Preparação da solução-estoque ... 58
4.2.2 Investigação do mecanismo de ação do XF-OE em íleo de cobaia ... 59
histamina ... 60
4.2.2.3 Avaliação do envolvimento dos canais de potássio no efeito relaxante promovido pelo XF-OE ... 60
4.2.2.3.1 Efeito do XF-OE sobre as contrações tônicas induzidas por histamina na presença do cloreto de césio (CsCl) ... 60
4.2.2.4 Avaliação da participação dos canais de cálcio dependentes de voltagem no efeito relaxante produzido pelo XF-OE ... 61
4.2.2.4.1 Efeito do XF-OE frente às contrações cumulativas induzidas por CaCl2 em meio despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem Ca2+ ... 61
4.2.2.4.2 Efeito do XF-OE sobre as contrações tônicas induzidas pelo S-(-)-Bay K8644 ... 62
4.2.2.5 Avaliação do efeito do XF-OE sobre a camada muscular circular do íleo de cobaia ... 62
4.2.2.5.1 Efeito do XF-OE frente às contrações fásicas induzidas por histamina na camada circular ... 62
4.2.2.6 Efeito do XF-OE sobre os miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia .. ... 63
4.2.2.6.1 Cultura de miócitos do íleo de cobaia... 63
4.2.2.6.2 Efeito do XF-OE sobre a viabilidade celular dos miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia ... 64
4.2.2.6.3 Avaliação do efeito do XF-OE sobre a [Ca2+]c ... 65
4.3 Análise estatística ... 65
5 RESULTADOS ... 67
5.1 Investigação do mecanismo de ação do XF-OE em íleo de cobaia ... 68
5.1.2 Efeito do XF-OE sobre as contrações tônicas induzidas por KCl ou por histamina ... 70
5.1.3 Avaliação do envolvimento dos canais de potássio no efeito relaxante promovido pelo XF-OE ... 73
5.1.3.1 Efeito do XF-OE sobre as contrações tônicas induzidas por histamina na presença do cloreto de césio (CsCl) ... 73
5.1.4 Avaliação da participação dos canais de cálcio dependentes de voltagem no efeito relaxante produzido pelo XF-OE ... 76
5.1.4.1 Efeito do XF-OE frente às contrações cumulativas induzidas por CaCl2 em meio despolarizante (KCl 70 mM) nominalmente sem Ca2+ ... 76
5.1.4.2 Efeito do XF-OE sobre as contrações tônicas induzidas pelo S-(-)-Bay K8644
... 78
5.1.5 Avaliação do efeito do XF-OE sobre a camada muscular circular do íleo de cobaia ... 81
5.1.5.1 Efeito do XF-OE frente às contrações fásicas induzidas por histamina na camada circular ... 81
5.1.6 Efeito do XF-OE sobre os miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia .84
5.1.6.1 Efeito do XF-OE sobre a viabilidade celular dos miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia ... 84
5.1.6.2 Avaliação do efeito do XF-OE sobre a [Ca2+]c ... 86
6 DISCUSSÃO ... 89
7 CONCLUSÕES ... 100
REFERÊNCIAS ... 102
APÊNDICE ... 119
Souza, I. L. L. 29 Introdução
A natureza tem servido como fonte de medicamentos por milênios, sendo muitas drogas desenvolvidas a partir de fontes vegetais (CRAGG; NEWMAN, 2013). Em virtude dos seus efeitos terapêuticos, os compostos vegetais são comumente utilizados pela população (VIDO, 2009). No entanto, como diversas espécies vegetais utilizadas na medicina empírica não possuem seu efeito farmacológico elucidado, o conhecimento popular destes produtos naturais tornou-se a base e o direcionamento para muitos estudos (MONTES et al., 2009).
As pesquisas envolvendo plantas medicinais aumentam mundialmente devido a fatores como a exigência da população por um modelo de vida mais saudável e natural (NEGRI, 2007). A despeito disso, estima-se que apenas 15% das 300 mil espécies de plantas no mundo tenham sido submetidas a algum estudo científico para avaliar seu potencial na preparação de novos produtos (BRANDÃO et al., 2010).
Apesar dos obstáculos presentes no desenvolvimento de fármacos baseados em derivados de plantas, o interesse da indústria farmacêutica pela procura de substâncias vegetais biologicamente ativas foi reativado na década de 90 (WALSH; FISCHBACH, 2010). Além disso, a utilização de técnicas modernas de isolamento e identificação de compostos químicos obtidos de fontes naturais tem propiciado um aumento na descoberta de novas estruturas químicas (BRANDÃO et al., 2010).
Paralelo a esse progresso, desenvolveram-se modelos de triagem farmacológica que permitem testar, in vitro e in vivo, compostos químicos frente
a alvos biológicos específicos, favorecendo a obtenção de ferramentas farmacológicas e/ou de novos medicamentos utilizados no tratamento das diversas doenças que acometem a população.
Cerca de 3000 óleos essenciais são conhecidos, dos quais 300 são comercialmente importantes, especialmente nas indústrias farmacêutica, agronômica, alimentícia, sanitária, cosmética e de perfumaria. Alguns dos componentes isolados dos óleos essenciais são usados em perfumes, produtos de maquiagem, produtos sanitários, odontológicos, agrícolas, conservantes, aditivos alimentícios, bem como em remédios naturais (BAKKALI et al., 2008).
Dentre as famílias botânicas reconhecidas por fornecerem produtos naturais com aplicação terapêutica, enquadra-se a família Annonaceae, que apresenta diversas espécies odoríferas, devido à presença de óleos essenciais que são constituídos principalmente por compostos mono e sesquiterpênicos (FOURNIER; LEBOEUF; CAVÉ, 1999).
Dentro dessa família encontra-se a espécie Xylopia frutescens Aubl.,
que é popularmente utilizada como antidiarreica, estimulante da bexiga, anti-inflamatória, antimicrobiana e antirreumática (DUKE; VASQUEZ, 1994; TAKAHASHI et al., 1995; BRAGA et al., 2000). Em estudos preliminares, o óleo essencial de Xylopia frutescens apresentou atividade espasmolítica não
seletiva em íleo e traqueia de cobaia, útero de rata e aorta de rato, apresentando maior eficácia e potência espasmolítica na musculatura lisa intestinal (CORREIA, 2013).
Nesse sentido, o interesse em investigar os óleos essenciais com atividade sobre a musculatura lisa reside no fato de que substâncias espasmolíticas têm uma vasta aplicação em vários processos fisiopatológicos cuja contração anormal está envolvida, tais como a asma brônquica, hipertensão arterial, disfunção erétil e diarreia (WEBB, 2003).
Diante do exposto, nesse trabalho foi investigado o mecanismo de ação pelo qual o óleo essencial das folhas de Xylopia frutescens atua sobre as vias
2.1 Os produtos naturais e o avanço da fitoterapia no Brasil
O processo evolutivo proporcionou diversos avanços ao longo do tempo, dentre estes, destaca-se a seleção de plantas não apenas com fins alimentícios, mas também para o alívio de inúmeras doenças. Diante disso, vários povos passaram a dominar o conhecimento sobre a utilização de plantas medicinais (FERREIA; PINTO, 2010).
A história do desenvolvimento dos medicamentos registra que os materiais vegetais eram inicialmente utilizados in natura e, em seguida,
passaram a ser concentrados para melhora da intensidade e uniformidade de suas ações (AURICCHIO; BACCHI, 2003). Nesse contexto, os produtos de origem natural, especialmente os derivados de plantas, desempenham um papel importante nos processos de descoberta e desenvolvimento de medicamentos, seja como produtos diretos ou a partir de substâncias fornecidas por eles, desempenhando um papel fundamental na pesquisa farmacológica e na proteção à saúde (NEWMAN; CRAGG, 2012).
Em uma extensa análise de novas drogas introduzidas no mercado entre 1981 e 2010, apenas 36% das 1073 novas entidades químicas podem ser classificadas como verdadeiramente sintéticas (NEWMAN; CRAGG, 2012). Dessa forma, destacam-se mais de uma centena de compostos derivados de produtos naturais em fase de testes clínicos, principalmente para o tratamento do câncer e de doenças infecciosas (BUTLER, 2008), e um total de 13 fármacos derivados de produtos naturais que foram aprovados para utilização clínica entre 2005 e 2007 (HARVEY, 2008).
Nesse sentido, as plantas medicinais tornaram-se um foco crescente de importância global, apresentando repercussões tanto sobre a saúde mundial como no comércio internacional (BALBINO; DIAS, 2010).
Souza, I. L. L. 33 Fundamentação teórica
Em consonância com o exposto, no ano de 2012, o Ministério da Saúde lançou o Caderno de Atenção Básica 31 que possui como subtítulo: “Plantas εedicinais e Fitoterapia na Atenção Básica”. O documento contém o histórico
das políticas nacionais e informações sobre normas, serviços e produtos relacionados à fitoterapia na Estratégia Saúde da Família/Atenção Básica. Neste, busca-se a implantação de novos programas no Sistema Único de Saúde (SUS), com melhoria do acesso da população a produtos e serviços seguros e de qualidade; sensibilizar e orientar gestores e profissionais da saúde na formação e implantação de políticas, programas, projetos e estruturas que visam fortalecer a fitoterapia, com ênfase na atenção básica (BRASIL, 2012). Atualmente, 12 medicamentos fitoterápicos estão disponibilizados na rede pública de saúde para aliviar a dor, a inflamação e doenças como a síndrome do intestino irritável, que pode ser tratada com o “plantago” (Plantago ovata Forssk) e com a “hortelã” (Mentha piperita) (BRASIL, 2014).
Segundo a Resolução de Diretoria Colegiada nº 14 de 31 de março de 2010, medicamento fitoterápico é aquele obtido empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas vegetais, cuja eficácia e segurança são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, de sua utilização, de documentações tecnocientíficas ou de evidências clínicas. São caracterizados pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade, não sendo considerado medicamento fitoterápico aquele que inclui na sua composição substâncias ativas isoladas, sintéticas ou naturais, nem as associações dessas com extratos vegetais. Esta resolução possui como objetivo, estabelecer os requisitos mínimos para o registro de medicamentos fitoterápicos e revoga a RDC nº 48 de 16 de março de 2004 (BRASIL, 2010).
para distúrbios vestibulares e cerebrais, o Laitan® (Piper methysticum) indicado como ansiolítico (SCHULZ; HANSEL; TYLER, 2002) e o Acheflan® (Cordia
verbenacea DC.) indicado como anti-inflamatório de uso tópico (HENRIQUE;
SIMÕES-PIRES; APEL, 2009).
Sendo assim, a utilização de medicamentos fitoterápicos pela população brasileira aumentou ao longo da última década em razão do resgate e da valorização do conhecimento e da cultura popular, bem como pelo incentivo por parte do governo federal. No entanto, fazem-se necessários estudos visando respaldar os conhecimentos etnomedicinais e/ou pesquisar drogas complexas que possam se tornar futuros fitoterápicos.
2.2 A família Annonaceae
A família Annonaceae foi descrita por Antoine Laurent de Jussieu, em 1789,e representa uma das mais uniformes tanto do ponto de vista anatômico como estrutural (HUTCHINSON, 1973). Medra principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do globo (Figura 1) e apresenta aproximadamente 135 gêneros e 2.500 espécies, ocorrendo como árvores aromáticas, arvoretas ou lianas (CHATROU; RAINER; MAAS, 2004).
No Brasil essa família apresenta 29 gêneros e 388 espécies, distribuídas nas florestas atlântica e amazônica, caatinga, cerrado e pantanal (MASS; LOBÃO; RAINER, 2012). No estado da Paraíba, segundo levantamento realizado no Herbário JPB sobre Annonaceae, registraram-se sete gêneros e 12 espécies (PONTES; BARBOSA; MASS, 2004).
As espécies desta família são conhecidas, principalmente, por seus frutos comestíveis e saborosos, tais como pinha, fruta-do-conde ou ata (Annona squamosa L.) e graviola (Annona muricata L.). Já os frutos das
espécies Xylopia aethiopica A. Rich. e Xylopia aromatica (Lam.) Mart., são
Souza, I. L. L. 35 Fundamentação teórica
Figura 1 - Mapa de distribuição da família Annonaceae no mundo, representada pelas áreas coloridas, com gradação de cor segundo a ocorrência.
(Fonte: adaptado de tropicos.org, acesso em 29 de janeiro de 2014)
Essa família é muito rica na diversidade de substâncias químicas, sendo caracterizada pela presença de terpenoides (especialmente diterpenos) e alcaloides (um grande número são derivados isoquinolínicos) (LEBOEUF et al., 1982a; SILVA et al., 2009).
Apesar desses estudos, o número de espécies da família Annonaceae investigada química e farmacologicamente é reduzido. Dentre as 2.500 espécies distribuídas em 135 gêneros, apenas 150 espécies em 41 gêneros foram estudadas até levantamento realizado em 2005 (LOBÃO; ARAÚJO; KURTZ, 2005).
2.3 O gênero Xylopia e a espécie Xylopia frutescens Aubl.
O gênero Xylopia, considerado um dos maiores da Annonaceae, possui
Figura 2 - Mapa de distribuição do gênero Xylopia no mundo, representada pelas áreas coloridas, com gradação de cor segundo a ocorrência.
(Fonte: adaptado de tropicos.org, acesso em 29 de janeiro de 2014)
O primeiro relato da constituição química de espécies do gênero
Xylopia foi publicado em 1953 e descreve o isolamento de diterpenos da
espécie X. aethiopica (Dunal) A. Rich (FAHIM et al., 1953). Em seguida, um
grande número de componentes químicos tem sido isolado de espécies pertencentes a esse gênero, destacando-se os alcaloides (HARRIGAN et al., 1994; COSTA et al., 2013), os flavonoides (VEGA et al., 2007), os diterpenos (ANDRADE et al., 2003; SOH et al., 2013; SANTOS et al., 2013) e os sesquiterpenos (MOREIRA et al., 2007).
Algumas espécies desse gênero são conhecidas por seus usos populares, como por exemplo, X. aethiopica (Dunal) A. Rich que possui frutos
que são usados como carminativo, tônico pós-parto, para o tratamento de distúrbios estomacais e biliares, bronquite e disenteria (ASFAW; DEMISSEW, 1994), X. brasiliensis Spreng., usada como analgésico e sedativo (MOREIRA et
al., 2003), e X. aromatica utilizada para tratamento de doenças de pele e como
diurética (TAKAHASHI et al., 2006).
Souza, I. L. L. 37 Fundamentação teórica
Hook.f. & Thoms. (PUVANENDRAN et al., 2008), leishmanicida e tripanossomicida induzida por vários extratos obtidos de X. aromatica (Lam.)
Mart. (OSORIO et al., 2007), hipotensora induzida pelo extrato hidroalcoólico do caule de X. cayennensis (NASCIMENTO et al., 2006) e efeitos
cardiovascular e diurético exercidos pelos diterpenos isolados de X. aethiopica
(SOMOVA et al., 2001).
A espécie X. langsdorfiana apresenta diversas atividades
farmacológicas, como por exemplo antidiarreica em camundongos (SILVA, 2010) e gastroprotetora em ratos (MONTENEGRO et al., 2011). Além disso, várias evidências dessas atividades farmacológicas foram atribuídas aos terpenos. O ácido 8(17),12E,14-labdatrieno-18-oico (labdano-302) apresentou atividade espasmolítca em útero de rata, aorta de rato, íleo e traqueia de cobaia (RIBEIRO, 2003; RIBEIRO, 2007; MACÊDO, 2008; TRAVASSOS, 2010) e, possui atividade hipotensora e taquicárdica reflexa em ratos normotensos não anestesiados e efeito vasorrelaxante em artéria mesentérica superior de ratos (OLIVEIRA et al., 2006).
O ácido ent-7-acetoxitraquiloban-18-oico (traquilobano-360), um
diterpeno do tipo traquilobano também foi isolado de X. langsdorfiana, e
apresenta atividade antitumoral em células leucêmicas (SILVA et al., 2005), atividade moluscicida frente ao caramujo Biomphalaria glabrata (QUEIROGA et
al., 2006), atividade antinociceptiva no modelo de contorção abdominal em camundongos Swiss (CUPERTINO-SILVA et al., 2006), atividade antitumoral
em células da linhagem sarcoma 180 (PITA et al., 2012), bem como, atividade espasmolítica em íleo de cobaia (SANTOS et al., 2012b,c).
Outro diterpeno da classe dos traquilobanos isolado dessa espécie, o ácido ent-7α-hidroxitraquiloban-18-oico (traquilobano-318), apresenta atividade
antitumoral em células da linhagem sarcoma 180 (PITA et al., 2009) e atividade espasmolítica em íleo e traqueia de cobaia (SANTOS et al., 2012b,c; MARTINS et al., 2013).
Em decorrência de inúmeras atividades farmacológicas descritas para espécies do gênero Xylopia, selecionou-se a Xylopia frutescens Aubl. (Figura
uma espécie nativa das Américas Central e do Sul, África e Ásia. Distribui-se nas regiões Norte, Centro-Oeste, Sudeste e Nordeste do Brasil (MASS; LOBÃO; RAINER, 2012).
Figura 3 - Foto de Xylopia frutescens Aubl. (A); detalhes de suas folhas (B).
(Fonte: Alex Popovkin, 2008. Em flickr.com/photos/plants_of_russian_in_brazil, acesso em 29 de janeiro de 2014)
Os frutos dessa espécie são utilizados popularmente como condimento substitutivo da pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) (DI STASI; HIRUMA-LIMA,
2002), por possuir a mesma composição de monoterpenos da P. nigrum, a
espécie X. frutescens pode ser usada como sucedâneo desta (ROCHA; SILVA;
PANIZZA, 1980). P. nigrum é amplamente utilizada pela população para várias
indicações terapêuticas, dentre elas, para o tratamento da diarreia, rouquidão, indigestão, problemas de fígado e doença pulmonar (RAO et al., 2011).
Há relatos da utilização popular de X. frutescens como estimulante da
bexiga, agente antimicrobiano, antirreumática (TAKAHASHI et al., 1995), anti-inflamatória (BRAGA et al., 2000) e antidiarreica (DUKE; VASQUEZ, 1994). Estudos fitoquímicos demonstram o isolamento de alcaloides das cascas da raiz (LEBOEUF et al., 1982b) e de seis diterpenos do tipo caureno dos frutos verdes, das cascas da raiz e das folhas dessa espécie (TAKAHASHI et al., 1995). A composição química do óleo essencial das folhas também foi descrito, sendo os constituintes majoritários o cariofileno (βγ,91%), -cadineno
Souza, I. L. L. 39 Fundamentação teórica
(1β,48%), -ocimeno (8,19%), cadin-4-en-10-ol (5,78%), viridiflorol (4,83%) e -elemeno (4,55%) (LUNGUINHO, 2012).
O extrato hexânico das sementes de X. frutescens apresentou atividade
inibitória da 5-lipoxigenase; além disso, o ácido caurenoico, um diterpeno do tipo caureno, abundante nas sementes dessa espécie apresentou atividade anti-inflamatória, justificando seu uso popular para o tratamento de processos inflamatórios (BRAGA et al., 2000; JENNET-SIEMS et al., 1999). O ácido caurenoico também apresentou atividade in vitro contra o protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas e também contra
cepas de Plasmodium falciparum resistentes à cloroquina, causador da malária
(MELO et al., 2001). O extrato das cascas dessa espécie apresentou moderada atividade antiviral, inibindo a protease do vírus da imunodeficiência humana (HIV-PR) (MATSUSE et al., 1999). O extrato etanólico das partes aéreas de X.
frutescens apresentou atividade antidiarreica (MORENO et al., 2013). O óleo
essencial das folhas dessa espécie apresentou atividade antifúngica (LIMA et al., 1992), tripanossomicida (SILVA et al., 2013), antitumoral (LUNGUINHO, 2012; FERRAZ et al., 2013) e espasmolítica (CORREIA, 2013).
2.4 Os óleos essenciais
Dentro do grupo dos produtos naturais, encontram-se os óleos essenciais, os quais são produzidos por plantas aromáticas, caracterizados por sua volatilidade, complexidade de componentes e forte odor. Eles podem ser sintetizados por todos os órgãos da planta, ou seja, broto, flor, folha, caule, ramo, semente, fruto, raiz e casca, sendo armazenados em células secretoras, canais, células da epiderme ou tricomas glandulares. Em geral, são obtidos por meio de hidrodestilação ou destilação a vapor, técnica conhecida desde a Idade Média, pelos povos árabes (BAKKALI et al., 2008).
Os óleos essenciais são constituídos basicamente por dois grupos de origem biossintética distintas: o principal grupo é constituído por terpenos e o outro é constituído por componentes alifáticos e aromáticos, ambos os grupos caracterizados por moléculas com baixo peso molecular (BAKKALI et al., 2008).
Os óleos essenciais ou algum de seus componentes são usados em perfumarias, produtos sanitários, ortodônticos, agronômicos e em indústria alimentícia (HENRIQUE et al., 2009), além de apresentarem propriedades medicinais (SILVA et al., 2003; HAJHASHEMI; GHANNADI; SHARIF, 2003; PERRY et al., 2003).
No Brasil, o produto à base de óleo essencial Acheflan® (Cordia
verbenaceae DC.) foi lançado no mercado, sendo indicado topicamente para o
tratamento de tendinite crônica e de dores miofaciais (HENRIQUE et al., 2009). Diversas atividades biológicas já foram descritas para essa classe de produtos naturais. Dentre estas, pode-se destacar: atividade antileishmania e imunomoduladora do óleo essencial de X. discreta (LÓPEZ; CUCA; DELGADO,
2009), antioxidante como sequestrador do ânion superóxido do óleo essencial de X. aethiopica (Dun) A. Rich. (KARIOTI et al., 2004), antitumoral do óleo
essencial de X. laevigata (QUINTANS et al., 2013), antinociceptivo do óleo
essencial de Artemisia dracunculus (MAHAM; MOSLEMZADEH;
JALILZADEH-AMIN, 2014) e atividade hipotensora do metileugenol, constituinte comum em óleos essenciais (LAHLOU et al., 2004).
Além dessas atividades, muitos óleos essenciais também apresentaram atividade espasmolítica, como os obtidos de Casimiroa pringlei em útero de
rata (ZAVALA et al., 2008), Zingiber roseum e Satureja obovata em duodeno de
rato (CRUZ et al., 1990; PRAKASH et al., 2006), Ocimum gratissimum e de
espécies do gênero Pelargoniums (Geraniaceae) em íleo de cobaia
(LIS-BALCHIN; HART; ROTH, 1997; MAGALHÃES; LAHLOU; LEAL-CARDOSO, 2004; MADEIRA et al., 2005), Pterodon polygalaeflorus em
traqueia de rato (EVANGELISTA et al., 2007), Mentha pulegium L. em traqueia
e bexiga de rato (SOARES et al., 2012), Lippia alba em duodeno e íleo de rato
Souza, I. L. L. 41 Fundamentação teórica
Rollinia leptopetala, X. langsdorfiana e X. frutescens em útero de rata, aorta de
rato, traqueia e íleo de cobaia (CORREIA, 2013).
Estudos recentes mostram que os óleos essenciais podem ser incluídos em lipossomas vetorizados, permitindo uma melhor definição da quantidade de droga aplicada. Dessa forma, os óleos essenciais podem ser trazidos do uso popular ao domínio da medicina moderna (BAKKALI et al., 2008).
2.5 Regulação da contração e do relaxamento do músculo liso
As células musculares lisas estão presentes nas paredes de vários órgãos ocos, tais como estômago, útero, vias aéreas, vasos sanguíneos, corpo cavernoso e intestino, tornando-se, assim, fundamental para homeostasia do organismo (WEBB, 2003). Anormalidades no processo de contratilidade do músculo liso acarretam doenças como hipertensão, asma, dispepsia, cólicas intestinais e uterinas, disfunção erétil e diarreia (KIM et al., 2008). Dessa forma, os modelos experimentais utilizando músculo liso despontam na investigação de substâncias potencialmente terapêuticas que possam ser utilizadas para o tratamento das doenças que acometem esse músculo.
Bioquimicamente, a entrada de íons Ca2+ nas células é responsável por iniciar eventos intracelulares, incluindo contração, secreção, transmissão sináptica, regulação enzimática, fosforilação e desfosforilação de proteínas e transcrição gênica (CATTERALL, 2011).
Em geral, existem duas fontes deste íon sinalizador na célula: uma extracelular, que permite o influxo de Ca2+ para o citoplasma através dos canais de cálcio dependentes de voltagem (CaV) (CATTERALL, 2011), e outra intracelular, representada pelos estoques intracelulares, principalmente o retículo sarcoplasmático (RS), que liberam Ca2+ para o citosol (MA; PAN, 2003). A entrada de Ca2+ no músculo liso é controlada, principalmente, pelo potencial de membrana, uma vez que este determina a abertura de CaV (SHMIGOL; EISNER; WRAY, 1998; WRAY et al., 2001)
Ca2+ no músculo liso e estão envolvidas na regulação de diferentes mecanismos de sinalização intracelular dependentes de Ca2+ (HEIZMANN, 1991). Entretanto, a calmodulina (CaM) é a mais conhecida das proteínas de ligação ao Ca2+ no músculo liso, apresentando alta afinidade pelo íon (DONATO, 1999 e 2001).
No músculo liso, um aumento na concentração citosólica de Ca2+ ([Ca2+]c) é a causa primária para a produção da contração. Esta elevação no conteúdo citosólico de Ca2+ também está envolvido na proliferação celular do músculo liso (HILL-EUBANKS et al., 2011). A regulação funcional da [Ca2+]c, para dar início a uma resposta contrátil no músculo liso depende de dois tipos de acoplamentos: um acoplamento eletromecânico, que está envolvido com a mudança do potencial de membrana (Vm), e outro acoplamento fármaco-mecânico, que acontece quando a contração promovida por um agonista é maior que a observada só com a mudança do Vm (REMBOLD, 1992).
O acoplamento eletromecânico leva a resposta contrátil através da despolarização de membrana diretamente associada ao aumento da concentração extracelular de potássio ([K+]e) (Figura 4) ou a ligação de bloqueadores dos canais de K+ (REMBOLD, 1996).
Para que um estímulo cause a transição do estado conformacional de um canal, deve-se fornecer energia. No caso dos canais dependentes de voltagem, a energia é suprida pela movimentação de cargas da região carregada da proteína do canal, o sensor de voltagem, por influência do campo elétrico da membrana. O movimento das cargas através do campo elétrico confere ao canal uma variação da energia livre, alterando seus estados fechado (C) e aberto (O). A transição entre estes dois estados requer em média, alguns milissegundos; todavia, quando iniciada, ela procede instantaneamente (cerca de 10 μs) originando variações abruptas da corrente
Souza, I. L. L. 43 Fundamentação teórica
Figura 4 - Acoplamento eletromecânico da contração muscular lisa pelo aumento da concentração extracelular de K+.
(Fonte: SOUZA, 2014)
1. Durante o repouso, o gradiente químico favorece o efluxo de íons K+ através de
seus canais de vazamento, deixando a região perimembranar interna das células musculares lisas polarizadas negativamente; 2. um aumento na [K+]
e diminui o efluxo
desses íons, havendo acúmulo de cargas positivas na região perimembranar interna; a célula despolariza, ocasionando a ativação dos CaV que leva ao influxo de Ca2+ com
consequente contração.
Figura 5 -Estrutura dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem (Ca
V) (A); detalhes
de suas subunidades (B).
(Fonte: CATTERALL, 2011)
A família dos CaV possui 10 membros, classificados segundo suas características funcionais como: os CaVL (CaV1.1, CaV1.2, CaV1.3 e CaV1.4),
cujo “δ” vem do inglês “long-lasting”, indicando que estes canais são lentos no seu processo de ativação/inativação levando a correntes prolongadas de Ca2+, sendo estes os principais CaV envolvidos na contração muscular lisa; os CaVP/Q (CaV2.1); os CaVN (CaV2.2); os CaVR (CaV2.3) e os CaVT (CaV3.1, CaV3.2 e CaV3.3) (CATTERALL, 2011).
Os CaV1 são sensíveis a diidropiridina e ativados por alta voltagem (ALEXANDER; MATHIE; PETERS, 2008). Uma importante localização desses canais, que são alvos de bloqueadores de canais de ca2+ usados na terapêutica, são as células musculares cardíacas (WATERMAN, 2000). Esses canais possuem como sítio de ligação para seus bloqueadores a subunidade 1 (KURIYAMA; KITAMURA; NABATA, 1995). Há predominância desses canais em musculatura lisa (CATTERALL, 2011).
Souza, I. L. L. 45 Fundamentação teórica
2003). O IP3 induz a liberação de Ca2+ do RS por ativar os receptores de IP3 (IP3R) e o DAG ativa a proteína cinase dependente de Ca2+ (PKC), que, por sua vez, leva a um aumento na [Ca2+]c através da ativação direta dos CaV ou, indiretamente, por inibição de canais de K+ presentes na membrana plasmática (FUKATA; AMANO; KAIBUCHI, 2001). O aumento na [Ca2+]c favorece a ligação do Ca2+ com a proteína CaM, formando o complexo 4Ca2+-CaM. Este complexo ativa a cinase da cadeia leve da miosina (MLCK), a qual fosforila a cadeia leve regulatória da miosina (rMLC), promovendo a interação dos filamentos de miosina com os de actina, desencadeando o processo de contração do músculo liso (Figura 6) (WEBB, 2003).
Figura 6 - Esquema do mecanismo fármaco-mecânico da contração no músculo liso pela ativação da via Gq/11-PδC 1.
(Fonte: CORREIA, 2013)
1. O agonista se liga ao seu receptor do tipo GPCR na membrana plasmática; 2. levando a troca do GDP por GTP na subunidade α das proteínas Gq/11 (não mostrado
na figura), tornando-se ativa; 3. a subunidade αq/11-GTP ativa a enzima PδC 1; 4. a PδC 1 cliva o fosfolipídio de membrana PIP2 em IP3 e DAG; 5. o IP3 migra pelo citosol
e ativa o IP3R presente no RS, liberando o Ca2+ do estoque; 6. o Ca2+ liberado ativa o
RyR, fazendo com que mais Ca2+ seja liberado para o citoplasma; 7. o Ca2+, junto com
o DAG ativam a PKC; 8. a PKC ativada fosforila os CaV promovendo o influxo de Ca2+;
9. o aumento da [Ca2+]
c aumenta a afinidade do Ca2+ pela CaM formando o complexo
4Ca2+-CaM e ativando a MLCK; 10. a MLCK ativada fosforila a rMLC que interage com
No RS há os receptores de rianodina (RyR), que são canais de Ca2+ sensíveis à cafeína, e que são ativados pelo Ca2+ previamente liberado via IP3R num processo denominado de liberação de Ca2+ induzida pelo Ca2+ (CICR) (MCHALE et al., 2006; DELLIS et al., 2006).
Estudos têm relatado uma via alternativa que contribui para a manutenção da contração no músculo liso, designada como via de sensibilização ao cálcio, uma vez que não depende da manutenção dos níveis elevados da [Ca2+]c. Esta via envolve a modulação da fosfatase da cadeia leve da miosina (MLCP), principalmente pela pequena proteína ligante de GTP (RhoA) e a sua cinase associada (ROK), uma proteína serina/treonina cinase (KARAKI et al., 1997; HORI; KARAKI, 1998). Vários agonistas contráteis, tais como a endotelina-I e a acetilcolina, que normalmente aumentam a [Ca2+]c via GPCRs (principalmente aqueles acoplados às proteínas Gq/11–ETA, ETB e M3, respectivamente) levam à ativação direta do fator trocador de nucleotídio de guanina da RhoA (RhoGEF) pelas proteínas G1β/1γα-GTP, que ativa a RhoA trocando o difosfato de guanosina (GDP) por trifosfato de guanosina (GTP) nessa proteína (SOMLYO; SOMLYO, 2003). A RhoA-GTP ativa sua cinase associada, a ROK, e esta, por sua vez, fosforila a subunidade MYPT1 da MLCP, tornando-a inativa, promovendo a manutenção do estado fosforilado da rMLC e, consequentemente, da força de contração (KIMURA et al., 1996).
A ROK também pode ativar uma proteína cinase independente de Ca2+, mais conhecida como proteína cinase de interação zíper (ZIPK). A ZIPK pode fosforilar diretamente a rMLC, no entanto seu alvo principal é o resíduo de Thr696 da MYPT1 o qual, quando fosforilado, inibe a ação da MLCP (MURTHY, 2006).
A CPI-17 (proteína inibitória de 17 kDa) serve como substrato tanto para a ROK como para a PKC. Quando fosforilada, a CPI-17 se liga à subunidade PP1c da MLCP para inibir a sua atividade enzimática e prolongar a contração do músculo liso (KITAZAWA et al.,2000).
Souza, I. L. L. 47 Fundamentação teórica
é desfosforilado a DAG levando a ativação sustentada da PKC (BERRIDGE, 2009). A ativação da PKC também pode ser dependente de Gq/11-PLC que forma DAG a partir da hidrólise do PIP2. A PKC pode fosforilar o resíduo de Thr38 da CPI-17, aumentando assim sua potência inibitória sobre a PP1c por mais de 1000 vezes, inibindo a ação da MLCP (SOMLYO; SOMLYO, 2003; MURTHY, 2006).
Se o aumento na [Ca2+]c gera a contração muscular, consequentemente o relaxamento ocorre por diminuição dos níveis deste íon no meio citosólico (SOMLYO; SOMLYO, 1994). Esta diminuição na [Ca2+]c pode ocorrer por um acoplamento eletromecânico, caracterizado pela repolarização ou pela hiperpolarização da membrana, ou ainda, pelo acoplamento fármaco-mecânico, que se dá pela ativação de receptores de membrana e inibição das vias bioquímicas que levam a contração (WOODRUM; BROPHY, 2001).
O acoplamento eletromecânico que leva ao relaxamento envolve a abertura de canais de K+, que desempenham um papel chave na regulação do potencial de repouso da membrana e na excitabilidade celular, sendo que a contração no músculo liso depende do balanço entre o aumento da condutância ao K+, gerando uma repolarização/hiperpolarização. Além disso, a hiperpolarização da membrana das células musculares lisas pode ser produzida por substâncias que abrem diretamente os canais de K+, como, por exemplo, a cromacalina, a levocromacalina e o nicorandil e, consequentemente, aumentam o efluxo de K+ da célula (KNOT; BRAYDEN; NELSON, 1996).
influxo de Ca2+ através dos CaV por sua inibição e, consequentemente, a uma redução da [Ca2+]c (LEDOUX et al., 2006; LIN et al., 2006).
Souza, I. L. L. 49 Fundamentação teórica
Figura 7 -Esquema do mecanismo fármaco-mecânico do relaxamento no músculo liso pela ativação da via Gs-AC-PKA e NO-sGC-PKG.
(Fonte: adaptado de CORREIA, 2013)
1. O agonista se liga ao seu receptor do tipo GPCR na membrana plasmática; 2. levando a troca do GDP por GTP na subunidade α da proteína Gs (não mostrado na
figura), tornando-se ativa; 3.ja subunidade αs-GTP ativa a AC; 4. a AC converte o ATP
em cAMP; 5. o NO gerado tanto dos nervos como das células musculares lisas estimula a atividade da sGC; 6. a sGC converte o GTP em cGMP; 7. o cAMP e o cGMP, ativam suas respectivas proteínas cinases, PKA e PKG. Ambas as proteínas cinases fosforilam vários substratos: 8. ativam os canais de K+; 9. inibem os Ca
V; 10.
aumentam a atividade da SERCA e da PMCA; 11. ativam do trocador Na+/Ca2+. Todos
esses mecanismos diminuem a [Ca2+]
c; 12. inibem a MLCK, reduzindo sua afinidade
pelo complexo 4Ca2+-CaM. Todos esses mecanismos impedem a ativação da rMLC e,
Souza, I. L. L. 51 Objetivos
3.1 Geral
Contribuir com o estudo farmacológico da família Annonaceae, em particular com o mecanismo de ação espasmolítica do óleo essencial das folhas de Xylopia frutescens Aubl. (XF-OE) em íleo de cobaia.
3.2 Específicos
Caracterizar a atividade espasmolítica do XF-OE em íleo de cobaia, em relação à(ao):
participação dos receptores histaminérgicos; modulação dos canais de potássio;
envolvimento dos canais de cálcio dependentes de voltagem, caracterizando o subtipo de CaV;
mobilização de Ca2+ intracelular;
viabilidade de miócitos da camada longitudinal;
Souza, I. L. L. 53 Material e métodos
4.1 Material
4.1.1 Produto-teste
A espécie Xylopia frutescens Aubl. foi coletada no município de João
Pessoa-PB, em abril de 2010. O material botânico foi identificado pela Profa. Dra. Maria de Fátima Agra, do setor de Botânica do Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos (PPgPNSB) do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da Universidade Federal da Paraíba (UFPB). Uma exsicata da planta está depositada no Herbário Prof. Lauro Pires Xavier (JPB)/UFPB sob código de identificação Agra 7249.
O óleo essencial das folhas obtido da espécie Xylopia frutescens foi
gentilmente cedido pelo grupo dos Profs. Drs. Josean Fechine Tavares e Marcelo Sobral da Silva, do Departamento de Ciências Farmacêuticas (DCF)/UFPB.
A composição química do óleo essencial foi analisada, onde os
componentes majoritários são: cariofileno (βγ,91%), -cadineno (12,48%), -ocimeno (8,19%), cadin-4-en-10-ol (5,78%), viridiflorol (4,83%) e -elemeno (4,55%) (LUNGUINHO, 2012).
4.1.2 Animais
Eram utilizados cobaias (Cavia porcellus) de ambos os sexos, pesando
entre 300 e 500 g, provenientes do Biotério Prof. Thomas George do Centro de Biotecnologia (CBiotec) da UFPB.
Antes dos experimentos, os animais eram mantidos sob rigoroso controle alimentar com uma dieta balanceada a base de ração (Labina®) com acesso a água ad libitum, ventilação e temperatura (21 1 C) controladas e
constantes, submetidos diariamente a um ciclo claro-escuro de 12 h, sendo o período claro das 6 às 18 h. Os experimentos eram realizados no período das 8 às 20 h. Todos os procedimentos experimentais eram realizados seguindo os
