Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos no teste de

habituação ao campo aberto

A análise de variância com medidas repetidas para o parâmetro locomoção revelou apenas efeitos significativos do fator exposição (1ª x 2ª exposição) [F(1,41)=4,98; p<0,05] e da interação tratamento (veículo x óleo de peixe) x exposição [F(1,41)=5,73; p<0,05]. De fato, o teste T para amostras pareadas revelou que os animais tratados com óleo de peixe, independentemente da condição experimental (controle x exercício físico forçado) apresentaram uma diminuição significativa na locomoção durante a 2ª exposição em relação à locomoção observada durante à 1ª exposição [T(10)=5,07 e 2,35; p<0,05, respectivamente] (Figura 1).

No que se refere à frequência de levantar, a análise de variância com medidas repetidas também revelou apenas efeitos significativos do fator exposição [F(1,41)=23,18; p<0,001] e das interações exposição x condição experimental [F(1,41)=4,37; p<0,05] e exposição x tratamento [F(1,41)=5,44; p<0,05]. Ainda, o teste T para amostras pareadas revelou que os animais tratados com óleo de peixe, independentemente da condição experimental (controle x exercício físico forçado) apresentaram uma diminuição significativa na frequência de levantar durante a 2ª exposição em relação à 1ª exposição [T(10)= 5,06 e 2,31; p<0,05, respectivamente] (Figura 2).

29 4.1.1 Desempenho de ratos jovens no teste de habituação ao Campo Aberto

A comparação entre a 1ª x 2ª exposição para o parâmetro de locomoção total por meio do teste T pareado revelou diferença significativa entre as exposições [T(11)=2,62; p<0,05]. O mesmo ocorreu para a freqüência de levantar [T(11)=6,18; p<0,001]. Isto mostra que houve uma diminuição destes parâmetros entre ambas as exposições.

30

Figura 1  Locomoção (média ± SE) durante 1ª e a 2ª exposições ao campo

aberto de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe- controle (OMG-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe- exercício (OMG-EX, n=12). A análise com medidas repetidas revelou efeitos do fator exposição e da interação exposição x tratamento.

*p<0,05 em relação à 1ª exposição ao campo aberto (Teste T para amostras pareadas).

31

Figura 2  Frequência de levantar (média ± SE) durante 1ª e a 2ª exposições

ao campo aberto de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12). A análise com medidas repetidas revelou efeitos do fator exposição e das interações exposição x condição e exposição x tratamento.

*p<0,05 em relação à 1ª exposição ao campo aberto (Teste T para amostras pareadas).

32 4.2 Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos no teste de reconhecimento de objetos

Na sessão de teste (realizada 3 horas após a sessão de treino), o teste T para amostras pareadas revelou que todos os animais, independentemente do tratamento e/ou da condição experimental, exploraram significativamente mais o objeto novo em relação ao objeto conhecido durante a sessão de treino (para os grupos VCL-CTL, OP-CTL e VCL-EX [T(10)=3,48, 3,99 e 3,75; p<0,005, respectivamente] para o grupo OP-EX [T(11)=3,83; p<0,005]) (Figura 3).

Na sessão de reteste (realizada 7 dias após a sessão de treino), o teste T para amostras pareadas revelou que apenas os animais tratados com óleo de peixe, independentemente da condição experimental (OP-CTL e OP-EX), exploraram significativamente mais o objeto novo em relação ao objeto conhecido durante a sessão de treino (para o grupo OP-CTL [T(10)=2,52; p<0,05] e para o grupo OP-EX [T(11)=3,10; p<0,05]) (Figura 4).

33

Figura 3  Tempo de exploração (média ± SE) dos objetos durante a sessão

de teste de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (Teste T para amostras pareadas).

34

Figura 4  Tempo de exploração (média ± SE) dos objetos durante a sessão

de reteste de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (Teste T para amostras pareadas).

35 4.3 Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos na esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado

Na sessão de treino, a análise de variância de três vias revelou efeitos significativos do fator braço (aversivo x não-aversivo) [F(1,82)=263,92; p<0,001] e da interação braço x tratamento (veículo x óleo de peixe) [F(1,82)=5,98; p<0,02]. De fato, o teste de post hoc de Duncan revelou que todos os animais aprenderam a discriminar os braços fechados (Figura 5).

Ainda durante a sessão de treino, a ANOVA de duas vias não revelou quaisquer diferenças significativas entre os grupos no que concerne a porcentagem de tempo nos braços abertos (Figura 6) ou ao número de entradas em todos os braços do aparelho (Figura 7).

Na sessão de teste, realizada 7 dias após a sessão de treino e na ausência dos estímulos aversivos, a análise de variância de três vias revelou efeitos significativos do fator braço (aversivo x não-aversivo) [F(1,82)=13,24; p<0,001] e da interação braço x condição experimental (controle x exercício físico forçado) [F(1,82)=4,62; p<0,05]. De fato, o teste de post hoc de Duncan revelou que apenas os animais submetidos ao exercício físico forçado (VCL-EX e OP-EX) discriminaram os braços fechados, demonstrando retenção da tarefa (Figura 8).

Ainda durante a sessão de teste, a ANOVA de duas vias não revelou quaisquer diferenças significativas entre os grupos no que concerne a porcentagem de tempo nos braços abertos (Figura 9) ou ao número de entradas em todos os braços do aparelho (Figura 10).

36 4.3.1 Desempenho de ratos jovens no teste da esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado

Na sessão de teste, realizada 7 dias após a sessão de treino, o teste T para amostras pareadas revelou diferenças significativas na exploração dos braços fechados (aversivo x não-aversivo) [T(11)=3,91; p<0,005], demonstrando retenção da tarefa.

37

Figura 5  Tempo de permanência (média ± SE) nos braços fechados não-

aversivo (NAv) e aversivo (Av) do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de treino de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (ANOVA de três vias seguida do teste de Duncan).

38

Figura 6  Porcentagem de tempo (média ± SE) nos braços abertos do

aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de treino de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (ANOVA de duas vias).

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Figura 7  Número de entradas (média ± SE) em todos os braços do aparelho

de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de treino de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe- controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe- exercício (OP-EX, n=12) (ANOVA de duas vias).

40

Figura 8  Tempo de permanência (média ± SE) nos braços fechados não-

aversivo (NAv) e aversivo (Av) do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de teste de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe -controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (ANOVA de três vias seguida do teste de Duncan).

41

Figura 9  Porcentagem de tempo (média ± SE) nos braços abertos do

aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de teste de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (ANOVA de duas vias).

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Figura 10  Número de entradas (média ± SE) em todos os braços do aparelho

de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de teste de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe- controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) óleo de peixe- exercício (OP-EX, n=12) (ANOVA de duas vias).

43 4.4 Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos no teste de reatividade ao choque

A análise de variância de três vias para os escores do teste de reatividade ao choque nas patas revelou efeitos significativos apenas do fator intensidade do choque [F(5,205)=94,65; p=0,001], demonstrando que, independentemente do tratamento veículo x óleo de peixe e/ou da condição experimental controle x exercício físico, os animais apresentaram um aumento progressivo de mesma magnitude na reatividade ao choque à medida que a intensidade foi aumentada (Figura 11).

44

Figura 11  Escore (média ± SE) de reatividade ao choque nas patas de ratos

tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12). A análise com medidas repetidas revelou efeitos do fator intensidade do choque.

45

5. DISCUSSÃO

Em nosso estudo verificamos que a suplementação prolongada com óleo de peixe, rico em ácido graxo ômega-3, iniciada no período pré-natal até a maturidade dos ratos, foi capaz de favorecer a persistência da memória de habituação à arena de campo aberto, bem como a persistência da memória de reconhecimento de objetos. Verificamos também que o exercício físico forçado realizado desde a fase de desenvolvimento até a maturidade apresentou efeitos promnésticos na tarefa de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado. Porém não houve interação entre o exercício físico e a suplementação com óleo de peixe sobre os diferentes tipos de tarefas comportamentais analisadas.

Nesse contexto, de nosso conhecimento, apenas um estudo aborda sistematicamente a interação entre o exercício físico voluntário em roda e a suplementação alimentar com DHA sobre a memória espacial de ratos adultos (Wu e colaboradores, 2008). Especificamente, ratos adultos jovens foram expostos a uma dieta enriquecida com DHA e alojados em gaiolas com ou sem roda para a execução de exercício físico voluntário ao longo de uma semana e submetidos, ao final desse período, ao teste do labirinto aquático de Morris. A dieta enriquecida com DHA melhorou significativamente a memória espacial e tal efeito foi potencializado pelo exercício físico voluntário. Entretanto, esse estudo investigou apenas os efeitos de uma associação breve entre a suplementação de DHA e a atividade física voluntária em ratos adultos.

Do ponto de vista clínico, no que se refere ao exercício físico, estudos epidemiológicos embasam a hipótese de que o exercício físico voluntário pode

46 influenciar positivamente as funções cerebrais durante o processo de envelhecimento. Entretanto, tais estudos não distinguem o momento em que a atividade física deve se iniciar durante a vida do indivíduo (Churchill et al., 2002). Paralelamente, a suplementação com DHA parece melhorar o desempenho escolar de crianças (Portwood, 2006), bem como reduzir a incidência de distúrbios do humor em adultos (Jacka et al., 2004). Experimentalmente, apesar das evidências demonstrarem que tanto a suplementação de DHA quanto o exercício físico voluntário isoladamente melhoram a memória espacial de roedores maduros ou idosos (Carrie et al., 2000; Albeck et al., 2006), nenhum estudo abordou os efeitos de tal associação a partir do desenvolvimento até a maturidade sobre as funções cognitivas de ratos.

No primeiro experimento, verificamos os efeitos da suplementação do óleo de peixe, rico em ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, associada ou não ao exercício físico forçado sobre a habituação em campo aberto, uma tarefa de memória não-associativa. Essa tarefa consiste em expor os animais à arena de campo aberto para que os mesmos a explorem livremente. Na segunda exposição, os animais são expostos novamente à arena e sua habituação é avaliada por meio da diminuição progressiva na exploração, representada pela diminuição da locomoção e do ato de levantar (Izquierdo et al., 1999; Vianna et al., 2000). Nesse sentido, verificamos que somente os

ratos suplementados com óleo de peixe, rico em ômega-3,

(independentemente da realização do exercício físico forçado) apresentaram uma diminuição na exploração geral, ou seja, apresentaram uma diminuição

47 significativa tanto na locomoção total quanto na freqüência de levantar (Figuras 1 e 2).

O efeito benéfico da suplementação com ômega-3 (mas não do exercício físico forçado) parece ter sido decorrente de uma reversão do déficit de habituação apresentado pelo grupo controle tratado com solução veículo não exercitado (grupo VCL-CTL). De fato, esse grupo não apresentou diferenças significativas nos parâmetros locomoção total ou freqüência de levantar entre as duas exposições ao campo aberto sugerindo, assim, um déficit de habituação induzido pelo envelhecimento. Nesse sentido, para testarmos essa hipótese, submetemos ratos Wistar de 3 meses de idade (considerados adultos jovens) somente à tarefa de campo aberto (ou seja, sem qualquer tratamento prévio) e verificamos que esses animais apresentaram uma locomoção total e uma freqüência de levantar diminuídas durante a segunda exposição em relação à primeira, demonstrando habituação à arena de campo aberto.

Alternativamente, poder-se-ia argumentar que essa diminuição da exploração observada durante a segunda exposição do grupo suplementado com óleo de peixe ao campo aberto decorria de uma hipolocomoção induzida pela administração crônica de solução contendo ácidos graxos poliinsaturados ômega-3. Nesse sentido, Carrie e colaboradores (2000) demonstraram que a suplementação com óleo de peixe induziu um aumento da exploração apenas em camundongos jovens, mas não em maduros ou idosos. Ainda, Bourre e colaboradores (1989) não verificaram quaisquer alterações na reatividade à novidade ou na exploração do campo aberto de ratos alimentados com uma dieta deficiente em ômega-3. Nesse sentido, Moriguchi e colaboradores (2000)

48 observaram que enquanto os ratos submetidos a uma dieta adequada de ômega-3 apresentaram uma diminuição na deambulação, os ratos submetidos a uma dieta deficiente desse ácido graxo apresentaram um déficit de habituação. Finalmente, diversos estudos sugerem que ratos ou camundongos submetidos a uma dieta deficiente de ômega-3 apresentam déficits de habituação em diversos modelos (Frances et al., 1996; Federova & Salem, 2006). Um possível mecanismo para o entendimento da hiperatividade em animais com deficiência em ômega-3 pode ser relatado pela desregulação do sistema dopaminérgico (Federova & Salem, 2006). Delion e colaboradores (1996) estudaram as alterações no sistema dopaminérgico em animais com deficiência crônica em ácidos graxos ômega-3 e demonstraram uma diminuição na densidade dos receptores dopaminérgicos D2 e um aumento na densidade dos receptores serotoninérgicos 5-HT2 no córtex frontal de ratos, levando assim a uma diminuição nos níveis de dopamina no córtex frontal.

No que se refere à ausência de efeitos do exercício físico forçado sobre a habituação à arena de campo aberto, diferentes achados têm sido encontrados na literatura. Diversos trabalhos relatam efeitos benéficos do exercício físico em diversas tarefas, como o labirinto aquático de Morris (Van Praag et al., 1995, 2005; Vaynman et al., 2004; Uysal et al., 2005; Ang et al., 2006; Ding et al., 2006b), as esquivas passiva (Samorajski et al., 1985; Ogonovszky et al., 2005; Alaei et al., 2006; Radak et al., 2006) e ativa (Radak et al., 2001), o medo condicionado ao contexto (Baruch et al., 2004; Burghardt et al., 2006) e o labirinto radial (Scheweitzer et al., 2006), assim como estudos empregando tarefas similares relataram ausência de efeitos (Barnes et al., 1991; Bluestein et al., 2006; Hansalik et al., 2006) ou até mesmo efeitos

49 deletérios (Braszko et al., 2001; Bluestein et al., 2006). Ainda, evidências sugerem que a neurogênese induzida pelo exercício físico poderia influenciar apenas tarefas que precisam de uma maior participação do hipocampo (Shors et al., 2002). Nesse aspecto, a tarefa de habituação ao campo aberto parece depender também do estriado (McDonald and White, 1993; Morgado, 2005). Nesse sentido, nossos resultados não confirmam os achados de alguns estudos mostrando alterações comportamentais no campo aberto em animais submetidos a um programa de exercício físico (Burghardt et al., 2004, Mello et al., 2008, García-Capdevila et al., 2009).

Em 1988, Ennaceur e Delacour descreveram um novo teste de memória em ratos baseado na exploração diferencial de objetos já conhecidos e objetos novos. Esse teste tem várias características interessantes: é semelhante ao teste de reconhecimento visual amplamente utilizado em primatas, permitindo comparações entre espécies e é inteiramente baseado no comportamento espontâneo de ratos. Não envolve reforçadores primários, como alimentos ou choques elétricos, o que o torna comparável aos testes cognitivos aplicados atualmente em condições clínicas.

Na tarefa de reconhecimento de objetos, os resultados obtidos demonstraram que a memória de curto-prazo (avaliada 3 horas após a sessão de treino), não foi modificada nem pela suplementação com óleo de peixe, rico em ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, nem pelo exercício físico forçado e ou pela associação de ambos, visto que todos os animais demonstraram uma preferência de mesma magnitude pelo objeto desconhecido (Figura 3). No tocante à memória de longo-prazo (avaliada 7 dias após a sessão de treino), apenas os animais submetidos à suplementação com óleo de peixe,

50 independentemente da condição (exercício físico forçado), exploraram mais o objeto desconhecido (Figura 4).

De nosso conhecimento, não há relatos na literatura que investiguem os efeitos dos ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 sobre a memória de reconhecimento. Assim, hipoteticamente, poderíamos sugerir que a suplementação com óleo de peixe atuaria na persistência do traço de memória, uma vez que os animais do grupo controle (grupo VCL-CTL) ou submetidos apenas ao exercício físico forçado (VCL-EX) não discriminaram os objetos, demonstrando um déficit de retenção. Nesse aspecto, o avanço da idade parece estar associado a uma redução dos níveis cerebrais de DHA e, em conseqüência, a prejuízos na aquisição e na manutenção de memórias (Okuyama et al., 1996). De fato, Barcelo-Cobilijn e colaboradores (2003) observaram uma redução na função cognitiva de ratos idosos, acompanhada pela diminuição dos níveis cerebrais de DHA.

Como descrito anteriormente, diferentemente da suplementação com óleo de peixe, o protocolo de exercício físico forçado não promoveu quaisquer efeitos sobre o desempenho dos ratos no teste de reconhecimento de objetos. Evidências sugerem que o exercício físico forçado (O’Callaghan et al., 2007) ou voluntário (García-Capdevila et al., 2009) melhoram o desempenho de ratos adultos jovens na tarefa de reconhecimento de objetos. Tal discrepância poderia decorrer da idade dos animais (2 meses no estudo de O’Callaghan e 4 meses no estudo de García-Capdevila), do momento da realização (ambos realizados após a fase de desenvolvimento), da duração (7 dias no estudo de O’Callaghan e 30 dias no estudo de García-Capdevila), da natureza do exercício (forçado no estudo de O’Callaghan e voluntário no estudo de García-

51 Capdevila) e da intensidade do exercício físico. Especificamente no que se refere à intensidade do exercício físico, García-Capdevila e colaboradores (2009) ainda verificaram que uma baixa intensidade de exercício físico voluntário melhorou o reconhecimento de objetos enquanto que o mesmo exercício, com intensidades alta ou muito alta, não afetou ou prejudicou, respectivamente, o desempenho de ratos nessa mesma tarefa.

No terceiro experimento, buscamos avaliar os efeitos da suplementação com óleo de peixe associada ou não ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos na esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado. Um extenso leque de alterações comportamentais paralelas pode influenciar os processos de aquisição, processamento e armazenamento, bem como evocação, nos vários sistemas de memória. Nesse cenário, a esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado é um modelo comportamental capaz de avaliar as interações entre esses processos mnemônicos, a ansiedade e a atividade locomotora de roedores de maneira diferencial, porém integrativa e concomitantemente. Nesse modelo, o aprendizado é avaliado por meio da discriminação entre um braço fechado neutro e um braço fechado aversivo na sessão de treino (Silva & Frussa-Filho, 2000; Silva et al., 2002). Já o armazenamento da tarefa (e, conseqüentemente, os processos de consolidação e evocação) é detectado em cada grupo em uma sessão de teste subseqüente pela comparação direta entre o tempo de permanência no braço fechado que havia sido aversivo na sessão de treino e o braço fechado que não havia sido aversivo naquela sessão inicial. De fato, diferentes manipulações amnésticas aumentam a exploração desse braço (Claro et al., 1999; Silva et al., 1999; 2002a,b; 2004a,b; Silva & Frussa-Filho, 2000; 2002;

52 Calzavara et al., 2004; Patti et al., 2006, 2010; Kameda et al., 2007; Alvarenga et al., 2008; Niigaki et al., 2010; Zanin et al., dados submetidos) enquanto, procedimentos promnésticos diminuem o tempo de permanência no mesmo (Silva et al., 1997; 1999; Claro et al., 1999). Além disso, esse modelo comportamental permite a avaliação concomitante e independente dos níveis de ansiedade (por meio da esquiva aos braços abertos do aparelho) e da atividade locomotora (por meio do número de entradas em todos os braços do aparelho). Dessa forma, a efetividade do modelo em detectar os efeitos de fatores reconhecidamente ansiolíticos (Silva & Frussa-Filho, 2000; Calzavara et al., 2004) e ansiogênicos (Silva & Frussa-Filho, 2000; Silva et al., 2002a; Silva et al., 2004b) tem sido repetidamente demonstrada. Paralelamente, manipulações que conhecidamente aumentam ou diminuem a atividade locomotora foram capazes de aumentar (Silva et al., 2002a; Castro et al., 2005; Kameda et al., 2007) ou diminuir (Silva et al., 2002b; 2004; Carvalho et al., 2006) o número total de entradas nos braços do aparelho, respectivamente.

Conforme revisado por Frussa-Filho e colaboradores (2010), é importante notar que a esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado tem a vantagem ética de não envolver estímulos dolorosos, como choques