INFLUÊNCIA DO ÓLEO DE PEIXE E/OU DO EXERCÍCIO
FÍSICO FORÇADO SOBRE DIFERENTES TIPOS DE
MEMÓRIA EM RATOS TRATADOS DESDE O
DESENVOLVIMENTO ATÉ A FASE ADULTA
São Paulo 2011
Dissertação Apresentada à
Universidade Federal de São Paulo
– Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Mestre em
INFLUÊNCIA DO ÓLEO DE PEIXE E/OU DO EXERCÍCIO
FÍSICO FORÇADO SOBRE DIFERENTES TIPOS DE
MEMÓRIA EM RATOS TRATADOS DESDE O
DESENVOLVIMENTO ATÉ A FASE ADULTA
Orientador: Prof. Dr. RICARDO MÁRIO ARIDA
Co-orientadora: Profa. Dra. ROBERTA MONTERAZZO CYSNEIROS
São Paulo 2011
Dissertação Apresentada à
Universidade Federal de São Paulo
– Escola Paulista de Medicina para
obtenção do Título de Mestre em
Rachetti, Ana Lívia Ferri
Influência do óleo de peixe e/ou do exercício físico forçado sobre diferentes tipos de memória em ratos tratados desde o desenvolvimento até a fase adulta/ Ana Lívia Ferri Rachetti - São Paulo, 2011.
xiii, 85p.
Tese (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Neurologia e Neurocirurgia.
Título em inglês: Influence of fish oil and/or forced physical exercise on different types of memory in rats treated from development to adulthood
iv
DEPARTAMENTO DE NEUROLOGIA E NEUROCIRURGIA
Chefe do Departamento de Neurologia e Neurocirurgia
Prof. Dr. Mirto Nelso Prandini
Coordenadora do Curso de Pós-graduação em Neurologia/Neurociências
v
INFLUÊNCIA DO ÓLEO DE PEIXE E/OU DO EXERCÍCIO FÍSICO FORÇADO SOBRE DIFERENTES TIPOS DE MEMÓRIA EM RATOS TRATADOS DESDE
O DESENVOLVIMENTO ATÉ A FASE ADULTA
Orientador:
Prof. Dr. Ricardo Mário Arida
Co-orientadora:
Profa. Dra. Roberta Monterazzo Cysneiros
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Carlos Fernando Mello Prof. Dr. Roberto Frussa Filho Prof. Dr. Fúlvio Alexandre Scorza
Suplente:
Profa. Dra. Marly de Albuquerque
vi Esta dissertação foi realizada na Disciplina de Neurofisiologia e Fisiologia do Exercício do Departamento de Fisiologia da Universidade Federal
de São Paulo (UNIFESP) – EPM, durante o curso de Pós-Graduação em Neurologia-Neurociências, com o auxílio financeiro da CAPES, FAPESP e
vii
viii Com todo carinho,
aos meus pais Wagner e Fátima.
ix ensinamentos, pela confiança, pelo incentivo e apoio.
A Profa. Dra. Roberta Monterazzo Cysneiros, pela sua orientação e contribuição.
Ao Prof. Dr. Roberto Frussa Filho, por me receber no Departamento de
Farmacologia tão prontamente e colaborar com a conclusão deste trabalho.
Aos professores do Departamento de Neurologia e Neurocirurgia da
UNIFESP: Profa. Dra. Débora Amado Scerni, Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro, Prof. Dr. Fúlvio Alexandre Scorza, Profa. Dra. Maria da Graça
Naffah-Mazzacoratti, Profa. Dra. Maria José da Silva Fernandes.
Aos membros da banca examinadora: Prof. Dr. Carlos Fernando Mello, Prof. Dr. Fúlvio Alexandre Scorza, Profa. Dra. Marly de Albuquerque e Prof. Dr.
Roberto Frussa Filho.
A Camilla, Karina e Luciano por me ―adotarem‖ nesses últimos meses
com tanto carinho, por me ensinarem e me ajudarem a concluir este trabalho. Tenho certeza que meu obrigada ainda é muito pouco pela tamanha dedicação
e disposição. Como disse Fernando Pessoa: ―o valor das coisas não está no
tempo que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso, existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas
INCOMPARÁVEIS‖. Muito Obrigada de coração!
x Luiz Fernando, Michelle e Sérgio. Obrigada por compartilharem comigo as
alegrias, as lágrimas, as dúvidas e o aprendizado durante esses dois anos.
A todos os amigos e funcionários dos Departamentos de Neurologia, Fisiologia e Farmacologia, por me ajudarem a tornar este trabalho possível.
A minha família: meus pais Wagner e Fátima, ao meu irmão Gustavo e a minha cunhada Vanessa. Obrigada por estarem sempre comigo e mesmo
longe serem capazes de me fazer muito feliz!
Ao Gustavo pelo companheirismo, carinho, paciência e, sobretudo, pelo
xi
1. INTRODUÇÃO 1
1.1 Ácidos Graxos Poliinsaturados de Longa Cadeia (LCPUFAS) 1 1.1.1 Ômega-3 no Desenvolvimento Cerebral 5
1.1.2 Ômega-3 e Envelhecimento 7
1.2 Exercício Físico 8
1.2.1 Exercício Físico no Desenvolvimento Cerebral 9
1.2.2 Exercício Físico no Envelhecimento 10
1.3 Ômega-3 e Exercício Físico na Memória 12
2. OBJETIVOS 16
2.1 Objetivos Gerais 16
2.2 Objetos Específicos 16
3. MATERIAL E MÉTODOS 17
3.1 Sujeitos Experimentais 17
3.2 Suplementação com Óleo de Peixe 17
3.3 Programa de Exercício Físico Forçado (EX) 18
3.4 Grupos experimentais 20
3.5 Modelos Comportamentais de Avaliação da Memória 21 3.5.1 Teste de Habituação em Campo Aberto (CA) 21 3.5.2 Teste de Reconhecimento de Objeto (RO) 22 3.5.3 Esquiva Discriminativa em Labirinto em Cruz Elevado (ED-LCE) 24
3.6 Teste de Reatividade ao Choque 26
3.7 Análise Estatística 27
4. RESULTADOS 28
4.1 Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos no teste de habituação ao campo aberto
28
4.1.1 Desempenho de ratos jovens no teste de habituação ao campo aberto
29
4.2 Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos no teste de reconhecimento de objetos
xii discriminativa em labirinto em cruz elevado
4.3.1 Desempenho de ratos jovens no teste da esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado
36
4.4 Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos no teste de reatividade ao choque
43
5. DISCUSSÃO 45
6. CONCLUSÕES 59
6.1 Conclusões Específicas 59
6.2 Conclusão Geral 61
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 62
xiii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES E FIGURAS
Ilustração 1 – Vias de alongamento e dessaturação para os ácidos graxos ômega-3 e ômega-6
3
Ilustração 2 – Aparelho de esteira empregada no protocolo de exercício físico forçado
19
Ilustração 3 – Arena de campo aberto 22
Ilustração 4 – Teste de reconhecimento de objetos 24
Ilustração 5 – Aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado
26
Ilustração 6 – Aparelho de esquiva inibitória 27
Figura 1 – Locomoção durante 1ª e a 2ª exposições ao campo aberto de ratos
30
Figura 2 – Frequência de levantar durante 1ª e a 2ª exposições ao campo aberto de ratos
31
Figura 3 – Tempo de exploração dos objetos durante a sessão de teste da tarefa de reconhecimento de objetos de ratos
33
Figura 4 – Tempo de exploração dos objetos durante a sessão de reteste da tarefa de reconhecimento de objetos de ratos
xiv elevado durante a sessão de treino de ratos
Figura 6 – Porcentagem de tempo nos braços abertos do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de treino de ratos
38
Figura 7 – Número de entradas em todos os braços do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de treino de ratos
39
Figura 8 – Tempo de permanência nos braços fechados não-aversivo e aversivo do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de teste de ratos
40
Figura 9 – Porcentagem de tempo nos braços abertos do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de teste de ratos
41
Figura 10 – Número de entradas em todos os braços do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de teste de ratos
42
xv
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
% – porcentagem
∆ – delta
®– registrado
°C – grau Celsius
AA – Ácido Araquidônico ANOVA – Análise de Variância Av – Aversivo
BDNF – Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro CA – Campo Aberto
CH3– metil
cm – centímetro CTL – Controle
DHA – Ácido Docosahexaenóico DPA – Ácido Docosapentaenóico
ED-LCE – Esquiva Discriminativa em Labirinto em Cruz Elevado EFAs – Ácidos graxos essenciais
EPA – Ácido Eicosapentaenóico et al –et alli – e outros
EX – exercício
HO-C=O – ácido carboxílico Kg – Kilogramas
LCPUFAS – Ácidos Graxos Poliinsaturados de Longa Cadeia lx – lux
xvi NAv – Não-aversivo
nº – número OMG – Ômega
RO – Reconhecimento de Objetos s – segundos
SE – standard error
SNC – Sistema Nervoso Central VCL – Veículo
xvii A suplementação alimentar com óleo de peixe, rico em ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, assim como o exercício físico podem trazer benefícios para a saúde mental, função cognitiva, promoção da plasticidade
neuronal e proteção contra lesões neurológicas. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos cognitivos 1. da suplementação diária
e prolongada com 85 mg/Kg/dia de óleo de peixe, iniciada no período pré-natal e mantida até a maturidade de ratos; 2. de um programa de exercício físico
forçado em esteira rolante, iniciado no período de desenvolvimento e mantido até a maturidade de ratos e 3. da associação da suplementação de óleo de peixe com o programa de exercício físico forçado durante o mesmo período.
Dessa forma, quarenta e cinco ratos wistar machos foram distribuídos em quatros grupo experimentais: veículo controle (n=11), veículo exercício (n=11),
óleo de peixe controle (n=11) e óleo de peixe exercício (n=12). Ao alcançarem a maturidade (230 dias de idade), os animais foram submetidos às tarefas de habituação ao campo aberto, reconhecimento de objetos (240 dias de idade) e
esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado (250 dias de idade). Para uma avaliação da possível participação do efeito do estresse induzido pela
submissão prolongada à esteira rolante, o teste de reatividade ao choque também foi realizado (260 dias de idade).
Nossos resultados revelaram que a suplementação diária e prolongada
com óleo de peixe facilitou a manutenção (persistência) das memórias de longo-prazo de habituação ao campo aberto e reconhecimento de objetos, sem
xviii em campo aberto e de reconhecimento de objetos, foi capaz de facilitar a
persistência da memória de esquiva discriminativa. Tais efeitos promnésticos (tanto induzidos pela suplementação de óleo de peixe quanto pelo exercício físico) não foram acompanhados por alterações nos níveis de emocionalidade
ou atividade exploratória dos animais. A suplementação diária e prolongada com óleo de peixe e/ou exercício físico não alterou a reatividade ao choque nos
ratos, descartando a possibilidade do estresse do choque da esteira nos parâmetros cognitivos avaliados. No que concerne aos efeitos da associação
entre a suplementação com óleo de peixe e exercício físico, não verificamos sinergismo entre os efeitos cognitivos benéficos desses fatores nas tarefas avaliadas. Em conclusão, nossos resultados sugerem que o exercício físico,
quando realizado ao longo da vida, bem como a suplementação com óleo de peixe, quando realizada desde a fase pré-natal até a maturidade melhoram a
xix Both fish oil supplementation and physical exercise are able to induce benefits to mental health by providing an improvement in cognitive performance, enhancing neuroplasticity and protection against neurological
lesions. In this regard, the aim of the present study was to investigate the cognitive effects of 1. a diary and prolonged 85 mg/Kg/day fish oil
supplementation initiated at the prenatal period until the maturity; 2. mild forced physical exercise in treadmill initiated during the development until the
adulthood and 3. association of fish oil supplementation and forced physical exercise protocol during the same period. Forty five male Wistar rats were divided into 4 groups: control vehicle (n=11), exercise vehicle (n=11), fish oil
control (n=11) and exercise fish oil (n=12). On 230-day-old were submitted to the habituation in the open-filed, object recognition (240-day-old) and to the
plus-maze discriminative avoidance tasks (250-day-old). After the cognitive tasks, rats were also submitted to the shock reactivity test (260-day-old) in order to discard a possible influence of the stress-induced effects on cognitive
performance after a prolonged exposure to the treadmill apparatus.
Our results demonstrated that a diary and prolonged fish oil
supplementation can facilitate the persistence of the long-term habituation and recognition memories without, however, affecting the discriminative avoidance memory. Conversely, although the program of forced physical exercise exerted
no effects on habituation or objects recognition, it was able to potentiate the persistence of the discriminative avoidance memory. Such promnestic effects
xx prolonged exposure to the treadmill apparatus nor fish oil supplementation (or
their association) altered shock reactivity, ruling out the possible stressing effects induced by the physical exercise protocol on the cognitive parameters evaluated. Additionally, no synergic cognitive effects induced by the association
between fish oil supplementation and physical exercise were observed. In conclusion, our findings suggest that fish oil supplementation, initiated at the
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Ácidos Graxos Poliinsaturados de Longa Cadeia (LCPUFAS)
O estado nutricional é uma condição importante no desenvolvimento, organização e na manutenção do sistema nervoso central (SNC), estando
diretamente relacionado ao fornecimento de nutrientes e à produção de energia necessários para o desenvolvimento e manutenção de estruturas celulares e
dos vários sistemas metabólicos (Morgane et al., 1992).
Presentes em quase todos os alimentos e em diversas espécies, os componentes lipídicos, além de serem considerados fontes importantes de
energia para o organismo (Vieira et al., 1995; Martin et al., 2006), também são críticos para a formação da barreira hidrofóbica que permite a partição do
conteúdo aquoso das células e estruturas subcelulares (Champe, 1996), dos hormônios esteróides, para a produção de mensageiros intracelulares e extracelulares (os eicosanóides), entre outras funções (Lehninger et al., 1995).
Os lipídeos apresentam a propriedade de serem apolares e insolúveis em meio aquoso (McGarry, 1998) tendo, como principais exemplos o colesterol, os
ésteres do colesterol, os fosfolípides, os gliceróis (mono, di ou triacilgliceróis) e os ácidos graxos. Quimicamente, os lipídeos são produtos da mistura de gliceróis, sendo estes estruturas formadas pela associação do glicerol a uma,
duas ou três moléculas de ácidos graxos (Salem, 1999). Dessa forma, os ácidos graxos são formados por uma cadeia hidrocarbonada composta de 2 a
2 (Salem, 1999). Ainda, as cadeias de ácidos graxos podem não conter
duplas-ligações, sendo chamadas saturadas, ou podem apresentar uma ou mais duplas-ligações, sendo, nesse caso denominadas insaturadas (Champe, 1996).
Existem três famílias importantes de ácidos graxos: ômega-9, ômega-6 e ômega-3, sendo que apenas as duas últimas representam os ácidos graxos essenciais (EFAs) para o organismo (Garófolo & Petrilli, 2006), obtidos
somente por meio da dieta (Spector, 1999). Com efeito, Burr & Burr em 1929, ao observarem alterações em pessoas que não ingeriam gordura em sua dieta,
constataram que havia compostos que eram críticos para a boa manutenção do organismo. Desde então, os EFAs são estudados. Contudo, somente na década de 70 houve uma maior evolução nos estudos envolvendo tais
compostos (Moreira, 2008).
De importância para a presente Dissertação, os ácidos graxos
essenciais ômega-6 e ômega-3 são encontrados em todas as membranas celulares, juntamente com seus metabólitos de longa cadeia: os ácidos graxos
poliinsaturados (LCPUFAs), como por exemplo, o ácido araquidônico (AA), derivado do ômega-6 e os ácidos eicosapentaenóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA), derivados do ômega-3 (Das, 2006).
Os LCPUFAS, derivados do ômega-3 e do ômega-6, contêm um grupo carboxila e uma cadeia de carbono com números pares (maior ou igual a 18 carbonos) com 2 ou mais duplas-ligações (insaturado). Os EFAs e LCPUFAs
são estruturalmente classificados pelo número de carbonos, duplas ligações, e a proximidade da primeira dupla-ligação ao terminal metil. Os ácidos graxos da
3 os ácidos graxos da família ômega-6 contêm a dupla ligação no sexto carbono
(Gordon & Bazan, 1997).
Os seres humanos e outros mamíferos, não produzem as enzimas
necessárias para sintetizar os EFAs (ômegas 3 e 6), porém são capazes de biotransformar o ômega-6 em AA e o ômega-3 em EPA e DHA (Innis, 2007a).
As enzimas elongases e dessaturases são responsáveis pelo
metabolismo dos EFAs (Salem, 1999). Dessa forma, as enzimas Δ-6
dessaturase, elongase e Δ-5 dessaturase biotranformam o ômega-3 em EPA,
que por sua vez é alongado e dessaturado, formando o DHA. No que concerne à biotransformação do ômega-6, este é dessaturado e alongado para formar o AA, usando a mesma via de síntese do DHA (Sprecher et al., 1999) (Ilustração
1).
4 Os ácidos graxos EPA e DHA podem ser obtidos pré-formados por meio
da alimentação (Tjonneland et al.1993), sendo encontrados em sementes oleaginosas (canola, soja, linhaça), em vegetais (algas, microalgas e
fitoplanctons) e em animais de origem marinha (peixes e crustáceos) (Diziezak, 1989; Calder, 1998). Os peixes são a fonte mais rica de EPA e DHA [Scientific Advisory Committee on Nutrition (SACN), 2004]. Por sua vez, os
representantes mais importantes da família ômega-6 são encontrados nos óleos vegetais como os de girassol, algodão, milho e soja (Diziezak, 1989;
Thompson & Lowry, 1994) e em carnes e gemas de ovos (Bezard et al., 1994). Os ácidos graxos poliinsaturados DHA e EPA apresentam diferentes funções (Sinclair et al., 2007). O DHA está presente nas membranas neuronais
sinápticas e pode alterar a fluidez dessas membranas que, por sua vez, influenciam a conformação das proteínas (Salem et al., 2001). Tais proteínas
têm funções importantes e atuam como receptores ou transportadores alterando a passagem de íons. Assim, o DHA pode afetar a função dos
sistemas de neurotransmissores (Sinclair et al., 2007), tendo uma especial importância durante o desenvolvimento cerebral (Innis, 2007b). Em resumo, o DHA pode influenciar criticamente as propriedades físicas da membrana celular
(Innis, 2008), a atividade enzimática (Vaidyanathan et al.,1994), os canais iônicos (Poling et al., 1995) e os neurorreceptores e sua sinalização (Delion et al.,1996, Chalon et al.,1998), além de ser o ácido graxo poliinsaturado mais
abundante nas membranas celulares do cérebro e da retina (Moreira, 2008). Por outro lado, o EPA, diferentemente do DHA, não está presente em
5 cardiovascular e imunológico (Ryan et al., 2010), já que pode originar
eicosanóides de ação anti-inflamatória (Marszalek & Lodish, 2005).
1.1.1 Ômega-3 no Desenvolvimento Cerebral
O desenvolvimento de estruturas altamente organizadas no SNC é um
processo complexo e estímulos nesse período podem determinar a integridade funcional na fase adulta. O desenvolvimento cerebral é caracterizado por uma
série de etapas críticas, e cada uma delas deve ser corretamente cumprida para que, no final, o cérebro configure sua estrutura normal. Nesse período de alta plasticidade, o cérebro se torna mais susceptível a estímulos. Assim,
eventos que ocorrem durante as fases iniciais do desenvolvimento podem resultar em mudanças positivas ou negativas para o cérebro ao longo da vida
(Rice & Barone, 2000; Andersen, 2003; Trojan et al., 2004).
Um importante fator que pode influenciar o processo de desenvolvimento
cerebral é a dieta. Ainda nesse aspecto, estudos mostram que substâncias presentes na dieta (Bourre, 2004a) podem influenciar a química e a função cerebrais tanto durante o desenvolvimento quanto durante a maturidade
(Fernstrom, 2000). Nesse sentido, os efeitos de uma dieta rica em ácidos graxos ômega-3 sobre a estrutura e a função cerebrais foram os primeiros a serem descritos experimentalmente. De fato, demonstrou-se que tais ácidos
graxos são fundamentais para a diferenciação e o funcionamento das células cerebrais (Bourre, 2004a). Em seguida, foi descrito que a deficiência de
6 oligodendrócitos e astrócitos, além de promover alterações fisiológicas e
bioquímicas, podendo resultar em transtornos comportamentais e neurossensoriais (Bourre, 2004a). Assim, um fornecimento insuficiente de
ácidos graxos ômega-3 durante o desenvolvimento pré e pós-natal diminui o conteúdo de DHA (seu derivado) nos tecidos neurais com um aumento recíproco de ácido docosapentaenóico (DPA) (Schiefermeier & Yavin, 2002),
levando a uma série de déficits visuais, olfatórios, cognitivos e comportamentais em modelos animais (Moriguchi et al., 2000; Niu et al., 2004;
Lim et al., 2005a; Lim et al., 2005b).
O DHA é fornecido por meio da transferência placentária de ácidos graxos ômega-3 antes do nascimento e por meio do leite materno após o
nascimento (Innis, 2004, 2005). A quantidade de DHA no cérebro aumenta acentuadamente durante a gestação em períodos de neurogênese, migração e
diferenciação de neuroblastos, sinaptogênese e mielinização axonal (Green & Yavin, 1996; Schiefermeier & Yavin, 2002). De fato, baixos níveis de DHA no
desenvolvimento cerebral estão associados a prejuízos na neurogênese, alterações no desempenho do metabolismo de diversos neurotransmissores e prejuízos em tarefas de aprendizagem e memória em animais (Innis, 2008;
Novak, 2008).
Vários estudos relatam a importância da administração dos ácidos graxos desde o desenvolvimento fetal e infantil. Especula-se que durante o
processo de gravidez e na fase de amamentação, na qual a criança depende exclusivamente do leite materno para sua sobrevivência, a ingestão
7 clínicos têm relatado melhora precoce no desenvolvimento de habilidades
mental e motora em crianças alimentadas com fórmula que contém DHA comparada com aquelas que se alimentaram com fórmula sem DHA (Auestad
et al., 1997; O'Connor et al., 2001; Fewtrell et al., 2002; Birch et al., 2005; Heird e Lapillonne 2005).
Em animais de laboratório, a administração crônica de DHA em ratos
com deficiência de ácidos graxos é capaz de melhorar o processo cognitivo (Barceló-Coblijn et al., 2003). Acredita-se que tais efeitos aconteçam por
alterações na liberação de neurotransmissores (Mirnikjoo, 2001), pois recentes estudos em animais evidenciaram que a exposição ao DHA influencia os sistemas de neurotransmissores como dopamina, serotonina e acetilcolina
(Zimmer et al., 2002; Kodas et al., 2004).
1.1.2 Ômega-3 e Envelhecimento
Em vista do alto teor de ácidos graxos ômega-3 no cérebro, parece evidente que esses lipídios estão envolvidos na fisiologia cerebral e, assim, sua deficiência estaria envolvida em algumas doenças neuropsiquiátricas e no
declínio cognitivo durante o envelhecimento (Bourre, 2005). Nesse cenário, a maioria dos estudos relacionados ao envelhecimento relata uma significante diminuição nos níveis de ácidos graxos ômega-3, especialmente no
hipocampo, córtex, estriado e hipotálamo (Pu et al.,1999; Favreliere et al., 2000; Yehuda et al., 2000; Ulmann et al., 2001).
8 (Yehuda, 2002; Bourre, 2004b). Em resumo, a maioria dos estudos indica uma
diminuição acentuada no nível cerebral desses compostos durante o envelhecimento. A diminuição não é uniforme em todo o SNC e afeta
principalmente o córtex e o hipocampo, áreas importantes para o aprendizado e a memória (Yehuda, 2002).
Tal diminuição quantitativa de ácidos graxos ômega-3 poderia ser
explicada pela diminuição na capacidade dos ácidos graxos em cruzar a barreira hematoencefálica e pela diminuição no nível e na atividade da enzima
Δ-6 desaturase. Ainda, foi demonstrado que a suplementação com EFAs
parece corrigir tal deficiência (Yehuda, 2002).
1.2 Exercício Físico
A atividade física sempre existiu na história da humanidade. Estudos antropológicos e evidências históricas relatam a existência dessa prática desde
a cultura pré-histórica, como um componente integral da expressão religiosa, social e cultural (US Department of Health and Human Services, 1996). Por sua vez, a atividade física pode ser definida como todo movimento do corpo
realizado pela musculatura esquelética, resultando em gasto energético acima dos níveis de repouso (Nahas, 1996).
Há muitos estudos mostrando que o exercício físico beneficia
positivamente a função cerebral, como melhora da cognição, retardo da perda de memória relacionada à idade (Cotman et al., 2007; Hillman et al.; 2008),
9 2008), recuperação após lesão (Griesbach et al., 2008) e melhora da
depressão (Lawlor & Hopker, 2001).
Alterações estruturais induzidas pelo exercício físico também são
observadas. De fato, o exercício físico aplicado de forma adequada aumenta a plasticidade sináptica, afetando positivamente a estrutura e a função sinápticas, o metabolismo e a função vascular. Esse efeito fisiológico pode ativar circuitos
neuronais específicos e modificar o caminho da informação através das células pela ação de moléculas específicas (Vaynman & Gomez-Pinilla, 2005), sendo
mediado, em parte, pela ação de fatores neurotróficos (Cotman & Engesser-Cesar, 2002; Vaynman et al., 2004). Paralelamente, após um programa de exercício físico regular têm sido observado mudanças de bem-estar emocional
com apenas poucas sessões de exercício físico (North et al., 1990; Petruzzello, et al., 1991; Gleniester, 1996; Yeung, 1996), além de redução da depressão e
da ansiedade (Farmer, et al. 1988; Gleniester, 1996).
Ainda com relação ao aspecto emocional, dados epidemiológicos
sugerem que pessoas moderadamente ativas apresentam menor risco de serem acometidas por distúrbios mentais do que pessoas sedentárias, mostrando que a participação em programas de exercício físico exerce
benefícios nas esferas física e psicológica (Elsayed et al., 1980; Van Boxtel et al., 1996) e que indivíduos fisicamente ativos provavelmente possuem um processamento cognitivo mais rápido (Zajko et al., 1991;
10 1.2.1 Exercício Físico durante o Desenvolvimento Cerebral
Evidências sugerem que o exercício físico durante a infância e
adolescência pode favorecer o desenvolvimento cerebral (Sibley & Etnier, 2003; Hillman et al., 2005; Buck et al., 2008; Aberg et al., 2009; Hillman et al., 2009). Uma relação positiva entre atividade física e desempenho cognitivo foi
verificada em uma recente meta-análise em crianças com idade escolar (entre 4 e 18 anos) em 8 categorias de avaliação da cognição (habilidades
perceptuais, quociente de inteligência, testes verbais, testes de matemática, memória, nível de desenvolvimento/ aptidão acadêmica, entre outros). De fato, a atividade física e diversas categorias avaliadas se correlacionaram
positivamente, bem como houve correlação positiva entre a atividade física e todas as faixas etárias (embora a correlação tenha sido mais forte em crianças
nas faixas etárias de 4 a 7 e 11 a 13 anos, em comparação às faixas etárias de 8 a 10 e 14 a 18 anos) (Sibley & Etnier, 2003).
Ainda nesse contexto, Dik e colaboradores (2003) avaliaram a associação entre atividade física no início da vida e cognição em 1.241 indivíduos com idade entre 62 e 85 anos. Os resultados também indicaram
uma correlação positiva entre a prática de atividade física durante os 15 e 25 anos e a velocidade de processamento de informações na idade avançada.
Em conjunto, esses resultados sugerem que, embora a atividade física
possa ser benéfica em todas as fases da vida, a intervenção precoce poderia ser importante para a melhoria e/ou manutenção da saúde e da função
11 1.2.2 Exercício Físico durante o Envelhecimento
As funções cognitivas, tais como a aprendizagem e a memória, e a
habilidade de aprender novas tarefas declinam à medida que ocorre o processo de envelhecimento (Gage et al., 1984; Jarrard, 1995; Smith et al., 2000; Mattson & Magnus, 2006). De fato o envelhecimento leva a alterações
funcionais do hipocampo, o qual desempenha um papel fundamental no aprendizado e na memória, resultando em distúrbio das funções cognitivas.
(Jarrard, 1995; Mattson & Magnus, 2006).
Nesse aspecto, o exercício físico parece melhorar o desempenho cognitivo de animais idosos. De fato, a atividade física em esteira rolante
melhora as memórias de curto prazo e espacial em ratos idosos (Kim et al., 2010). Esse efeito benéfico do exercício físico tem sido relatado em vários
estudos. Nesse sentido, Rovio e colaboradores (2005) sugeriram que o exercício físico melhora as funções cognitivas e retarda o início da doença de
Alzheimer. Van Praag e colaboradores (2005) relataram que a corrida melhora o aprendizado de uma memória hipocampo-dependente e a neurogênese hipocampal em camundongos idosos.
Estudos com humanos confirmam tais achados. Heyn e colaboradores (2004), em recente meta-análise, também encontraram significativo aumento dos desempenhos físico e cognitivo, bem como uma melhora no
comportamento de pessoas idosas com déficit cognitivo e demência, demonstrando que a prática de exercício físico pode exercer uma função
12 ser sensíveis à capacidade aeróbia. Assim, 132 indivíduos com idade entre 24
e 76 anos foram submetidos a uma sessão aguda de exercício submáximo em cicloergômetro seguido por uma extensa bateria neuropsicológica, incluindo
testes de inteligência, memória verbal e velocidade no processamento de informações. Tal estudo evidenciou a existência de uma interação entre os testes de velocidade de processamento cognitivo, idade e capacidade aeróbia.
Ainda, Hill e colaboradores (1993) também relacionaram o desempenho cognitivo com a capacidade aeróbia, submetendo 87 idosos sedentários a um
programa de treinamento aeróbio. Os autores observaram efeitos benéficos do treinamento sobre a memória lógica e na memória avaliada pela Escala Wechsler. Outro estudo também observou melhora nas funções cognitivas em
um grupo de 94 idosos que participaram de um programa de treinamento aeróbio com duração de 12 meses (Williams & Lord, 1997).
1.3 Ômega-3 e Exercício Físico na Memória
Ao longo de milhares de anos, a dieta, em conjunto com outros aspectos da vida diária, tais como o exercício físico, teve um papel crucial na formação
da capacidade cognitiva e da evolução do cérebro (Gómez-Pinilla, 2008) e, assim como o exercício, a nutrição também afeta a função cerebral (Van praag, 2009).
Há evidências de que a abundância de nutrientes específicos possa afetar os processos cognitivos e as emoções. Recentemente, as influências de
13 mostrado alguns dos mecanismos responsáveis pela saúde do cérebro e da
função mental (Gómez-Pinilla, 2008).
Nesse contexto, o consumo de alimentos ricos em gorduras saturadas e
colesterol aumentam o risco de declínio cognitivo, enquanto que uma dieta de restrição beneficia o aprendizado e protege o cérebro do estresse oxidativo (Stranahan & Mattson, 2008). Ainda, há evidências crescentes de que os
suplementos dietéticos melhoram o aprendizado e a memória. Dentre tais suplementos, os ácidos graxos ômega são um exemplo (Gómez-Pinilla, 2008).
De importância, esse suplemento reforça os benefícios do exercício físico para a função cerebral (Gómez-Pinilla, 2008; Wu et al., 2008). Dessa forma, a sinergia entre a dieta e o exercício poderia envolver caminhos celulares
comuns importantes para a sobrevivência celular, a plasticidade sináptica, a neurogênese e função vascular (Van praag, 2009).
Do ponto de vista molecular, ações específicas do exercício físico contribuem para o crescimento axonal e a plasticidade sináptica, que também
são modulados por uma dieta rica em DHA (Farmer et al., 2004; Ding et al. 2006a; Vaynman et al., 2006, Wu et al. 2008). Os ácidos graxos ômega-3, similarmente ao exercício, melhoram a função cognitiva, promovem
neuroplasticidade e protegem contra lesões neurológicas (Wu et al. 2008). Com relação à interação entre a atividade física e a dieta, Wu e colaboradores (2008) verificaram que uma curta exposição de 12 dias a uma
dieta enriquecida com DHA aumenta significativamente a capacidade de aprendizagem e que tais efeitos são reforçados pela aplicação simultânea de
14 Nesse cenário, estudos recentes têm demonstrado essa ação
cooperativa entre dieta e exercício também em nível molecular, o que poderia influenciar a capacidades cognitiva. Em roedores, a combinação do exercício
físico e suplementação alimentar de DHA teve maior efeito sobre o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) – mediador da plasticidade sináptica –
sobre a cognição (capacidade de aprendizagem espacial) do que tais fatores
isolados (Chytrova et al.,2009).
Ainda com relação a estudos realizados em animais, o exercício físico
parece melhorar o desempenho nas tarefas de labirinto aquático de Morris (Van Praag et al. 1999; Vaynman et al., 2004; Uysal et al. 2005; Van Praag et al. 2005; Ang et al. 2006; Ding et al. 2006b), de esquiva passiva (Samorajski et
al. 1985; Ogonovszky et al. 2005; Alaei et al. 2006; Radak et al. 2006), de esquiva ativa (Radak et al. 2001) de medo condicionado ao contexto (Baruch et
al. 2004; Burghardt et al. 2006) e de labirinto radial (Schweitzer et al. 2006). No entanto, existem também alguns estudos com tarefas semelhantes que não
relatam nenhum efeito (Samorajski et al. 1985; Barnes et al. 1991; Blustein et al. 2006; Hansalik et al. 2006) ou mesmo um efeito deletério (Braszko et al. 2001; Blustein et al. 2006). É importante ressaltar que a maioria dessas tarefas
depende da integridade do hipocampo de alguma forma. Nesse sentido, Baruch e colaboradores (2004) verificaram que o exercício melhorou a memória em uma tarefa de medo condicionado somente quando testado na
forma dependente do hipocampo (contexto), mas não quando testado na forma dependente da amígdala (som).
15 2007), a neurogênese (Van Praag et al. 1999; Van Praag et al. 2005;
Llorens-Martín et al., 2006; Olson et al., 2006; Stranahan et al., 2006) e a plasticidade
sináptica (Van Praag et al. 1999; Farmer et.al., 2004; O’Callaghan et al., 2007)
nessa estrutura. Quando relacionados à prática de exercício físico, esses fenômenos têm sido associados a um aumento dos fatores neurotróficos de crescimento no hipocampo, principalmente o BDNF (Cotman & Berchtold 2002;
Griesbach et al., 2004; Vaynman et al., 2004; Ding et al. 2006b), o que levaria à melhora do desempenho cognitivo.
Resumidamente, tanto a suplementação com ômega-3 quanto à atividade física isoladamente parecem ser capazes de facilitar o neurodesenvolvimento e desempenho cognitivo de roedores. Ainda, a
associação de uma dieta enriquecida com ômega-3 e de atividade física parece potencializar os efeitos benéficos de cada um desses fatores sobre a cognição.
Contudo, os estudos têm avaliado isoladamente os efeitos da suplementação ou da deficiência de ômega-3 ou da atividade física com diferentes durações
16
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
O objetivo da presente Dissertação foi avaliar os efeitos da
suplementação com óleo de peixe, rico em ômega-3, associada ao exercício físico forçado ao longo de todo o desenvolvimento sobre o desempenho
cognitivo de ratos de meia idade.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar os efeitos da suplementação com óleo de peixe concomitante ou
não ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos: 1. no teste de habituação ao campo aberto;
2. no teste do reconhecimento de objetos;
3. na esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado;
Avaliar a responsividade dos animais frente ao estimulo doloroso no
17
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Sujeitos Experimentais
Todos os procedimentos realizados na presente Dissertação estão de
acordo com as normas estabelecidas pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (nº. do protocolo 0252/09), pelos Princípios
Éticos e Práticos do Uso de Animais de Experimentação (Andersen et al., 2004) e pela Lei Brasileira de Procedimentos para o uso científico de animais
(#11794/2008).
Foram utilizados 45 ratos Wistar (550g), originários da colônia do biotério da Universidade Federal de São Paulo, alojados em gaiolas plásticas, medindo
41 cm x 34 cm x 16,5 cm. As gaiolas foram mantidas em nosso biotério, com
ventilação e temperatura (20-23C) controladas por meio de um aparelho de ar
condicionado central, em um ciclo claro-escuro de 12/12 horas, iniciando-se o
período claro às 6 horas e 45 minutos e o período escuro às 18 horas e 45 minutos. Água e comida foram fornecidas ad libitum. Quando da realização dos experimentos, os animais foram retirados do biotério em suas gaiolas moradia
e levados para uma sala de experimentação, com temperatura controlada
(20-23C) e isolamento acústico, onde foram deixados para habituação por pelo
menos uma hora antes do início dos procedimentos experimentais.
18 O tratamento com o óleo de peixe (85 mg/Kg/dia, v.o., Proepa - Aché®) ou veículo (Cremophor 0,009% , Sigma®), rico em ômega-3, teve início 15 dias
antes da prenhez e se estendeu até o final do período de lactação. Após o desmame (21º dia de vida), os filhotes machos das respectivas ninhadas continuaram a receber diariamente a suplementação com óleo de peixe (grupo
OP) ou veículo (grupo VCL). Aos 2 meses de vida, os ratos passaram a receber a suplementação com óleo de peixe ou veículo por 5 dias
consecutivos/semana até o 10º mês de vida.
A solução de óleo de peixe (ômega-3) foi preparada a partir de cápsulas
(Proepa - Aché®) contendo os seguintes ácidos graxos poliinsaturados: DHA (120 mg/ 1 g) e EPA (180 mg/ 1 g) e diluída em água destilada e Cremophor 0,009%. A solução veículo foi preparada utilizando somente água destilada e
Cremophor 0,009%.
3.3. Programa De Exercício Físico Forçado (EX)
O programa de treinamento físico foi realizado em esteira rolante
(Columbus Instruments®– Ilustração 2). Um estímulo (choque de 2,0 a 5,0 mA) foi utilizado quando o animal se recusou a correr (atividade física forçada). Uma
escala de desempenho na esteira de 1 a 5, classificada por Dishman e colaboradores (1988), foi realizada: 1 = o animal se recusa a correr; 2 = corrida sem constância (corre e para ou corre em direção errada); 3 = corrida regular; 4
= corrida boa (ocasionalmente corre na parte de trás da esteira) e 5 = corrida excelente (corre permanentemente na parte da frente da esteira). Os animais
19 treinamento físico. Esse procedimento foi usado para excluir possíveis níveis diferentes de estresse entre os animais. No 21º dia de vida, iniciou-se o
treinamento físico (grupo EX). O programa de treinamento aeróbio consistiu de sessões em esteira rolante, 6 vezes por semana. Cada sessão de treinamento teve inicio com um aquecimento de 5 min a 8 m/min. O tempo e a velocidade
de corrida foram aumentados gradativamente durante os dias subseqüentes, até que atingissem 18 m/min durante 60 minutos nos primeiros 60 dias (Gomes
da Silva et al., 2009). Após esse período, os animais passaram a correr 5 vezes por semana durante 30 minutos e com velocidade atingindo 20 m/min
até que completassem 300 dias. A velocidade foi mantida em até 20 m/mim por todo o período de treinamento físico com um aumento gradativo da intensidade do choque quando necessário (até 5,0 mA).
20
3.4. Grupos Experimentais
Os animais foram distribuídos em 4 grupos experimentais:
Grupo VCL-CTL: Onze ratos machos da prole de ratas que receberam
solução veículo (Cremphor 0,009%) previamente e durante a gestação e também durante a lactação. Após o desmame, os ratos foram tratados
diária e prolongadamente até atingirem 300 dias de idade. Não foram submetidos ao programa de treinamento físico forçado descrito
anteriormente.
Grupo VCL-EX: semelhante ao grupo VCL-CTL, porém submetidos ao
treinamento de exercício físico forçado desde a fase de desenvolvimento até a maturidade (n=11).
Grupo OP-CTL: Onze ratos machos da prole de ratas que receberam
óleo de peixe (85mg/kg/dia, Proepa - Aché®, rico em ômega-3) previamente e durante a gestação e também durante a lactação. Após o
desmame, os ratos foram tratados diária e prolongadamente até atingirem 300 dias de idade. Não foram submetidos ao programa de
treinamento físico forçado descrito anteriormente.
Grupo OP-EX: semelhante ao grupo OP-CTL, porém submetidos ao
programa de treinamento de exercício físico forçado desde a fase de desenvolvimento até a maturidade (n=12).
Além destes 4 grupos experimentais, foram utilizados outros 2 grupos (n=12) constituídos por 24 ratos Wistar com idade de 3 meses. Esses animais foram utilizados com o objetivo de comparar o aprendizado e a retenção da
21 por 7 dias e os outros 12 ratos foram submetidos a sessão de treino e 7 dias depois à sessão de teste na esquiva discriminativa em labirinto em cruz
elevado, seguindo o mesmo protocolo experimental delineado para os grupos formados por ratos de meia-idade.
3.5. Modelos Comportamentais de Avaliação da Memória
3.5.1 Teste de Habituação em Campo Aberto (CA)
O campo aberto utilizado consiste em uma arena de polivinilacrílico branco opaco com formato cilíndrico. O corpo do cilindro apresenta 32,5 cm de altura e sua base constitui-se por um circulo de madeira com 97 cm de
diâmetro. O chão da arena é subdividido em 19 quadrantes aproximadamente iguais demarcados por circunferências concêntricas de raios diferentes (8,5;
28,5 e 48,5 cm), intersectadas por segmentos de retas radiais (Ilustração 3A). Foi quantificada, por meio de observação direta, a freqüência de locomoção dos animais por 10 minutos consecutivos. Cada unidade de
locomoção corresponde ao ato do animal entrar com as 4 patas em qualquer um dos quadrantes do campo aberto (Ilustração 3B).
Nesse período de 10 minutos de exposição ao campo aberto, foi quantificada também a freqüência de levantar (número de vezes que o rato permaneceu apoiado sobre duas patas, com auxilio ou não da parede do
campo aberto (Ilustração 3C).
Após cada observação no campo aberto, o aparelho foi limpo com uma
22 de odor deixados pelo sujeito anterior. As observações sempre foram realizadas no mesmo horário para diminuir os efeitos circadianos no
comportamento dos ratos, sendo os animais dos diferentes grupos observados de forma alternada.
Os animais dos 4 grupos experimentais (VCL-CTL, VCL-EX, OP-CTL,
OP-EX) foram submetidos a duas exposições ao campo aberto por 10 minutos, intervaladas por 7 dias, quando completaram 230 dias de vida.
Ilustração 3 – Arena de campo aberto (A). Repertório comportamental de ratos na arena de campo aberto: Locomoção (B) e levantar não apoiado nas paredes do aparelho (C).
3.5.2 Teste de Reconhecimento de Objetos (RO)
As sessões de treino, teste e reteste da tarefa de reconhecimento de objetos foram realizadas na arena de campo aberto descrita anteriormente
(Ilustração 3A), após os animais completarem 240 dias de vida. Antes da sessão de treino, os ratos foram habituados ao campo aberto em duas sessões
de 10 minutos cada, intervaladas por 7 dias. Nessas sessões de habituação, os animais puderam explorar livremente a arena de campo aberto na ausência de qualquer estímulo comportamental.
Sete dias após a habituação, os animais dos 4 grupos experimentais (VCL-CTL, VCL-EX, OP-CTL, OP-EX) foram expostos novamente à arena de
C
23 campo aberto. Nessa sessão comportamental (treino da tarefa de reconhecimento de objetos), os animais puderam explorar livremente dois
objetos fixados nas direções opostas da arena de campo aberto, no limite geográfico de um quadrante central e um periférico por 10 minutos consecutivos.
A sessão de teste, com duração de 3 minutos, foi realizada três horas após a sessão de treino. No teste, os animais foram expostos à arena de
campo aberto que continha um objeto conhecido durante a sessão de treino e um objeto novo. A mudança de objetos, bem como o seu posicionamento na
arena de campo aberto, foi randomicamente permutada entre cada animal. Por fim, sete dias após a sessão de treino foi realizada a sessão de reteste. Tal sessão foi realizada da mesma maneira que a sessão de teste, mantendo-se
como objeto familiar um objeto explorado pelo animal durante a sessão de treino.
Os objetos empregados foram um módulo de transporte para roedores (Habitrail OVO ®, Hagen), uma bola de borracha para animais de estimação apoiada em um tubo em T (Habitrail®, Hagen), uma casinha e um balanço de
madeira para roedores (Animalíssimo®). O comportamento exploratório foi constituído pela duração de cheirar ou tocar os objetos com o nariz e/ou as
patas dianteiras. Os comportamentos de proximidade, tais como, sentar ou girar em torno dos objetos não foram considerados comportamentos exploratórios.
Entre cada observação, a arena de campo aberto e os objetos foram cuidadosamente limpos com uma solução hidroalcoolica na concentração de
24 Ilustração 4 – Arena de campo aberto com objetos devidamente posicionados para a tarefa de reconhecimento de objetos (A). Comportamento exploratório quantificado (B). Comportamento não quantificado (C).
3.5.3 Esquiva Discriminativa em Labirinto em Cruz Elevado (ED-LCE)
Nesse modelo animal de aprendizado/memória, roedores são condicionados a escolher um entre dois braços fechados (um aversivo e um não-aversivo) ao mesmo tempo em que evitam a exposição aos braços abertos
de um labirinto em cruz elevado modificado (Silva et al., 1997, 1998, 1999, 2000, 2002, 2004; Claro et al., 1999; Silva & Frussa-Filho, 2000, 2002; Silva,
2001; Calzavara et al., 2004; Castro et al., 2005; Carvalho et al., 2006; Patti et al., 2006; Kameda et al., 2007; Alvarenga et al., 2008; Niigaki et al., 2010; Patti
et al., 2010).
Foram realizadas uma sessão de treino e uma sessão de teste, intervaladas por 7 dias, após os animais completarem 250 dias de vida. Os
animais foram colocados individual e intercaladamente no centro de um labirinto em cruz elevado modificado, contendo dois braços abertos (50 cm x 12
cm, 9 lx do nível do chão) opostos a dois braços fechados (50 cm x 12 cm x 40 cm, 3 lx do nível do chão), um dos quais contendo chão emborrachado, uma lâmpada incandescente de 100 watts e um secador de cabelos com potência
de 9500 watts (braço fechado aversivo) (Ilustração 5). Durante a sessão de
25 treino, com duração de 10 minutos, cada vez que o animal entrava no braço fechado contendo a lâmpada, recebia estimulação aversiva até que deixasse o
braço, quando os estímulos cessavam, não recebendo tal estimulação no outro braço fechado (não-aversivo). A estimulação aversiva consistiu em iluminação proveniente da lâmpada e em um jato de ar proveniente do secador de
cabelos. Na sessão de teste, com duração de 3 minutos, cada animal foi novamente colocado no centro do aparelho, mas sem receber qualquer
estimulação aversiva, embora a lâmpada e o secador (desligados) continuassem presentes sobre o braço fechado aversivo. Em todas as sessões
experimentais, foram registrados o número de entradas e o tempo de permanência em cada um dos braços do aparelho (braço fechado aversivo, braço fechado não-aversivo e braços abertos). Entre as exposições de cada
animal, o aparelho foi limpo com uma solução álcool/água 5%.
O aprendizado e a memória foram avaliados por meio da comparação do
tempo de permanência nos braços fechados aversivo e não-aversivo nas sessões de treino e teste, respectivamente. Os níveis de ansiedade foram avaliados por meio da comparação da porcentagem de tempo de permanência
nos braços abertos do aparelho (tempo de permanência nos braços abertos/ tempo de permanência em todos os braços x 100). Finalmente, a atividade
26 Ilustração 5 – Esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado (ED-LCE). Os ratos são submetidos à sessão de treino e se esquivam do braço aversivo em decorrência da apresentação dos estímulos aversivos (luz de 100 watts e jato de ar frio) apresentados em um dos braços fechados do aparelho (braço fechado aversivo). Permanência no braço fechado aversivo (A), no braço fechado não-aversivo (B) e no braço aberto (C). A lâmpada e o secador são desligados imediatamente após o animal deixar o braço fechado aversivo durante a sessão de treino e permanecem desligados durante toda a sessão de teste.
3.6 Teste de Reatividade ao Choque
A reatividade ao choque nas patas foi avaliada em um aparelho de
esquiva inibitória. Para o teste de reatividade ao choque nas patas, os animais com 260 dias de vida, foram confinados no compartimento escuro do aparelho. Uma versão modificada do método up and down previamente descrita (Crocker
& Russell, 1984; Dixon, 1965; Mesches et al., 1996), foi utilizada para determinar a nocicepção. Para tanto, cada animal foi colocado no
compartimento escuro do aparelho de esquiva inibitória e um período de habituação com duração de 1 minuto ocorreu imediatamente antes do início da série de choques nas patas. As intensidades dos choques variaram de 0,5 a
1,0 mA com 1s de duração, com intervalos de 10s entre os choques. A intensidade dos choques foi progressivamente aumentada em 0,1 mA a cada
C
27 choque. Para cada resposta dos animais frente a uma intensidade de choque foi atribuído um escore, sendo: 0 = ausência de retirada de patas; 1 = retirada
de uma pata do chão de grade; 2 = retirada de três patas ou quatro patas do chão de grade. A soma de escores foi realizada para cada animal (Mesches et al., 1996).
Ilustração 6 – Aparelho de esquiva inibitória usado para o teste de reatividade ao choque.
3.7 Análise Estatística
Em um primeiro momento, realizamos o teste de Levene para a constatação de que os dados obtidos seriam paramétricos. Uma vez que o foram, todos os parâmetros foram avaliados ou pela análise de variância
(ANOVA) proposta por Snedocor (1946) de uma, duas ou três vias, dependendo do delineamento experimental seguida do teste de Duncan (1955)
28
4. RESULTADOS
4.1 Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não
ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos no teste de
habituação ao campo aberto
A análise de variância com medidas repetidas para o parâmetro
locomoção revelou apenas efeitos significativos do fator exposição (1ª x 2ª exposição) [F(1,41)=4,98; p<0,05] e da interação tratamento (veículo x óleo de
peixe) x exposição [F(1,41)=5,73; p<0,05]. De fato, o teste T para amostras pareadas revelou que os animais tratados com óleo de peixe, independentemente da condição experimental (controle x exercício físico
forçado) apresentaram uma diminuição significativa na locomoção durante a 2ª exposição em relação à locomoção observada durante à 1ª exposição
[T(10)=5,07 e 2,35; p<0,05, respectivamente] (Figura 1).
No que se refere à frequência de levantar, a análise de variância com medidas repetidas também revelou apenas efeitos significativos do fator
exposição [F(1,41)=23,18; p<0,001] e das interações exposição x condição experimental [F(1,41)=4,37; p<0,05] e exposição x tratamento [F(1,41)=5,44;
p<0,05]. Ainda, o teste T para amostras pareadas revelou que os animais tratados com óleo de peixe, independentemente da condição experimental (controle x exercício físico forçado) apresentaram uma diminuição significativa
29 4.1.1 Desempenho de ratos jovens no teste de habituação ao Campo
Aberto
A comparação entre a 1ª x 2ª exposição para o parâmetro de locomoção total por meio do teste T pareado revelou diferença significativa entre as
exposições [T(11)=2,62; p<0,05]. O mesmo ocorreu para a freqüência de levantar [T(11)=6,18; p<0,001]. Isto mostra que houve uma diminuição destes
30
Figura 1 Locomoção (média ± SE) durante 1ª e a 2ª exposições ao campo aberto de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de
controle (OMG-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OMG-EX, n=12). A análise com medidas repetidas revelou efeitos do
fator exposição e da interação exposição x tratamento.
31
Figura 2 Frequência de levantar (média ± SE) durante 1ª e a 2ª exposições ao campo aberto de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL,
n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12). A análise com medidas
repetidas revelou efeitos do fator exposição e das interações exposição x condição e exposição x tratamento.
32 4.2 Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não
ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos no teste de
reconhecimento de objetos
Na sessão de teste (realizada 3 horas após a sessão de treino), o teste
T para amostras pareadas revelou que todos os animais, independentemente do tratamento e/ou da condição experimental, exploraram significativamente
mais o objeto novo em relação ao objeto conhecido durante a sessão de treino (para os grupos VCL-CTL, OP-CTL e VCL-EX [T(10)=3,48, 3,99 e 3,75;
p<0,005, respectivamente] para o grupo OP-EX [T(11)=3,83; p<0,005]) (Figura 3).
Na sessão de reteste (realizada 7 dias após a sessão de treino), o teste
T para amostras pareadas revelou que apenas os animais tratados com óleo de peixe, independentemente da condição experimental (OP-CTL e OP-EX),
33
Figura 3 Tempo de exploração (média ± SE) dos objetos durante a sessão de teste de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição
controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (Teste T para amostras pareadas).
34
Figura 4 Tempo de exploração (média ± SE) dos objetos durante a sessão de reteste de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição
controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (Teste T para amostras pareadas).
35 4.3 Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não
ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos na esquiva
discriminativa em labirinto em cruz elevado
Na sessão de treino, a análise de variância de três vias revelou efeitos
significativos do fator braço (aversivo x não-aversivo) [F(1,82)=263,92; p<0,001] e da interação braço x tratamento (veículo x óleo de peixe)
[F(1,82)=5,98; p<0,02]. De fato, o teste de post hoc de Duncan revelou que todos os animais aprenderam a discriminar os braços fechados (Figura 5).
Ainda durante a sessão de treino, a ANOVA de duas vias não revelou quaisquer diferenças significativas entre os grupos no que concerne a porcentagem de tempo nos braços abertos (Figura 6) ou ao número de
entradas em todos os braços do aparelho (Figura 7).
Na sessão de teste, realizada 7 dias após a sessão de treino e na
ausência dos estímulos aversivos, a análise de variância de três vias revelou efeitos significativos do fator braço (aversivo x não-aversivo) [F(1,82)=13,24; p<0,001] e da interação braço x condição experimental (controle x exercício
físico forçado) [F(1,82)=4,62; p<0,05]. De fato, o teste de post hoc de Duncan revelou que apenas os animais submetidos ao exercício físico forçado (VCL-EX
e OP-EX) discriminaram os braços fechados, demonstrando retenção da tarefa (Figura 8).
Ainda durante a sessão de teste, a ANOVA de duas vias não revelou
quaisquer diferenças significativas entre os grupos no que concerne a porcentagem de tempo nos braços abertos (Figura 9) ou ao número de
36 4.3.1 Desempenho de ratos jovens no teste da esquiva discriminativa em
labirinto em cruz elevado
Na sessão de teste, realizada 7 dias após a sessão de treino, o teste T para amostras pareadas revelou diferenças significativas na exploração dos
37
Figura 5 Tempo de permanência (média ± SE) nos braços fechados não-aversivo (NAv) e não-aversivo (Av) do aparelho de esquiva discriminativa em
labirinto em cruz elevado durante a sessão de treino de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos:
veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12)
(ANOVA de três vias seguida do teste de Duncan).
38
Figura 6 Porcentagem de tempo (média ± SE) nos braços abertos do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de treino de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução
veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL,
n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (ANOVA de duas vias).
39
Figura 7 Número de entradas (média ± SE) em todos os braços do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de
treino de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de
controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (ANOVA de duas vias).
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Figura 8 Tempo de permanência (média ± SE) nos braços fechados não-aversivo (NAv) e não-aversivo (Av) do aparelho de esquiva discriminativa em
labirinto em cruz elevado durante a sessão de teste de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos:
veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe -controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12)
(ANOVA de três vias seguida do teste de Duncan).
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Figura 9 Porcentagem de tempo (média ± SE) nos braços abertos do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a
sessão de teste de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL,
n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (ANOVA de duas vias).
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Figura 10 Número de entradas (média ± SE) em todos os braços do aparelho de esquiva discriminativa em labirinto em cruz elevado durante a sessão de teste de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e
submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de
controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) óleo de peixe-exercício (OP-EX, n=12) (ANOVA de duas vias).
43 4.4 Efeitos da administração de óleo de peixe concomitantemente ou não
ao exercício físico forçado sobre o desempenho de ratos no teste de
reatividade ao choque
A análise de variância de três vias para os escores do teste de
reatividade ao choque nas patas revelou efeitos significativos apenas do fator intensidade do choque [F(5,205)=94,65; p=0,001], demonstrando que,
independentemente do tratamento veículo x óleo de peixe e/ou da condição experimental controle x exercício físico, os animais apresentaram um aumento
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Figura 11 Escore (média ± SE) de reatividade ao choque nas patas de ratos tratados v.o. com óleo de peixe (OP) ou solução veículo (VCL) e submetidos ao exercício físico forçado (EX) ou mantidos na condição controle (CTL), formando
os grupos: veículo-controle (VCL-CTL, n=11), óleo de peixe-controle (OP-CTL, n=11), veículo-exercício (VCL-EX, n=11) e óleo de peixe-exercício (OP-EX,
