4 MATERIAIS E MÉTODOS
5.2 Efeitos do veneno da Crotalus durissus cumanensis e crotoxina sobre células tubulares renais MDCK (Madin-Daby Canine Kidney)
O efeito do veneno total e crotoxina isolada da C. d. cumanensis nas células tubulares renais foi avaliada através de culturas de células MDCK. A viabilidade das culturas tratadas (1,0 x 105 / poço) com o veneno ou crotoxina (3,125; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL) foi analisada pelo método MTT após 24h de incubação. Os resultados demonstraram um efeito citotóxico dependente da concentração do veneno, com valor da CI50 5,38 µg/mL (Figura 19) e visíveis
alterações morfológicas, tais como agregados celulares e citoplasma granuloso. (Figura 20, 21 e 22). Em contraste, nos experimentos realizados com a fração crotoxina não foi observado diminuição significativa da viabilidade celular (controle = 75,81 ± 4,71%; 3,125µg/mL = 100,00 ± 21,94%; 6,25µg/mL = 92,55 ± 16,59%; 12,5µg/mL = 89,92 ± 18,58%; 25µg/mL = 96,40 ± 20,55%; 50µg/mL = 88,58 ± 11,02%; 100µg/mL = 83,63 ± 23,86%).
Figura 19. Efeito do veneno da C. d. cumanensis em células tubulares renais MDCK. Valores expressos em média ± E.P.M. Para análise estatística utilizou-se análise de variância (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni, *p< 0,05.
A B
0.0
3.12
6.25
12.5
25
50
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
*
*
*
*
*
Veneno (µg/mL)
%
V
ia
bi
li
dade
cel
ul
a
r
Figura 20: Fotomicrografia das células tubulares renais MDCK após exposição com veneno da C. d. cumanensis com visíveis alterações morfológicas, tais como agregados celulares e citoplasma granuloso. A: controle; B: 25 µg/mL.
Figura 21: Fotomicrografia das células tubulares renais MDCK após exposição com veneno da C. d. cumanensis com visíveis alterações morfológicas, tais como agregados
celulares e citoplasma granuloso A: controle; B: 50 µg/mL. B
Figura 22: Fotomicrografia das células tubulares renais MDCK após exposição com veneno da C. d. cumanensis com visíveis alterações morfológicas, tais como agregados celulares e citoplasma granuloso A: controle; B: 100 µg/mL.
5.3 Ensaios em anel de aorta
¾ Efeito do veneno total da Crotalus durissus cumanensis na Tensão basal
Nos ensaios com tecido mantido sob tônus basal e endotélio intacto a adição do veneno (0,1 - 30µg/mL; n=4) não produziu alterações no tônus aórtico (Figura 23).
Concentração do veneno (ug/mL)
0,1 1 10 100 T ô n u s b a sa l (% d o co n tro le ) -40 -20 0 20 40
Figura 23. Efeito do veneno total da C. d. cumanensis (0,1 – 30 µg/mL) no tônus basal em aorta isolada (●; n = 4). Valores expressos em média ± E.P.M.com análise estatística análise de variância (ANOVA), Holm-Sidak *p<0,01.
¾ Efeito do veneno total da Crotalus durissus cumanensis na contração induzida por Fenilefrina (Phe 1µM) em preparações com endotélio intacto ou sem endotélio.
Nas preparações de anéis de aorta pré-contraídas com fenilefrina (Phe 0,1 µM) e endotélio intacto a adição cumulativa do veneno (0,1 - 30µg/mL; n=4), proporcionou um aumento da contratilidade da musculatura vascular de forma dependente da concentração com valor máximo de 130,0 ± 6,6%, da contração obtida na ausência do veneno. Esse aumento máximo foi observado na concentração de 10µg/mL. Em contraste, nas preparações de anéis de aorta desprovidos de endotélio, tratados com o veneno (0,1 - 50µg/mL), o efeito vasoconstritor induzido pela Phe 0,1 µM foi abolido para 66,7 ± 4,9% (com 50,0 µg/mL do veneno; n = 4), de modo dependente da concentração (Figura 24).
Concentração de veneno (ug/mL) 0,1 1 10 100 % C o n tra çã o Ph e 0 ,1 u M 40 60 80 100 120 140 com endotélio sem endotélio * * * * *
Figura 24. Curva concentração – resposta do veneno da C. d. cumanensis em aorta com o endotélio intacto (●, n = 4; 0,1 – 30 µg/mL) ou sem endotélio (●, n = 4; 0,1 – 50 µg/mL) após pré-contração do tecido com Phe (1µM). Valores expressos em média ± E.P.M.com análise estatística análise de variância (ANOVA), Holm-Sidak, *p<0,01.
¾ Efeito do veneno total da Crotalus durissus cumanensis na contração induzida por Potássio (K+ 40 Mm) em preparações com endotélio intacto ou sem endotélio
A adição do veneno da C. d. cumanensis demonstrou, em preparações pré-contraída com potássio (K+ 40 mM), um perfil semelhante ao ensaio anterior. Foi observado, em anéis de aorta com endotélio intacto, um aumento significativo da contração induzida por K+ 40 mM para 128,23 ± 4,9% (correspondente a concentração de 30,0 µg/mL; n=6). Além disso, um efeito vasorelaxante foi observado nas preparações com endotélio removido, concentração de 50,0 µg/mL do veneno, diminuindo as contrações para 70,9 ± 4.7% (n=4) da resposta obtida na ausência do veneno (Figura 25).
Figura 25. Curva concentração – resposta do veneno da C. d. cumanensis em aorta com o endotélio intacto (●, n = 4; 0,1 – 30 µg/mL) ou sem endotélio (●, n = 4; 0,1 – 50 µg/mL) após pré-contração do tecido com K+ 40mM. Valores expressos em média ± E.P.M. com análise estatística análise de variância, (ANOVA), Holm-Sidak *p<0,01.
Concentração de veneno (µg/mL) 0,1 1 10 100 % C o n tra çã o K + 4 0 mM 40 60 80 100 120 140 com endotélio sem endotélio * * * *
¾ Efeito do veneno total da Crotalus durissus cumanensis na contração induzida por fenilefrina (0,1µM) em meio livre de cálcio na presença de EGTA
Em preparações com endotélio intacto mantidas em meio livre de Ca2+, a fenilefrina (Phe 0,1µM) induziu uma pequena e transitória contração correspondente a 22,49 ± 3,10% (n = 4) da contração obtida em solução contento cálcio. Após a pré-contração com fenilefrina e adição do veneno da C. d. cumanensis (30 µg/mL), a contração foi de 17,36 ± 3,06% (n=4), valor não significativo em relação a resposta obtida na ausência do veneno. A concentração do veneno utilizada, 30µg/mL, corresponde ao efeito máximo de contração demonstrada anteriormente nas preparações com endotélio intacto e pré - contraídas com Phe (0,1µM) (Figura 26).
% d a co n tra çã o P h e 1 µ M 0 20 40 60 80 100 120
Phe 1 µM Phe 1 µM Phe 1 µM Ca 2+ zero Ca 2+
Veneno (30µg/mL)
Figura 26. Efeito do veneno total da C. d. cumanensis (30µg/mL) em anéis de aorta pré- contraídos por fenilefrina (Phe 0,1µM) em meio ausente de cálcio. Valores expressos em média ± E.P.M., teste “t” de Student, *p<0,05.
¾ Efeito da crotoxina isolada da Crotalus durissus cumanensis em aorta isolada
O efeito da fração crotoxina isolada do veneno da serpente C.d.cumanensis foi avaliado em preparações de anel de aorta com endotélio intacto pré-contraídas com fenilefrina (Phe 0,1µM; n=4) ou potássio (K+ 40 mM; n=4) (Figuras 27 e 28, respectivamente). Nos ensaios com aorta pré-contraída com fenilefrina foi observada uma discreta diminuição da contratilidade e quando pré-contraída com potássio, os anéis de aorta não apresentaram qualquer alteração significativa na contratilidade da musculatura vascular em relação ao efeito obtido na ausência da fração.
Figura 27. Curva concentração – resposta da crotoxina isolada do veneno da C. d. cumanensis em aorta com o endotélio intacto (●, n = 4; 0,1 – 30 µg/mL) tecido com Phe 0,1µM. Valores expressos em média ± E.P.M. com análise estatística Tukey, *p < 0,05.
Concentração de crotoxina (µg/mL) 0,1 1 10 100 % C o n ce n tra çã o Ph e 0 ,1 µ M 40 60 80 100 120 140
Figura 28. Curva concentração – resposta da crotoxina isolada do veneno da C. d. cumanensis em aorta com o endotélio intacto (●, n = 4; 0,1 – 30 µg/mL) tecido com K+ 40 mM. Valores expressos em média ± E.P.M.com análise estatística análise de variância Holm-Sidak, *p < 0,01.
Concentração de crotoxina (µg/mL)
0,1 1 10 100%
C
o
n
tra
çã
o
K
+4
0
m
M
40 60 80 100 120 1406 DISCUSSÃO
As abordagens toxicológicas e farmacológicas com venenos de serpentes são temas de estudos de grande relevância devido aos inúmeros casos de acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. A fisiopatologia dos envenenamentos por serpentes envolve uma série de eventos complexos que dependem da ação combinada dos componentes dos venenos (CHANDRASHEKARA et al., 2009).
O gênero Crotalus é representado no Brasil por uma única espécie, a Crotalus durissus, e apresenta a maior taxa de mortalidade entre as serpentes peçonhentas brasileiras (BRASIL, 2001). A toxicidade do veneno crotálico é responsável por uma mistura de componentes biologicamente ativos (BORTOLIN, 2005). Muitos fatores, incluindo a filogenia, o sexo e a origem geográfica do animal, podem influenciar na atividade tóxica (CHIPPAUX, 1991 apud QUEIROZ et al., 2008).
Os efeitos do veneno da Crotalus durissus cumanensis na função renal e na contratilidade aórtica não possuem relatos na literatura, embora esteja descrito a capacidade dos venenos crotálicos de induzir neurotoxicidade, desordens na coagulação, miotoxicidade e falência renal aguda (AGUILAR et al., 2001; GIRÓN et al., 2003; YOSHIDA-KANASHIRO et al., 2003),
No presente estudo, a infusão do veneno da C. d. cumanensis (10µg/mL) em rim isolado ocasionou um aumento na pressão de perfusão, na resistência vascular renal e uma redução do ritmo de filtração glomerular, do fluxo urinário e do percentual de transporte tubular de sódio e cloreto. No entanto, o veneno na concentração de 3µg/mL não apresentou alterações significativas nos parâmetros renais avaliados.
Estes resultados são diferentes dos efeitos renais dos venenos obtidos de outras subespécies crotálicas. Utilizando o mesmo modelo experimental, Martins e colaboradores (1998) observaram um aumento da pressão de perfusão e do fluxo
urinário com decréscimo do ritmo de filtração glomerular após adição do veneno da C. d. cascavella. Efeitos distintos também aos encontrados por Monteiro e colaboradores (2001), que observaram que a infusão do veneno da C. d. terrificus, aumentou o ritmo de filtração glomerular e do fluxo urinário. Em adição, o veneno da C. d. collilineatus diminuiu todos os parâmetros renais tais como, pressão de perfusão, resistência vascular renal e ritmo de filtração glomerular (AMORA et al., 2006).
De modo geral, estes trabalhos corroboram com a existência da variação intraespecífica dos efeitos biológicos induzidos pelos venenos crotálicos. Santoro e colaboradores (1999) demonstraram as diferenças nas atividades biológicas entre os venenos da C. d. collilineatus, C. d. cascavella e C. d. terrificus. Além disso, os mesmos autores relatam que as subespécies que habitam a região Norte da América do Sul e América Central, como a serpente em estudo C. d. cumanensis, apresentam um veneno característico que se assemelha às serpentes da América do Norte, sugerindo que a origem geográfica da espécie pode explicar essas diferenças.
Os efeitos do veneno da C. d. cumanensis na pressão de perfusão e na resistência vascular renal provavelmente estão envolvidos na diminuição do ritmo de filtração glomerular, por meio de um decréscimo nas forças que favorecem a ultrafiltração. Em muitos envenenamentos é relatada a ocorrência da diminuição do ritmo de filtração glomerular quando ocorre um aumento na resistência vascular renal (SITPRIJA, 2006). Uma possível explicação para estes efeitos é a existência de uma resposta vasoconstritora induzida pelo veneno.
Estudos experimentais sugerem que a patogêneses das lesões renais induzidas por venenos crotálicos, está relacionada com a ocorrência de rabdomiólise, vasoconstrição e toxicidade direta nas células tubulares (PINHO et al., 2008). Essas alterações podem ocorrer de forma direta ou através da síntese e liberação de mediadores vasoativos, tais como óxido nítrico, prostaglandinas, endotelinas e adenosina (OLDROYDE et al., 2000; SCHRIER et al., 2004).
No rim, as endotelinas são secretadas no compartimento basolateral do endotélio pelas células mesangiais e tubulares renais se comportando também como mediador de liberação de outros hormônios (BRAGA, 2006). Sua ação ocasiona uma vasoconstrição das arteríolas aferentes e eferentes aumentando a resistência vascular renal (ZANATTA et al., 2008). Entretanto, a adenosina, nos rins, pode induzir tanto uma vasoconstrição como vasodilatação através dos receptores A1 eA2,
respectivamente, mediando um feedback túbulo-glomerular (SPIELMAN et al., 1991, apud, OLDROYD et al., 2000).
A fração crotoxina foi estudada para investigar o provável causador destes efeitos, uma vez que é o principal constituinte encontrado nos venenos crotálicos (MARTINS, et al., 2002; PONCE-SOTO et al., 2002). No presente trabalho, crotoxina apresentou ser um constituinte biologicamente ativo. Entretanto, os resultados obtidos foram diferentes dos apresentados pelo veneno total.
Foi demonstrado em nosso trabalho, que a crotoxina (10µg/mL) ocasionou uma redução no ritmo de filtração glomerular e um aumento no fluxo urinário, contudo, não modificou a pressão de perfusão e a resistência vascular renal. Os transportes tubulares de sódio, potássio e cloreto foram diminuídos durante o período de perfusão. Alterações no RFG podem conduzir a um reajuste proporcional na taxa de reabsorção de fluido tubular proximal, fenômeno denominado de balanço túbulo- glomerular.O declínio agudo da filtração glomerular juntamente com uma disfunção tubular, são características principais de danos renais, sendo um importante prognóstico na insuficiência renal aguda (DAGHER et al., 2003; GROESDANK et al., 2009).
Nossos resultados foram similares a crotoxina isolada do veneno da C.d.collilineatus, que causou um decréscimo no ritmo de filtração glomerular e nos transportes tubulares de potássio e cloreto (AMORA et al., 2006). Porém, Martins e colaboradores (2002) mostraram que as alterações induzidas pela crotoxina da C. d. cascavella possuíam o mesmo perfil dos efeitos causados pela C. d. terrificus (MONTEIRO et al., 2001), promovendo um aumento na pressão de perfusão, na resistência vascular renal e no fluxo urinário. Estudos têm demonstrado que nos venenos da C. d. terrificus, C. d. collilineatus e C. d. cascavella existem isoformas de
crotoxina, decorrentes da mistura de variantes das subunidades crotapotina (CA) e fosfolipase A2 (CB). Esta variação proporciona ações distintas, constituindo um caso
de sinergismo molecular em que a subunidade CA potencializa os efeitos tóxicos da subunidade CB (RANGEL-SANTOS et al., 2004; SOARES et al., 2001).
O presente estudo avaliou a citotoxicidade induzida pelo veneno e crotoxina da C. d. cumanensis nas células tubulares renais, MDCK. Os ensaios com culturas de células podem promover um maior entendimento de toxicidade de diferentes componentes. Em relação ás pesquisas com venenos de serpentes, em particular os estudos de nefrotoxicidade, as culturas celulares nos permitem avaliar um possível efeito tóxico direto em um curto período de tempo (OLIVEIRA et al., 2002; GIRÓN et al., 2005).
Nossos resultados demonstraram uma atividade citotóxica direta in vitro do veneno total com diminuição da viabilidade celular dependente da concentração, com alterações morfológicas, tais como agregado celulares e citoplasmas granulosos. Resultados semelhantes foram observados com o veneno da Crotalus vegrandis sobre células renais cultivadas a partir do córtex renal de ratos (GIRÓN et al., 2005). Collares-Buzato e colaboradores (2002) demonstraram um efeito citotóxico do veneno total da Bothrops moojeni em células MDCK, com mudanças na morfologia ultraestrutural que incluiu vacuolização citoplasmática, “inchaço” mitocondrial e, em alguns casos, sinais de degeneração nuclear. Os autores sugerem ainda que estes dados fortalecem as evidência de que a falência renal aguda induzida pelo veneno da B.moojeni é resultante do efeito direto dos componentes do veneno no epitélio renal.
Por outro lado, a crotoxina isolada do veneno da C. d. cumanensis não apresentou alterações na viabilidade celular, assim, podemos sugerir que essa diferença nos resultados pode estar relacionada ao fato de que o veneno total contém diferentes toxinas que podem agir individualmente ou por sinergismo (GIRÓN et al., 2005). Além disso, Pereañez e colaboradores (2009) identificaram diferentes isoformas da subunidade crotapotina do veneno da C. d. cumanensis, denominadas Cdcum1 e Cdcum5. A existência dessas isoformas afeta diretamente a atividade
tóxica da crotoxina, uma vez que, diferentes associações entre as subunidades CA e CB ocasionam instabilidade na toxina, favorecendo a dissociação e consequentemente diminuindo a ação tóxica.
A fim de se verificar a hipótese da ação vasoconstritora do veneno nos ensaios de perfusão renal, foram realizados experimentos em aorta isolada. Nossos ensaios revelaram que o veneno não alterou a contratilidade dos anéis de aorta mantidos sob tensão basal, porém, promoveu um aumento da resposta contrátil quando foram previamente contraídos com fenilefrina e potássio em preparações providas de endotélio. Em contraste, este efeito potencializador não foi observado nas preparações ausente de endotélio, em que se demonstrou um miorelaxamento dos anéis de aorta. Assim, é sugestivo considerarmos que os efeitos renais induzidos pelo veneno da C. d. cumanensis pode ser devido à sua ação no endotélio vascular com liberação de fatores endotelial que podem alterar o comportamento contrátil do músculo liso vascular.
Vários mecanismos estão envolvidos na contração do tecido liso vascular. As células musculares lisas podem contrair de uma forma direta, através de seus receptores específicos para neurotransmissores e de forma indireta, através da liberação de substâncias derivadas do endotélio. Além destes mecanismos, o influxo de cálcio através da membrana e a liberação dos estoques intracelulares têm papel fundamental na contração vascular (JACKSON, 2008).
O efeito vasoconstritor do veneno em aorta é nitidamente dependente da integridade do endotélio, sendo este capaz de sintetizar e secretar substâncias vasoconstritoras, tais como endotelinas, prostaglandinas H2, tromboxano A2, em
resposta a um estresse ou fator circulante (COELHO et al., 2002). Adicionalmente, o veneno não alterou as contrações transitórias induzidas pela fenilefrina em meio ausente de cálcio indicando que sua ação é mais específica.
Peptídeos vasoconstritores têm sido encontrados em alguns venenos de serpentes, tais como sarafotoxina e o peptídeo inibidor da bradicinina (GRAHAM et al., 2005). O isopeptídeo sarafotoxina, constituinte do veneno do gênero Atractasips,
é estruturalmente e funcionalmente semelhante ao componente vasoconstritor endotelina (DUCANCEL et al., 2005). Além disso, Graham e colaboradores (2005) demonstram que o peptídeo inibidor da bradicinina pode ser uma importante ferramenta na identificação de alvos moleculares.
No entanto, a crotoxina nas concentrações estudadas, não alterou a contratilidade em anéis de aorta isolada e nem nos parâmetros de fisiológicos renais estudados, assim, possivelmente os efeitos renais e vasculares do veneno da Crotalus durissus cumanensis são causados pela participação de outras frações que compõe o veneno ou pela ação sinérgica dos diferentes compostos.
7 CONCLUSÕES
O veneno da serpente Crotalus durissus cumanensis foi capaz de induzir alterações nos parâmetros renais em modelo de rim isolado de rato, promovendo aumento na pressão de perfusão e na resistência vascular renal e redução no ritmo de filtração glomerular e no fluxo urinário.
A fração crotoxina causou uma diminuição do ritmo de filtração glomerular e aumento no fluxo urinário. Os transportes tubulares de sódio, potássio e cloreto foram também diminuídos após infusão da crotoxina.
O veneno total da C. d. cumanensis causou um efeito citotóxico direto dependente da concentração em células tubulares renais MDCK.
Em anéis de aorta o veneno causou um aumento da contratilidade induzida por fenilefrina e potássio dependente da integridade do endotélio.
Sugere-se que os efeitos tóxicos produzidos pelo veneno da Crotalus durissus cumanensis em rim e aorta isolada, provavelmente deve-se a participação de outras frações ou a um sinergismo dos componentes que compõe o veneno total.