4 RESULTADOS
4.3 Efeitos do desenvolvimento tumoral sobre o hospedeiro
O desenvolvimento do tumor promoveu alterações significativas no peso relativo de diferentes órgãos. O peso relativo de fígado, baço e adrenais apresentaram-se aumentado nos animais do grupo W (Tabela 2). Com exceção ao fígado, o peso relativo de baço e adrenais foi menor no grupo WM quando comparado ao W, embora ainda sejam maiores quando comparado ao grupo C (Tabela 2).
O peso relativo do tecido adiposo (gordura perirrenal e inguinal) foi reduzido tanto no grupo W quanto no WM em comparação aos respectivos controles (Tabela 2); quando a comparação foi feita apenas entre os grupos
W256 LLC-WRC 256 W256 LLC-WRC 256
Y0 10000 10000 30000 30000
k 0,02852 0,02800 0,02091 0,02401
Tempo de duplicação (h) 24,30 24,76 33,15 28,87
Figura 7. Evolução da curva de crescimento de células W256 e LLC-WRC 256, em função do tempo de cultivo, até 10 dias após plaqueamento. Células W256 e LLC-WRC 256 foram
cultivadas em duas concentrações diferentes e pelo tempo indicado no gráfico. As células W256 estavam na sexta passagem enquanto que o número de passagens das células LLC-WRC 256 é desconhecido. O gráfico representa a média de três experimentos independentes.
portadores de tumor, nota-se que os animais do grupo WM tiveram maior massa adiposa que os animais do grupo W (Tabela 2).
Já o peso relativo do músculo gastrocnêmio apresentou-se reduzido apenas no grupo W (Tabela 2).
Tabela 2. Pesos relativos de órgãos (%) e peso final dos animais experimentais medidos após a eutanásia
Legenda: C, ratos controle; W, ratos portadores do tumor de Walker 256; M, ratos tratados com metformina 500 mg/Kg/dia; WM, ratos portadores do tumor de Walker 256 e tratados com 500 mg/Kg/dia. n = 12. **p< 0,01 vs C; ***p< 0,001 vs C; # p< 0,05 vs W; ## p< 0,01 vs W.
Tabela 3. Parâmetros séricos dos animais dos diferentes grupos experimentais, após jejum de 12 h.
C W M WM
Média ± SEM Média ± SEM Média ± SEM Média ± SEM Glicose (mg/dL) 102,0 ± 6,9 62,5 ± 6,7*** 101,4 ± 6,3 85,9 ± 2,8* ##
Proteínas totais (g/dL) 4,32 ± 0,09 3,62 ± 0,06*** 4,20 ± 0,17 4,22 ± 0,10##
Albumina (g/dL) 2,82 ± 0,04 2,35 ± 0,06*** 2,76 0,06 2,57 ± 0,05#
Lactato (mg/dL) 0,49 ± 0,05 0,64 ± 0,02* 0,36 ± 0,01 0,49 ± 0,03#
C W M WM
Média ± SEM Média ± SEM Média ± SEM Média ± SEM
Fígado (%) 4,6 ± 0,2 6,6 ± 0,3*** 5,3 ± 0,2 6,3 ± 0,3*** Baço (%) 0,42 ± 0,02 1,68 ± 0,20*** 0,44 ± 0,01 1,13 ± 0,10*** # Adrenal (%) 0,015 ± 0,001 0,026 ± 0,001*** 0,018 ± 0,001 0,022 ± 0,001*** # Gordura perirrenal (%) 1,17 ± 0,10 0,36 ± 0,06*** 0,83 ± 0,09 0,61 ± 0,08*** # Gordura epididimal (%) 0,77 ± 0,04 0,52 ± 0,04*** 0,61 ± 0,03 0,59 ± 0,04** Músculo gastrocnêmio (%) 0,65 ± 0,03 0,53 ± 0,02** 0,66 ± 0,01 0,60 ± 0,01## Peso final (g) 181,6 ± 5,8 152,3 ± 5,3** 167,6 ± 5,9 170,3 ± 6,0#
Legenda: C, ratos controle; W, ratos portadores do tumor de Walker 256; M, ratos tratados com metformina 500 mg/Kg/dia; WM, ratos portadores do tumor de Walker 256 e tratados com 500 mg/Kg/dia. Idade dos animais no momento da análise dos parâmetros séricos: aproximadamente 45 dias de idade. n = 8. * p<0,05 vs C; **p< 0,01 vs C; ***p< 0,001 vs C; # p< 0,05 vs W; ## p< 0,01 vs W.
C, ratos controle; W, ratos portadores do tumor de Walker 256; M, ratos tratados com metformina 500 mg/Kg/dia; WM, ratos portadores do tumor de Walker 256 e tratados com 500 mg/Kg/dia. n = 12. **p< 0,01 vs C; ***p< 0,001 vs C; # p< 0,05 vs W; ## p< 0,01 vs W
C, ratos controle; W, ratos portadores do tumor de Walker 256; M, ratos tratados com metformina 500 mg/Kg/dia; WM, ratos portadores do tumor de Walker 256 e tratados com
A concentração de glicose foi reduzida nos animais W, enquanto que nos animais WM a concentração foi igual aos grupos C e M. Da mesma forma, tanto as concentrações séricas de proteínas totais quanto de albumina foram reduzidas no grupo W; já no grupo WM, as concentrações foram iguais aos grupos C e M (Tabela 3).
A concentração de lactato apresentou-se aumentada no grupo W quando comparado ao grupo C; já o grupo WM apresentou concentração igual ao grupo C (Tabela 3).
4.4 Efeitos da metformina sobre a proliferação de células
tumorais
O peso relativo do tumor foi reduzido em 38% no grupo WM quando comparado ao grupo W (Figura 8).
Considerando que o peso do tumor foi reduzido nos animais tratados com metformina, analisou-se a proliferação dessas células por meio de imunohistoquímica para a proteína Ki-67, que é expressa durante a intérfase (G1, S e G2) e mitose, porém ausente em G0.
Figura 8. Peso relativo de tumor em relação à carcaça dos animais dos diferentes grupos experimentais. As barras representam o peso do tumor medido após a eutanásia e sua
porcentagem em relação ao peso da carcaça. Os dados representam as médias ± SEM. Legenda: W, ratos portadores do tumor de Walker 256; WM, ratos portadores do tumor de Walker 256 e tratados com 500 mg/Kg/dia. n = 12; ### p< 0,001 vs W.
Dessa forma, é considerada como marcador para o processo de proliferação. Como pode ser observado na Figura 9A e B, o tratamento com metformina reduziu em 80% a proliferação de células tumorais.
Também se analisou a expressão do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA, Proliferating Cell Nuclear Antigen), uma proteína nuclear não
Figura 9. Proliferação celular no tecido do tumor de Walker 256 do grupo tratado com metformina comparado ao não tratado. A, Imagem representativa da imunohistoquímica de
tecido tumoral para a proteína Ki-67; Aumento de 200 X. As setas demonstram a característica de células positivamente marcadas para Ki-67 (núcleo com coloração marrom devido a precipitação de DAB). B, quantificação do número de células positivamente marcadas para Ki- 67; C, Imagem representativa de western blot para PCNA; D, quantificação da expressão de PCNA (valores normalizados em relação ao grupo W); Legenda: W, ratos portadores do tumor de Walker 256; WM, ratos portadores do tumor de Walker 256 e tratados com 500 mg/Kg/dia. n = 4. # p < 0,05 vs W; ### p < 0,001 vs W; Valores expressos como média e erro padrão da média.
histônica, necessária para a síntese de DNA e também acessória à DNA polimerase, que tem sua expressão elevada durante a fase G1/S no ciclo celular e que desaparece no final da mitose. Portanto, é considerada uma proteína marcadora para proliferação celular. A expressão de PCNA, assim como a expressão de Ki-67, também foi reduzida no grupo WM quando comparada ao grupo W (Figura 9C e D).
Adicionalmente, analisou-se o efeito do tratamento com metformina sobre a proliferação e viabilidade de células tumorais in vitro.
Assim como encontrado no tecido tumoral, a metformina reduziu a proliferação de células W256 (Figura 10). O número de células viáveis foi reduzido em função do tempo de tratamento (M 24 h foi 30% menor que C 24 h;
Figura 10. Evolução da proliferação e viabilidade de células Walker 256 em cultura sob o tratamento ou não com metformina. Células do tumor de Walker 256 foram cultivadas
conforme descrito em Materiais e métodos e tratadas com metformina por 24, 48 e 78 h. A contagem de células viáveis (A) e mortas (B) foi realizada utilizando-se o método de exclusão com azul de tripan. Valores percentuais de células vivas e mortas (C). Percentual de células viáveis utilizando-se o método de redução de MTT (D). Os experimentos foram realizados em triplicatas e repetidos 3 vezes. Valores expressos como média ± SEM. *p < 0,05 vs C 24 h; **p < 0,01 vs C 24 h; *** p < 0,001 vs C 24h; ### p < 0,001 vs 48 h.
M 48 h foi 32% menor que C 48 h; M 72 h foi 72% menor que C 72h) (Fig. 10A e C). De maneira inversa, o número de células mortas aumentou em função do grupo tratado com metformina, também de maneira tempo-dependente (Fig. 10B e C).
Para explorar ainda mais o efeito do tratamento com metformina sobre a proliferação de células tumorais, analisou-se a síntese de DNA e a capacidade de formação de colônias.
Figura 11. A metformina reduziu a capacidade proliferativa de células W256. Células W256
foram plaqueadas e tratadas ou não com 10 mM de metformina. (A) incorporação de [metil-
3H]timidina. (B) após o tempo indicado no gráfico, essas células foram tripsinizadas e apenas as
células viáveis foram novamente plaqueadas com concentração igual a 2,5 x 102 células por
poço, em placas de 6 cavidades. Após 9 dias de cultivo, as células foram fixadas e coradas com cristal violeta. (C) imagem representativa das colônias formadas quando as células foram tratadas por 72 h. As barras representam a média de três experimento realizado em triplicata ± SEM. ** p < 0,01 vs C 24 h; *** p < 0,001 vs C 24 h; # p < 0,05 vs M 24 h.
Como pode ser observado na Figura 11A, a síntese de DNA foi reduzida pela metformina; sendo reduzida em 36% em M 24 h; 43% M 48 h, 38% M 72 h em relação aos respectivos controles (C 24h, C 48h e C 72h).
Da mesma forma, o tratamento com metformina reduziu a capacidade das células em gerar colônias, sendo significativamente menor em 46% no M 24h; 56% M 48h; e 86% M 72h em relação ao respectivo controle C 24h, C 48h e 72 h (Figura 11B e C).
Figura 12. Alterações morfológicas em células W256 promovidas pela metformina. Células
W256 foram plaqueadas em placas de 6 poços e tratadas com metformina 10 mM (D, 24 h; E, 48 h; F, 72 h) ou não (A, 24 h; B, 48 h; C, 72 h); as células foram fixadas e coradas com Giemsa. Imunofluorescência para evidenciar alterações no citoesqueleto de células W256 tratadas com metformina 10 mM por 24 h (G), 48 h (H) ou 72 h (I). Microfilamentos de actina (vermelho) e núcleo (azul) podem ser identificados na figura. Barra = 50 µm. Aumento de 200X. As setas indicam células com alteração em sua morfologia. Imagens representativa de pelo menos três experimentos independentes.
A morfologia das células W256 foi drasticamente alterada pelo tratamento com metformina 10 mM, quando essas células foram incubadas por 72 horas. Como pôde ser observado na Figura 12, as células apresentaram desarranjo em seu citoesqueleto, indicando comprometimento da sua viabilidade.
4.5 Efeitos do tratamento com metformina no processo de
apoptose de células neoplásicas
Observou-se que o efeito do tratamento com metformina sobre a expressão de proteínas relacionadas ao processo de apoptose, tanto in vivo quanto in vitro (Figuras 13 e 14, respectivamente), aumentou, de maneira geral, o processo de morte celular por meio dessa via.
A expressão de Bax foi aumentada em 100%, aproximadamente, enquanto que a Bcl-2 foi diminuída em 50%, aproximadamente, no grupo WM quando comparado ao grupo W (Figura 13A, B e C). A relação entre Bax/Bcl-2 foi maior no grupo WM que no grupo W (Figura 13 D). A expressão de p53 foi maior no grupo WM, da mesma forma que a sua fosforilação, quando comparado ao grupo W; em ambas situações, houve aumento de, aproximadamente, 50% na expressão da proteína (Figura 13A, F e G).
A metformina aumentou tanto a clivagem da pro-caspase 3/7 quanto sua atividade. A expressão de caspase 3 clivada no tecido tumoral do grupo WM foi aproximadamente o dobro daquela observada no grupo W (Figura 13A e E). A atividade dessa enzima no tecido foi aumentada em cerca de 20% quando comparada ao a atividade do grupo W (Figura 13H).
Com relação aos procedimentos in vitro, as células W256 apresentaram padrão semelhante àquelas do tecido tumoral. A expressão de ciclina D1 apresentou o mesmo padrão, ou seja, acentuada diminuição quando as células foram submetidas ao tratamento com metformina 10 mM por 48 h (Figura 14A e C). A expressão de caspase 3 clivada foi muito aumentada nas culturas tratadas com metformina por 48 h, enquanto que a atividade dessa enzima nas mesmas condições também foi aumenta, porém de maneira bem menos pronunciada (Figura 14A, D).
Figura 13. Efeito do tratamento com metformina no processo de apoptose no tecido tumoral de ratos portadores do tumor de Walker 256. (A) Imagem representativa da
expressão de proteínas relacionadas ao processo de apoptose, realizada por immunoblot (como descrito em Materiais e métodos). (B-G) Quantificação da expressão de proteínas realizada por
immunoblot relacionadas a apoptose. Os valores foram normalizados pela expressão de α-
tubulina e expressos como porcentagem em relação ao Grupo W. (H) Atividade de caspases 3 e 7. Legenda: W, ratos portadores do tumor de Walker 256; WM, ratos portadores do tumor de Walker 256 e tratados com metformina 500 mg/Kg/dia. n = 6. # p< 0,05 vs W; ## p< 0,01 vs W; ### p<0,001 vs W.