UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
ANDRÉ GUSTAVO DE OLIVEIRA
EFEITOS DO TRATAMENTO COM METFORMINA
SOBRE O DESENVOLVIMENTO DO TUMOR DE
WALKER 256 E O METABOLISMO PROTEICO
MUSCULAR EM RATOS WISTAR.
CAMPINAS 2016
EFEITOS DO TRATAMENTO COM METFORMINA SOBRE O
DESENVOLVIMENTO DO TUMOR DE WALKER 256 E O
METABOLISMO PROTEICO MUSCULAR EM RATOS WISTAR
.Tese apresentada ao
Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do Título de Doutor em BIOLOGIA FUNCIONAL E MOLECULAR, na Área de FISIOLOGIA
Orientador: PROFA. DRA. MARIA CRISTINA CINTRA GOMES MARCONDES
CAMPINAS 2016
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO ANDRÉ GUSTAVO DE OLIVEIRA E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARIA CRISTINA CINTRA GOMES MARCONDES
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes (Orientadora) Profa. Dra. Dora Maria Grassi Kassisse
Prof. Dr. Marcelo Bispo de Jesus Prof. Dr. Carlos Alberto da Silva Prof. Dr. Anderson Luiz Ferreira
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho a meu filho Felipe, que alegra meus dias e faz eu me esforçar
À professora Dra. Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes, por sua orientação e ensinamentos ao longo de todos esses anos.
À CAPES, pelo apoio financeiro a esse trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Nutrição e Câncer, especialmente ao Bread e ao Gustavo.
Aos professores que participaram do exame de qualificação, Dra. Dora Maria Grassi Kassisse, Dra. Cristina Pontes Vicente e Dr. Marcelo Bispo de Jesus, pelas ótimas contribuições para melhoria deste trabalho.
Aos funcionários e docentes do Departamento de Biologia Funcional e Estrutural do IB – UNICAMP.
À minha família, que sempre me apoiou e incentivou a seguir na carreira acadêmica.
À minha amada esposa, Keli, pelo apoio, companheirismo, ótimos conselhos, e especialmente, por fazer minha vida mais feliz.
O desenvolvimento de câncer muitas vezes está associado ao quadro de caquexia. A caquexia caracteriza-se por acentuada perda de peso do hospedeiro, tanto de massa magra quanto de massa gorda. Embora a caquexia seja uma doença multifatorial, a resposta do hospedeiro ao desenvolvimento tumoral, fatores secretados pelo tumor e fatores humorais desempenham funções essenciais no estabelecimento desse quadro. Dentre os fatores secretados pelo tumor, há o fator indutor de proteólise, que é uma glicoproteína responsável por aumentar a degradação de proteínas no músculo esquelético. Aventa-se que a metformina, um anti-hiperglicemiante oral, apresenta potencial contra o desenvolvimento de tumores pois causa seus efeitos pela ativação de AMPK. A mTOR, que é uma proteína chave em vias que controlam a síntese de proteínas é inibida pela AMPK e, portanto, pelo tratamento com metformina. Para testar essa hipótese, avaliou-se o efeito do tratamento com metformina sobre o desenvolvimento do tumor, utilizando como modelo o tumor de Walker 256, tanto in vivo quanto in vitro, e sobre o metabolismo proteico do músculo gastrocnêmio de ratos Wistar. Os animais foram avaliados durante 15 dias após serem distribuídos em quatro grupos: C - controle; W - portadores do tumor de Walker 256; M - tratados, por gavagem, com metformina 500 mg/Kg de peso/dia; WM - portadores do tumor de Walker 256 e tratados com metformina 500 mg/Kg de peso/dia. Nos experimentos in vitro, as células tumorais foram tratadas com metformina 10 mM durante 24, 48 ou 72 h. O tratamento com metformina reduziu a proliferação de células tumorais, tanto in vivo quanto in vitro; o peso relativo do tumor foi 38% menor em WM comparado ao W, assim como o número de células positivamente marcadas com Ki-67 reduziu 80%. A proliferação celular e o número de colônias formadas foram 72% e 86% menores, respectivamente, em relação ao grupo sem tratamento, após 72 h. A metformina estimulou o processo de morte das células tumorais, aumentando a expressão e atividade de proteínas pró-apoptóticas, como caspase 3, e inibindo as anti-apoptóticas. No tecido tumoral, o tratamento com metformina causou aumento de 50% de p-AMPK com consequente inibição de p-mTOR e também de p-FoxO3a, comparado aos valores do grupo W. Com relação as células em cultura, também se observou aumento de p-AMPK e inibição da fosforilação tanto de mTOR quanto de FoxO3a
degradação, que são afetadas pela evolução tumoral. A expressão de p-AMPK foi diminuída 60% no WM, enquanto que p-mTOR foi reduzida 30% em W. A expressão de p-FoxO3a foi 50% menor em W, enquanto que no grupo WM foi igual ao C. Já a expressão de MuRF-1 e atrogina aumentaram 100% no W, enquanto que em WM não houve alteração comparado ao C. Dessa forma, nossos dados demostraram que o tratamento com metformina inibiu o crescimento tumoral e, como consequência, diminuiu o impacto da presença do tumor sobre o metabolismo proteico do músculo esquelético. O tratamento com metformina mostra-se promissor para melhor entender o processo de caquexia bem como possível tratamento adjuvante no combate ao câncer.
Cancer is often associated with cachexia, which is characterised by involuntary host weight loss, lean as well as fat mass. Although cachexia is a multifactorial disease leading to different host responses, the tumour growth, factors released by tumour and humoral factors play an essential role to induce this cachectic state. The proteolysis-inducing factor is a glycoprotein released by some tumors, and it is responsible for increasing the muscle proteins breakdown. It is known that metformin, an oral antihyperglycemic drug, shows a potential use against tumour growth once it activates AMPK, which inhibits the mTOR activity. The mTOR is a protein that has a pivotal position on protein synthesis pathway. To address this question, we analysed metformin effects on Walker 256 tumour growth both in vivo and in vitro, and its impact on muscle protein metabolism in Wistar rats. During 15 days of experimental protocol, the animals were allocated into four groups: C - control; W - Walker 256 tumour-bearing; M - treated by gavage with 500 mg/Kg of metformin a day; WM - Walker 256 tumour-bearing and treated with 500 mg/Kg of metformin a day. In vitro cancer cells were subject to 10 mM of metformin for 24, 48 or 72 h treatment. Metformin treatment decreased tumour cells growth both in vivo and in vitro; relative tumour weight was 38% lower in WM than in W, as well as the number of positive Ki-67 cells (80% less). The metformin treatment reduced approximately 72% of tumour cell proliferation after 72 h, while the number of colonies decreased around 86% compared to non-treated cells. Metformin promoted apoptosis in tumour cells upregulating expression and activity of proapoptotic proteins, such as caspase 3, while downregulated the expression of antiapoptotic ones. In tumour tissue, metformin treatment increased 50% of AMPK and inhibited mTOR and p-FoxO3a compared to W. In the same fashion, metformin increased p-AMPK and decreased phosphorylation of both mTOR and FoxO3a in cultured cells after 48 h. In skeletal muscle, metformin modulated key proteins in both protein synthesis and degradation pathways. AMPK phosphorylation decreased around 60% in WM while p-mTOR reduced by 30% in W. The p-FoxO3a expression was 50% decreased in W while there was no difference in WM compared to C. MuRF-1 and atrogin expression increased by 100% in W compared to C, while WM showed no difference compared to C group. Our results demonstrated that
metformin treatment could be a promising tool to better understanding the cachexia process as well as a possible adjuvant in treatment against cancer.
1 INTRODUÇÃO ... 20
1.1 Câncer e caquexia ... 20
1.2 Carcinossarcoma de Walker 256 ... 21
1.3 Vias de síntese e degradação de proteínas musculares ... 22
1.4 Fator indutor de proteólise (PIF) ... 23
1.5 Sistema ubiquitina-proteossomo ... 24
1.6 A via IRS-1/PI3K/Akt/mTOR e a regulação dos processos de síntese e degradação proteica... 25
1.7 Metformina ... 27
2 OBJETIVOS GERAIS ... 29
2.1 Objetivos específicos: ... 29
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 29
3.1 Dietas e tratamento com metformina ... 31
3.2 Isolamento e cultura de células do carcinossarcoma de Walker 256 (W256) ... 31
3.3 Dosagens sorológicas ... 32
3.4 Curva de crescimento de células W256 e LLC-WRC 256 ... 33
3.5 Teste de Citotoxicidade ... 34
3.6 Ensaio de formação de colônias ... 34
3.7 Immunoblot (Western Blot) ... 35
3.8 Imunohistoquímica... 36
3.9 Coloração com Giemsa ... 36
3.10 Imunocitoquímica/Imunofluorescência... 37
3.11 Análise hormonal ... 37
3.12 Ensaio de síntese proteica ... 38
3.13 Atividade de caspases 3 e 7 ... 39
3.14 Atividade de enzimas antioxidantes ... 40
3.15 Vias de degradação proteica ... 41
3.16 Taxa de síntese de DNA ... 42
3.17 Análise estatística ... 42
4 RESULTADOS ... 42
4.1 Padronização da concentração de metformina ... 42
4.2 Estabelecimento das condições ideais de plaqueamento para células W256 ... 45
neoplásicas ... 53
4.6 Efeitos do tratamento com metformina sobre a via IRS-1/PI3K/Akt/mTOR em células neoplásicas ... 55
4.7 Efeito do tratamento com metformina sob a expressão e atividade de enzimas antioxidantes em tecido tumoral ... 58
4.8 Efeito do desenvolvimento tumoral na concentração plasmática de insulina, glucagon e IGF-1 ... 59
4.9 Atividade de enzimas musculares responsáveis pelo processo de degradação proteica... 60
4.10 Efeitos do desenvolvimento tumoral e tratamento com metformina nas vias de síntese e degradação proteica em músculo gastrocnêmio ... 62
5 DISCUSSÃO ... 65
6 CONCLUSÕES ... 73
7 REFERÊNCIAS ... 74
8 ANEXOS ... 80
8.1 Autorização para alteração do título do projeto ... 80
8.2 Certificado da Comissão de Ética no uso de animais ... 81
Figura 1. Vias de sinalização responsáveis pelos processos de síntese e
degradação proteica no músculo esquelético ... 23 Figura 2. A ubiquitinação e degradação de substratos proteicos são obtidas por
reações em série mediadas pelas enzimas do sistema ubiquitina
proteossomo (UPS) ... 25 Figura 3. Estrutura química da metformina ... 27 Figura 4. Evolução de ganho de peso dos animais controles e tratados com
diferentes concentrações de metformina. ... 43 Figura 5. Expressão de p-AMPK em relação a AMPK no músculo gastrocnêmio
de animais tratados com diferentes concentrações de metformina em
comparação com animais controles ... 44 Figura 6. Fosforilação tempo-dependente de AMPK em células W256 tratadas
com metformina ... 45 Figura 7. Evolução da curva de crescimento de células W256 e LLC-WRC 256,
em função do tempo de cultivo, até 10 dias após plaqueamento. ... 46 Figura 8. Peso relativo de tumor em relação à carcaça dos animais dos
diferentes grupos experimentais.. ... 48 Figura 9. Proliferação celular no tecido do tumor de Walker 256 do grupo
tratado com metformina comparado ao não tratado. ... 49 Figura 10. Evolução da proliferação e viabilidade de células Walker 256 em
cultura sob o tratamento ou não com metformina ... 50 Figura 11. A metformina reduziu a capacidade proliferativa de células W256. 51 Figura 12. Alterações morfológicas em células W256 promovidas pela
metformina. ... 52 Figura 13. Efeito do tratamento com metformina no processo de apoptose no
tecido tumoral de ratos portadores do tumor de walker 256 ... 54 Figura 14. Efeito do tratamento com metformina, in vitro, no processo de
apoptose em células W256 ... 55 Figura 15. Efeito da metformina na via AMPK/Akt/mTOR no tecido tumoral de
Walker 256 ... 56 Figura 16. Efeito da metformina na via AMPK/Akt/mTOR em cultura de células
Figura 18. Expressão e atividade de enzimas antioxidantes SOD e calatase no tecido tumoral de Walker 256 ... 59 Figura 19. Variação da concentração hormonal sérica dos diferentes grupos
experimentais ... 60 Figura 20. Efeito do tratamento com metformina na atividade de enzimas das
três principais vias de degradação proteica no músculo gastrocnêmio ... 61 Figura 21. Efeito do tratamento com metformina na expressão de enzimas
responsáveis pelo processo de síntese proteica em músculo gastrocnêmio dos diferentes grupos experimentais ... 63 Figura 22. Efeito do tratamento com metformina na expressão de enzimas
responsáveis pelo processo de degradação proteica em músculo nos diferentes grupos experimentais ... 64 Figura 23. Efeito do tratamento com metformina em células tumorais, tanto in
vivo quanto in vitro ... 68 Figura 24. Efeitos do crescimento tumoral nos processos de síntese e
degradação proteica no músculo gastrocnêmio ... 71 Figura 25. Efeito do tratamento com metformina nos processos de síntese e
degradação proteica no músculo gastrocnêmio ... 73
Tabela 1. Curva de crescimento das células W256 e LLC-WRC 256. ... 46 Tabela 2. Pesos relativos de órgãos (%) e peso final dos animais experimentais medidos após a eutanásia ... 47 Tabela 3. Parâmetros séricos dos animais dos diferentes grupos experimentais, após jejum de 12 h. ... 47
4E-BP1: proteína de ligação ao fator eucariótico de iniciação da tradução 4E (eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1)
AKT/PKB: proteína quinase B (protein kinase B)
AMPK: proteína quinase ativada por AMP (5' AMP-activated protein kinase) AMP: adenosina 3',5'-monofosfato (3',5' adenosine monophosphate)
AUC: área sob a curva (area under curve)
Brij-35: polioxietilenolauril éter (polyethylene glycol dodecyl) CaCl2: cloreto de cálcio
C2C12: linhagem celular de mioblasto de camundongo
CHAPS: 3-[(3-colamidopropil)-dimetil-amônio]-1-propano-sulfonato (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)
CPM: contagens por minuto
DAB: 3,3' Diaminobenzidina tetrahidrocloreto DCD: dermicidina
DMT2: Diabetes Mellitus tipo 2
DNA: ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid) DMSO: dimetil sulfóxido (dimethyl sulfoxide)
DTT: ditiotreitol (dithiothreitol)
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético (ethylenediaminetetraacetic acid) eIF4A: fator de iniciação eucariótico 4A (Eukaryotic initiation factor 4A) eIF4F: fator de iniciação eucariótico 4F (Eukaryotic initiation factor 4F) eIF4G: fator de iniciação eucariótico 4G (Eukaryotic initiation factor 4G) FoxO: fator de transcrição Forkhead (Forkhead transcription factors)
HEPES: ácido 2-[4[(2-hidroxietil)1-piperazinil]-etanosulfônico (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid)
IGF-1: Fator de crescimento semelhante à insulina (insulin-like growth factor 1) IGF-1R: receptor de IGF-1 (insulin-like growth factor receptor)
IR: receptor de insulina (insulin receptor)
IRS-1: substrato do receptor de insulina (insulin receptor substrate-1)
Ki-67: antígeno Ki-67
KHB: tampão de Krebs-Henseleit (Krebs-Henseleit buffer)
LLC-WRC 256: linhagem de células do tumor de Walker 256, doadas pelo Instituto Butantã
MAPK: proteína quinase ativada por mitógeno (mitogen-activated protein kinase)
MnSOD: superoxido dismutase mitocondrial
mTOR: proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mammalian target of rapamycin)
mTORC1: complexo 1 do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR Complex 1)
mTORC2: complexo 2 do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR Complex 2)
MTT: brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5-difenil-2H tetrazólio (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)
MuRF1: proteína RING-finger de músculo (muscle RING-finger protein-1) NaN3: azida sódica
NBT: nitroazul de tetrazólio (nitro blue tetrazolium)
NMRI: linhagem de camundongos (naval medical research institute) OCT: transportador de cátions orgânicos (organic cation transporter) PA: pureza absoluta
PBS: tampão fosfato-salino (phosphate-buffered saline)
PCNA: antígeno nuclear de proliferação celular (proliferating cell nuclear antigen)
PIF: fator indutor de proteólise (proteolysis-inducing factor) PI3K: fosfatidilinositol 3-quinase (phosphatidyllinositol-3 kinase)
PIKK: quinase da família da fosfatidilinositol quinase (phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-related 3-kinase)
PPi: pirofosfato
S6K1: proteína quinase ribossomal S6 (Ribosomal protein S6 kinase 1) SLS: Lauril sulfato de sódio (sodium lauryl sulfate)
Smad: proteina semelhante ao fator de crescimento transformador β (Small protein mothers against decapentaplegic)
SOD: superóxido dismutase
TA: temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) TCA: ácido tricloroacético (trichloroacetic acid)
TGFβ: fator de crescimento transformador β (transforming growth factor β)
Tris: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol RAS: proteína RAS
Y-P30: fator de sobrevivência neuronal (neuronal survival factor) W256: linhagem de células do tumor de Walker 256, estabelecidas no laboratório de Nutrição e Câncer, IB - UNICAMP.
1 INTRODUÇÃO
Câncer, a segunda patologia com maior taxa de mortalidade no mundo, ficando atrás apenas das doenças cardiovasculares (“World Health Organization - International Agency for Research on Cancer,” 2014). Em 2012, segundo a Organização Mundial da Saúde, foram registrados 14 milhões de novos casos de câncer, sendo que 8,2 milhões de pessoas morreram em decorrência dessa doença em todo o mundo (“World Health Organization - International Agency for Research on Cancer,” 2014). Da mesma forma, segundo o Ministério da Saúde, o câncer também é a segunda maior causa de morte no Brasil, perdendo apenas para as doenças cardiovasculares, e, de acordo com as estatísticas do Instituto Nacional do Câncer, em 2014, projetadas também para 2015, espera-se 576.580 novos casos da doença (“Ministério da Saúde. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. Incidência de Câncer no Brasil - Estimativa 2014,” 2014).
Dá-se o nome de câncer ao conjunto de mais de cem doenças que apresentam como característica em comum o crescimento desordenado de células, com a possibilidade de invadirem novos tecidos e órgãos, podendo originar tumores secundários, denominados de metástases, em outras partes do corpo (“Ministério da Saúde. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva.,” 2015). Outra característica que é observada em muitos pacientes com câncer é a desnutrição e perda de peso involuntária, condições impostas pelo estresse catabólico que esses pacientes vivenciam.
1.1 Câncer e caquexia
A caquexia é definida como uma síndrome metabólica complexa associada à outras doenças subjacentes e caracterizada por perda de massa muscular, com ou sem perda de massa adiposa (EVANS et al., 2008). De acordo com essa definição, pacientes que apresentam pelo menos 5% de perda do peso corpóreo, em um ano ou menos, e três dentre os seguintes sintomas (i) astenia, (ii) fadiga, (iii) anorexia, (iv) baixo índice de massa magra, (v) alterações bioquímicas (como aumento na concentração de proteína C reativa, IL-6, anemia (hemoglobina menor que 12 g/dL) ou (vi) diminuição na concentração de
albumina sérica (menor que 3,2 g/dL)), estão em processo de caquexia (EVANS et al., 2008). Muitas doenças crônicas ou em estágios terminais, como câncer, infecções, síndrome da imunodeficiência adquirida, falência cardíaca congestiva, artrite reumatoide, tuberculose, fibrose cística e doença de Crohn, estão associadas à caquexia (TISDALE, 2002). O quadro de caquexia pode ser identificado em mais de 50% dos pacientes com câncer e essa situação é citada como sendo a causa mais frequente de morbidade e mortalidade (CHOUDRY et al., 2006).
Diferentemente do que ocorre durante o jejum prolongado, no qual os depósitos de gordura são mobilizados enquanto que a massa magra é preservada, durante o quadro de caquexia, há perda de peso devido à mobilização de substratos principalmente da massa magra, incluindo ou não a espoliação do tecido adiposo (TISDALE, 2002). Dentre os muitos fatores que contribuem para a resposta aos tratamentos e à qualidade de vida de pacientes com câncer, destaca-se a manutenção da massa magra do indivíduo. A manutenção de nutrição adequada e preservação da massa magra podem aumentar a sobrevida de pacientes com câncer, aumentando suas chances de resistirem aos tratamentos clínicos convencionais e também melhorar sua qualidade de vida.
1.2 Carcinossarcoma de Walker 256
O carcinossarcoma de Walker 256 é um tumor que foi originalmente descrito por George Walker em 1928 e que surgiu espontaneamente na glândula mamária de ratas prenhes (EARLE, 1935). Esse tumor é extensivamente utilizado como modelo experimental de caquexia em ratos, por promover intensa perda de peso devido ao catabolismo de carboidratos, gorduras e proteínas (FREITAS et al., 2001). Embora o mecanismo pelo qual o tumor de Walker 256 induz caquexia em ratos Wistar não seja totalmente conhecido, é possível aventar a hipótese que isso ocorra por meio de uma proteína análoga ao PIF.
Trabalhos prévios em nosso laboratório têm mostrado que uma proteína de peso molecular igual ao PIF (24 KDa) pode ser isolada do líquido ascítico de animais inoculados com o tumor de Walker 256. Quando esse PIF-like é adicionado à cultura de miotubulos da linhagem C2C12, há aumento na atividade
da enzima quimotripsina-like (que representa a atividade proteossômica), bem como diminuição na taxa de síntese e aumento na taxa de degradação proteica (YANO et al., 2008; GONÇALVES et al., 2013).
1.3 Vias de síntese e degradação de proteínas musculares
A manutenção da massa muscular do organismo é determinada pelo balanço entre os processos de síntese e degradação de proteínas. O processo de síntese proteica depende basicamente de sinalização celular envolvendo hormônios e citocinas sinalizadoras do anabolismo, relacionados à ativação de proteínas chave, como a proteína alvo da rapamicina – mTOR, ativada por insulina. Um dos fatores mais bem estudados e compreendidos no processo de hipertrofia muscular é o 1 (GUMUCIO; MENDIAS, 2013). A ligação de IGF-1 ao seu receptor desencadeia uma cascata de sinalização, que culmina com a fosforilação de mTOR e aumento da síntese proteica no organismo.
Em contrapartida, no processo de degradação proteica que ocorre durante a caquexia, por exemplo, as proteínas miofibrilares são primeiramente conjugadas com ubiquitina, a qual funciona como sinal para a degradação na subnunidade proteossômica 26S, que, por sua vez, necessita de ATP para exercer suas funções (TISDALE, 1997).
Das ubiquitina-ligases, a MuRF-1 e a atrogina são particularmente importantes no processo de degradação proteica em músculo esquelético. Essas proteínas são responsáveis pela poliubiquitinação de proteínas musculares e, dessa forma, endereçá-las para degradação via proteossomo 26S (GUMUCIO; MENDIAS, 2013). A expressão de MuRF-1 e atrogina são estimuladas por meio da via de sinalização de miostatina e TGF-β (GUMUCIO; MENDIAS, 2013), conforme esquematizado na Figura 1.
Fatores secretados pelo tumor também são responsáveis pelo aumento na degradação de proteínas musculares, bem como por atuar no processo de redução da síntese proteica em pacientes com câncer (TISDALE, 2009). Dentre esses fatores, o fator indutor de proteólise (PIF), primeiramente isolado em camundongos da linhagem NMRI, é capaz de induzir proteólise muscular quando injetado em camundongos não portadores de tumor (TODOROV et al., 1996).
1.4 Fator indutor de proteólise (PIF)
O fator indutor de proteólise (PIF) pode ser detectado na urina de pacientes com câncer associado à perda de peso e mostrou-se homólogo às proteínas isoladas de fatores caquéticos de tumores em camundongos da linhagem NMRI (TODOROV et al., 1996).
O PIF é uma glicoproteína altamente sulfatada que consiste de uma cadeia central curta (2 KDa a 4 KDa) a qual está ligada à cadeia de oligossacarídeo sulfatado O-ligado de 6 KDa e à cadeia de oligossacarídeo N-ligado de 10 KDa (TODOROV et al., 1996). A cadeia polipeptídica da qual o PIF
Figura 1. Vias de sinalização responsáveis pelos processos de síntese e degradação proteica no
músculo esquelético. A ligação de IGF-1 a seu receptor na membrana celular estimula o processo de síntese proteica via ativação de mTOR, promovendo aumento da massa muscular e da força de contração. Por outro lado, a ligação de miostatina e TGF-β aos seus receptores promove o aumento da degradação proteica por meio do aumento da expressão das ubiquitina-ligases atrogina e MuRF-1, promovendo diminuição da massa muscular e da força de contração. Adaptado de (GUMUCIO; MENDIAS, 2013).
se origina é codificada pelo gene DCD, que também dá origem à outras proteínas, como a dermicidina e ao Y-P30 (STEWART et al., 2008).
PIF promove a degradação de proteínas não apenas por estimular a síntese de RNAs mensageiros das E3-ligases e subunidades proteossômicas, mas também por inibir a síntese de proteínas por meio da ativação da proteína quinase dependente de RNA (PKR) (ELEY et al., 2010).
1.5 Sistema ubiquitina-proteossomo
A ubiquitina é um polipeptídeo com 76 resíduos de aminoácidos, que desempenha funções essenciais em eucariotos por meio de sua conjugação covalente com outras proteínas intracelulares. A ubiquitinação regula muitas funções que são críticas para o funcionamento celular, frequentemente mediando a degradação seletiva de proteínas regulatórias por proteossomos, sendo a principal via de degradação proteica em eucariotos (ROCK et al., 1994). A ubiquitinação de proteínas requer ações sequenciais de três enzimas: enzima ativadora de ubiquitina (E1), enzima conjugadora de ubiquitina (E2) e ubiquitina-ligase (E3) (Figura 2). Um tioéster é formado entre a extremidade C-terminal de uma glicina da ubiquitina e o sítio-ativo de cisteína. A ubiquitina é então transferida para o sítio-ativo de cisteína da E2 formando novamente um tioéster (PICKART, 2001).
O esquema da Figura 2 ilustra o sistema ubiquitina-proteossomo, desde a ligação da molécula de ubiquitina à enzima E1, sua conjugação com a enzima E2, a ligação da ubiquitina com a proteína a ser ubiquitinada (realizada pela enzima E3) e os efeitos biológicos dessa ativação (modificado de VUCIC et al., 2011).
O proteossomo 26S é um complexo de 2.000 KDa com atividade de proteolítica que degrada proteínas poliubiquitinadas por processo dependente de ATP (VOGES et al., 1999). Esse complexo apresenta um núcleo catalítico, composto por uma unidade proteolítica chamada de proteossomo 20S, que é uma partícula em forma de barril composta de quatros anéis sobrepostos com dois anéis α externos e dois β internos compostos pelas proteases – quimotripsina-like, tripsina-like e caspase-like – especificas para esse processo (FAROUT et al., 2003)(DAHLMANN, 2005).
1.6 A via IRS-1/PI3K/Akt/mTOR e a regulação dos processos
de síntese e degradação proteica
A sinalização por meio de vias estimuladas por insulina ou IGF-1 é essencial para a homeostase nutricional, bem como para o crescimento e desenvolvimento (ZHANG et al., 2011). Em mamíferos, o sistema de sinalização por IGF é composto, principalmente, por três hormônios: insulina, 1 e IGF-2. Esses hormônios ligam-se a uma série de isoformas de receptores que incluem duas isoformas de receptores de insulina (IRα e IRβ), o receptor para IGF1, dois receptores híbridos (que podem ser compostos por um monômero de IGF1R e um monômero tanto de Irα quanto de Irβ) e o receptor para IGF2 (ZHANG et al., 2011). Em tecidos sensíveis à insulina, como músculo, tecido adiposo e fígado, o IRβ é a forma mais abundante e a insulina liga-se a esse receptor com alta afinidade (ZHANG et al., 2011). Com a ligação da insulina ou outro ligante, esses receptores são ativados pela mudança conformacional e autofosforilação dos resíduos de tirosina presentes na tirosina quinase desses
Figura 2. A ubiquitinação e degradação de substratos proteicos são obtidas por reações em série mediadas pelas enzimas do Sistema Ubiquitina Proteossomo (UPS). Na reação de ativação, a ubiquitina é transferida para a enzima E1 de maneira ATP-dependente (passo 1). A ubiquitina ativada é subsequentemente transferida para a enzima E2 na reação de conjugação (passo 2). A enzima E2, por sua vez, transporta a ubiquitina para a enzima E3, que também é conhecida como ubiquitina ligase (passo 3). E3 é importante não apenas por ligar covalentemente a ubiquitina aos resíduos de lisina no substrato proteico, mas também por ser substrato-específica. Este processo de ligação pode ser repetido com a lisina da própria ubiquitina como substrato, o que leva a formação de cadeias de poliubiquitina na proteína-alvo. Enzimas deubiquitinantes podem reverter o processo de ubiquitinação do substrato (passo 4). A ligação da poliubiquitina tem várias consequências biológicas para a proteína a ela conjugada: Por exemplo, cadeias de poliubiquitina ligadas a resíduos de lisina nas posições 11 e 48 endereçam essas proteínas para degradação proteossômica (passo 5). De maneira oposta, cadeias lineares de poliubiquitina ligadas a resíduos de lisina nas posições 63 e 11 promovem a montagem de complexos de sinalização (passo 6). X, Y e Z indicam proteínas ligadas à ubiquitina. PPi, pirofosfato. Ub, ubiquitina. (Modificado de VUCIC et al., 2011).
receptores. Isso faz com que IRS-1 agora fosforilado e ativado recrute outras proteínas downstream, como RAS-MAPK e também PI3K. Então, a via de sinalização continua com a fosforilação de PI3K, que por sua vez, promove a fosforilação de Akt. A regulação da fosforilação e, consequentemente, atividade da Akt, é fundamental para a sobrevivência e crescimento celular, tanto em células saudáveis, quanto em células neoplásicas.
A mTOR é uma proteína quinase que pertence à família da PIKK (HAY; SONENBERG, 2004; WULLSCHLEGER et al., 2006), sendo formada por dois complexos multiproteicos: mTORC1 e mTORC2. A atividade da mTOR é aumentada em muitos tipos de cânceres como resultado de alterações genéticas ou ativação anormal dos componentes da via PI3K/Akt (FENG et al., 2005), contribuindo, dessa forma, para a desregulação da proliferação celular, crescimento e sobrevivência dessas células (HADAD et al., 2008).
Fatores de crescimento e nutrientes estimulam a ativação de mTORC1 por meio do aumento da fosforilação de S6 quinase ribossomal (S6K-1) e da 4E-BP1 (HARRIS; LAWRENCE, 2003). A S6K-1 é a principal quinase ribossomal nas células de mamíferos e, quando fosforilada, aumenta seletivamente a tradução de RNAm que codificam proteínas ribossomais e outros fatores de tradução (MEYUHAS, 2000), aumentando, desta maneira, a capacidade de tradução das células de uma maneira geral (INOKI et al., 2005).
A etapa considerada como limitante da iniciação da tradução é a formação do complexo de iniciação eucariótico 4F (eIF4F), que modula o recrutamento da subunidade ribossomal 40S para o RNAm. O complexo eIF4F ativo é constituído pela junção da helicase eIF4A e pela proteína estrutural eIF4G com a proteína eIF4E (GINGRAS et al., 1999). Assim, o complexo eIF4F é inibido pela família de proteínas conhecidas como eIF4E-binding proteins (4E-BPs), que suprimem a tradução por competirem com a eIF4G pela ligação à eIF4E (GINGRAS et al., 1999). A ligação das 4E-BPs ao eIF4E é regulada por fosforilação realizada pela mTOR (WULLSCHLEGER et al., 2006).
Em pacientes com câncer, o mecanismo pelo qual ocorre a diminuição da síntese proteica no músculo esquelético não é bem compreendido, enquanto que o aumento na degradação proteica é atribuído ao aumento da expressão das enzimas envolvidas na via ubiquitina-proteossomo (KHAL et al., 2005).
1.7 Metformina
A metformina (1,1-dimetilbiguanida; PubChem CID #4091) (Figura 3) é um fármaco anti-hiperglicemiante de uso oral, amplamente utilizado no tratamento de pacientes com diabetes Mellitus do tipo 2 (DMT2), sendo prescrita para mais de 120 milhões de pessoas em todo o mundo (VIOLLET et al., 2012). Seu uso, associado a mudança no estilo de vida como dieta balanceada, controle do peso e exercícios físicos, tem sido a primeira opção no tratamento de DMT2 (NATHAN et al., 2009).
A captação de metformina pelos tecidos ocorre por meio de transportadores, devido a sua baixa lipossolubilidade e, portanto, incapacidade de atravessar a membrana plasmática livremente (CHEN et al., 2015). A metformina é carreada por transportadores de cátions orgânicos (OCT) e diferentes tecidos expressam diferentes subtipos de OCT, sendo que no fígado há maior expressão de OCT1, enquanto que no rim há maior expressão de OCT2 (CHEN et al., 2015) em músculo esquelético há maior expressão de OCT3 (BLEASBY et al., 2006)(BLEASBY et al., 2006)(BLEASBY et al., 2006).
Embora os mecanismos celulares pelos quais a metformina exerça seus efeitos não estejam totalmente esclarecidos, sabe-se que esse fármaco é capaz de diminuir a produção hepática de glicose, principalmente por diminuir a gliconeogênese (SHAW et al., 2005), bem como aumentar a captação de glicose em células musculares (ZHOU et al., 2001). A maioria dos estudos mostram que a metformina exerce seus efeitos por meio da ativação da AMPK, porém não de maneira direta. O mecanismo de atuação, bastante reportado na literatura, é por meio da inibição do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial (EL-MIR et al., 2000; OWEN et al., 2000; BRUNMAIR et al., 2004). De acordo com essa
hipótese, a metformina causa inibição do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial e, consequentemente, interrupção do fluxo de elétrons para os outros complexos da cadeia respiratória e a interrupção na produção de ATP. Isso causa o aumento na razão AMP:ATP, que é um potente estímulo para a ativação da proteína quinase dependente de AMP (AMPK).
A AMPK é uma proteína quinase multimérica que fosforila resíduos de aminoácidos serina e treonina, sendo composta por subunidade catalítica, , e outras duas subunidades regulatórias, e , com múltiplas variantes em função de processamento alternativo (HARDIE et al., 2003; KAHN et al., 2005).
Nas células de eucariotos, a enzima adenilato quinase é bastante ativa, e catalisa a reação 2 ADP ↔ AMP + ATP, mantendo a reação próxima ao equilíbrio (HARDIE; HAWLEY, 2001). Dessa forma, a variação na razão AMP:ATP equivale ao quadrado da variação na razão ADP:ATP (HARDIE; HAWLEY, 2001). Essa característica permite que a AMPK monitore a concentração intracelular de AMP e, dessa maneira, atue como sensor do status energético intracelular. O aumento na concentração de AMP no meio intracelular indica que a célula está em processo de estresse energético, devendo, portanto, interromper reações que consumam energia (biossíntese de macromoléculas, por exemplo), iniciando processos e reações que produzam energia (como oxidação de glicose e ácidos graxos).
Estudos demonstraram que a metformina ativa AMPK tanto in vivo quanto in vitro (ZHOU et al., 2001; MUSI et al., 2002) e muitos experimentos têm descrito o seu potencial terapêutico na inibição da mTOR, seja induzindo efeitos anti-proliferativos (ROCHA et al., 2011) ou anti-angiogênicos, em modelos pré-clínicos (MANNING et al., 2002; WULLSCHLEGER et al., 2006).
A AMPK também é capaz de regular o fator de transcrição FoxO3 em mamíferos. Os fatores de transcrição FoxO3 são responsáveis por regular a transcrição de genes relacionados ao processo de degradação, como as E3 ligases MuRF-1 e atrogina (GUMUCIO; MENDIAS, 2013), e enzimas antioxidantes, como superóxido dismutase e catalase (ZHANG et al., 2011).
Dessa forma, quando a disponibilidade de energia no meio intracelular é baixa, há fosforilação e consequente ativação de AMPK, promovendo fosforilação de FoxO. A fosforilação de FoxO em seu resíduo de serina, na posição 253, parece ser suficiente para que essa proteína seja translocada do
núcleo para o citoplasma, deixando, portanto, de atuar como fator de transcrição (LUO et al., 2013).
2 OBJETIVOS GERAIS
O presente trabalho teve como objetivo analisar o efeito do tratamento com metformina sobre a proliferação de células do tumor de Walker 256, tanto in vivo quanto in vitro, focando as vias de sinalização no tecido tumoral e no músculo gastrocnêmio.
2.1 Objetivos específicos:
Analisar o efeito da metformina na proliferação de células neoplásicas in vivo e in vitro;
Analisar, em células neoplásicas in vitro, os possíveis efeitos da metformina na viabilidade celular, na modulação do processo de apoptose, bem como na síntese proteica dessas células ex vivo; Analisar quais os possíveis efeitos modulatórios da metformina no
processo de degradação proteica, avaliando no músculo gastrocnêmio, a atividade de enzimas responsáveis pela degradação proteica, expressão de fatores de transcrição responsáveis pelo aumento da expressão de proteínas do sistema ubiquitina-proteossomo, além da expressão das proteínas desse sistema de proteólise da via ubiquitina-proteossomo no tecido muscular;
Avaliar o efeito da metformina sobre o processo de síntese proteica, analisando no tecido muscular a expressão de proteínas da via AMPK/mTOR;
Analisar os efeitos da metformina sobre a atividade e expressão de enzimas antioxidantes dos tecidos tumoral e muscular.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados ratos Wistar machos, pesando 140 ± 26 g (30 ± 2 dias de idade), obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB)-UNICAMP. O protocolo experimental para manipulação dos animais foi
aprovado segundo princípios éticos na Experimentação Animal (CEUA-IB-UNICAMP) segundo protocolo nº 2784-1 (Anexo 8.2).
Os animais foram mantidos em biotério próprio do Laboratório de Nutrição e Câncer para aclimatação às manipulações e receberam dieta (Nuvilab, Brasil) e água ad libitum, com ciclo claro-escuro de 12-12 h e temperatura de 22 ± 2ºC. As células tumorais foram obtidas do carcinossarcoma de Walker 256 (W), proveniente da linhagem do Banco de Tumores Christ Hospital Line, Arthur D'Little, EUA. Estas células foram mantidas in vivo, por inoculações na cavidade abdominal de ratos machos, feitas a cada sete dias. Após este período, foram retiradas as células neoplásicas da cavidade por punção e este líquido foi diluído na proporção 1:5 em NaCl 0,9%. No primeiro dia do experimento, inoculou-se 1 x 106 células viáveis (determinado pelo método de exclusão com azul de tripan) contidas em 0,2 mL de solução NaCl 0,9%, no subcutâneo do flanco direito dos animais, segundo método descrito previamente (GOMES-MARCONDES et al., 1998). Os animais dos grupos controle receberam inoculação de 0,2 mL de NaCl 0,9% no flanco direito, subcutaneamente.
Os animais foram distribuídos de acordo com a presença ou não do carcinossarcoma de Walker 256 e tratamento ou não com metformina, a saber:
Ratos Controle (C);
Ratos com implante de carcinossarcoma de Walker 256 (W); Ratos tratados com metformina (M);
Ratos com implante de carcinossarcoma de Walker 256 e tratamento com metformina (WM).
Os animais permaneceram em gaiolas coletivas durante todo o período experimental e foram pesados e o comprimento medido três vezes por semana para análise da evolução do crescimento. Nos animais com implante de Walker 256, também foi avaliado o comprimento, largura e espessura do tumor para determinação de seu volume e peso calculado (OLIVEIRA; GOMES-MARCONDES, 2014). Estipulou-se que o peso relativo de tumor igual ou superior a 10% do peso corpóreo, no grupo W, seria utilizado como parâmetro para determinar a instalação do quadro de caquexia. Dessa forma, quando um animal do grupo W apresentou peso relativo do tumor igual ou superior a 10%, escolheu-se aleatoriamente nos outros grupos quais animais seriam eutanasiados.
Para determinação do peso relativo dos órgãos (%), após a eutanásia, foi considerado como peso final o peso da carcaça, que corresponde ao peso dos animais após a remoção do trato gastrointestinal. Dessa forma, o peso relativo (PR) é descrito pela equação PR = (peso do órgão (g) / peso da carcaça (g))*100. Nos animais portadores de tumor, subtraiu-se do peso da carcaça o peso do tumor, e o PR = (peso do órgão (g) / peso da carcaça (g) – peso do tumor (g))*100).
Os animais foram submetidos a jejum de 12 h antes da eutanásia e tiveram livre acesso à água do bebedouro. A eutanásia foi realizada por deslocamento cervical após aprofundamento da anestesia com hidrato de cloral.
3.1 Dietas e tratamento com metformina
Os animais receberam dieta comercial semipurificada isocalórica e normoprotéica (Nuvilab, Brasil), com 18% de proteína (REEVES et al., 1993).
A metformina (M) (#D150959, Sigma-Aldrich, EUA) foi diluída em água filtrada e administrada diariamente durante todo o período experimental (aproximadamente 15 dias), por meio de gavagem intragástrica, na concentração de 500 mg/Kg de peso do animal. Essa concentração de metformina foi escolhida devido aos resultados obtidos em estudo-piloto. Administrou-se água filtrada, também por gavagem intragástrica, aos animais que pertenciam aos grupos não tratados com metformina.
3.2 Isolamento e cultura de células do carcinossarcoma de
Walker 256 (W256)
Utilizou-se o líquido ascítico de animais portadores do tumor de Walker 256, previamente inoculados com 1 x 106 células/mL na cavidade abdominal. Após o animal ser eutanasiado, procedeu-se com a tricotomia da porção superior do abdômen e higienização com álcool 70%. Cerca de 2 mL de líquido ascítico foi removido assepticamente por punção abdominal e transferido para um tubo de centrifugação. Posteriormente, adicionou-se 8 mL de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1.8 mM, pH 7,4) contendo 25 IU/mL de heparina. A suspenção celular foi, então, centrifugada a 300 x g, por 5 min, em TA. Removeu-se o sobrenadante e também a camada superior, que continha
grande número de células brancas sanguíneas. Ao pellet, que continha as células tumorais e hemácias, adicionou-se o mesmo volume de PBS contendo 25 IU/mL de heparina. Plaqueou-se 0,5 mL dessa suspenção celular em garrafas
de 25 cm2 e adicionou-se 2,0 mL de meio 199 (LGC, Brasil) contendo 10% de
soro fetal bovino (LGC, Brasil), 1% de penicilina (10 000 IU/mL) e estreptomicina (10 000 mg/mL) (LGC, Brasil), anfotericina B (2,5 mg/L) (Sigma-Aldrich, EUA) e glutamina (2 mM) (LGC, Brasil). As garrafas foram mantidas em incubadoras com atmosfera úmida e 5% de CO2 e 95% de O2. Permitiu-se que as células aderissem à superfície da garrafa de cultura por 2 h e, então, metade do meio de cultura foi removido para diminuir a proporção de hemácias. Esse procedimento foi realizado até que não fossem mais identificadas hemácias na cultura, sendo então o volume de meio foi completado para 5 mL. Após verificar a não contaminação da cultura, a anfotericina B foi removida do meio de cultura. Células do carcinossarcoma de Walker 256 da linhagem LLC-WRC 256, foram gentilmente doadas pela Profa. Dra. Sandra Coccuzzo Sampaio Vessoni, do Instituto Butantã-SP. Essas células foram mantidas em meio RPM 1640 (LGC, Brasil) contendo 10% de soro fetal bovino (LGC, Brasil), 1% de penicilina (10 000 IU/mL) e estreptomicina (10 000 mg/mL) (LGC, Brasil) e glutamina (2 mM) (LGC, Brasil).
3.3 Dosagens sorológicas
O sangue dos animais foi coletado por punção cardíaca após a eutanásia e deixado coagular, em TA, por 30 min. Posteriormente, centrifugou-se a 1000 x g, por 10 min, a 4°C e os soros foram guardados a -80°C até o momento das análises. A análise da concentração de glicose foi realizada utilizando-se 5 μL de amostras de soro e distribuídas em placas de 96 poços e acrescentando-se 200 μL de reativo glicose oxidase-glicose peroxidase (Laborlab, Brasil). Em seguida, incubou-se a placa por 10 min, a 37°C, e realizou-se a leitura em espectrofotômetro com filtro de 540 nm (TRINDE, 1969).
A análise da concentração de proteínas séricas totais foi realizada utilizando-se 5 μL de amostras de soro distribuídas em placas de 96 poços e acrescentando-se 200 μL de reagente biureto (Laborlab, Brasil). Em seguida,
incubou-se por 15 min, a 37°C, e realizou-se a leitura em espectrofotômetro com filtro de 540 nm (DOUMAS et al., 1971).
A concentração de albumina foi determinada utilizando-se 5 μL de amostra de soro e acrescentando-se 200 μL de reagente verde bromocresol (Laborlab, Brasil), distribuídas em placa de 96 poços e incubadas por 10 min, TA. Após esse período realizou-se a leitura em espectrofotômetro com filtro de 620 nm (DOUMAS et al., 1971).
A concentração sérica de globulina foi determinada subtraindo-se o valor da concentração de albumina do valor da concentração de proteínas totais.
A análise da concentração de lactato foi realizada utilizando-se 2 μL de amostras de soro distribuídas em placas de 96 poços e acrescentando-se 200 μL de monoreagente (Bioclin, Brasil). Em seguida, incubou-se por 5 min, a 37°C, e, então, foram lidas em espectrofotômetro com filtro a 340 nm (WESTGARD et al., 1972).
3.4 Curva de crescimento de células W256 e LLC-WRC 256
As células foram tripsinizadas e o número de células viáveis e não-viáveis foi obtido por meio de contagem utilizando-se hemocitômetro e método de exclusão com azul de tripan. As células foram diluídas em meio de cultura e plaqueadas em duas concentrações diferentes, com 1 x 104 e 3 x 104 células viáveis por poço, em placas de 12 cavidades, para avaliar a velocidade de duplicação até atingirem o platô. As placas foram mantidas em incubadoras, a 37°C, com atmosfera úmida e 5% de CO2 e 95% de O2. Após 24 h, a primeira placa foi retirada da incubadora e realizou-se a tripsinização dos poços e contagem em hemocitômetro. Esse procedimento foi realizado diariamente até que o número de células fosse constante (fase estacionária ou plateau). O meio de cultura foi trocado regularmente a cada três dias.
Para gerar as curvas de crescimento foi utilizado o programa Graphpad Prism 5.01 e a equação de crescimento exponencial Y=Y0 * exp(k * X), na qual Y é o número de células, Y0 é o número células quando o X =0, K é a taxa de crescimento (em dias-1) e X é o tempo (em dias) (Graphpad, EUA).
3.5 Teste de Citotoxicidade
Para avaliar a citotoxicidade dos tratamentos com metformina, utilizou-se o ensaio com MTT (MOSMANN, 1983). Cultivou-se 2 x 104 células W 256, contidas em 100 µL de meio de cultura, em placas de 96 cavidades. Tratou-se, então, com diferentes concentrações de metformina (10 µM, 100 µM, 1 mM, 10 mM e 100 mM). Após 24, 48 ou 72 h de cultura, adicionou-se a cada poço 10 L de MTT (5 mg/mL). Após incubação por 4 h, a 37ºC, retirou-se o meio contendo o MTT e adicionou-se 100 L de DMSO e foi feita leitura da absorbância em espectrofotômetro em 570 nm. Os valores da absorbância dos grupos tratados com metformina foram normalizados em relação ao grupo controle (sem tratamento). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM).
3.6 Ensaio de formação de colônias
Células W256 foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas com metformina 10 mM por 24, 48 e 72 h. A viabilidade dessas células foi determinada como descrito no item 3.5, porém com alteração do número de células plaqueadas - 2,5 x 102 células por poço, em placas de 6 cavidades. O meio foi trocado a cada 3 dias e as placas deixadas por 9 dias, tempo necessário para que as colônias atingissem entre 50 e 100 células cada.
No 9º dia, então, removeu-se o meio de cultura e lavou-se as células com 5 mL de PBS. Após a remoção do PBS, adicionou-se 5 mL de PBS:metanol (1:1, V:V), em TA, por 5 min. Na sequência, descartou-se o PBS:metanol e adicionou-se 5 mL de metanol, incubando-adicionou-se por 10 min, em TA. Posteriormente, removeu-se o metanol e acrescentou-removeu-se 5 mL de solução de cristal violeta 0,1% em água, seguida de incubação por 10 min, em TA. A solução corante foi retirada, a placa lavada em água corrente e posteriormente seca ao ar.
O número de colônias formado foi determinado utilizando-se esteriomicroscópio e o número de células limite para que fosse considerado uma colônia foi de 50 células (FRANKEN et al., 2006).
3.7 Immunoblot (Western Blot)
Amostras do músculo gastrocnêmio e tecido tumoral foram homogeneizadas em tampão para extração de proteínas (Tris 100 mM, Na4P2O7
10 mM, FNa 10 mM, Na3VO4 1 mM, EDTA 10 mM, PMSF 2 mM, aprotinina 0.1
mg/mL, Triton-X100 0.1%, pH 7,4) utilizando-se homogeneizador tipo polytron, por 15 s, a 4°C. Células W256 foram lisadas no mesmo tampão e sonicadas por 15 s, em intensidade baixa e mantidas no gelo durante 15 mim. Os lisados celulares ou teciduais foram centrifugados a 16 000 x g, por 20 min, a 4°C. Quantificou-se a concentração de proteínas do sobrenadante (BRADFORD, 1976) e parte do sobrenadante foi adicionado ao mesmo volume de loading buffer (2x) (LAEMMLI, 1970). As proteínas (40 µg) foram separadas utilizando-se eletroforeutilizando-se em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com gel de empilhamento (stacking gel) com 4% de acrilamida e de separação (resolving gel) com concentração de 10 a 15% de poliacrilamida (dependendo do tamanho das proteínas estudadas aqui nesse trabalho, sendo o gel com menor porcentagem de poliacrilamida (10%) utilizado para proteínas de alto peso molecular (mTOR, por exemplo) e vice-versa). Após a eletroforese, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e posteriormente incubadas com solução de bloqueio, contendo leite desnatado a 5% em TBS-T 0,1%, por 2 h, em TA. Utilizou-se anticorpos primários específicos para α-tubulina (1:20 000), MnSOD (1:400) (Sigma-Aldrich, EUA); AMPK, p-AMPK, Akt, p-Akt, TSC-2, p-TSC-2, mTOR, p-mTOR, PCNA, Caspase 3 clivada, p53, p-p53, ciclina D1, p-S6 (1:1000), Catalase (1:1500) (Cell Signaling Technology, EUA); 20S, 19S e 11S (1:1000, Biomol, Alemanha), Bcl-2, Bax, MuRF-1, Atrogin, E2, FOXO3a, p-FOXO3a (1:500, Santa Cruz Biotechnology, EUA). Incubou-se as membranas com anticorpo primário por 12 h, a 4°C e, posteriormente, as membranas foram lavadas com TBS-T 0,1% e incubadas com anticorpos secundários (anti-rabitt, anti-mouse, 1:10 000, Cell Signalling Technology, EUA), anti-goat, (1:10 000, MerkMillipore, EUA) por 1 h, em TA. Posteriormente lavou-se as membranas com TBS-T 0,1% e a reação de quimioluminescência foi realizada utilizando-se reagente Luminata Forte (MerkMillipore, EUA). A análise densitométrica foi feita utilizando-se fotodocumentador para capturar as imagens e a quantificação foi feita utilizando-se programa UVItec (UVItec Cambridge, Reino Unido).
3.8 Imunohistoquímica
Amostras de tecido tumoral foram fixadas em paraformoldeído 4% em PBS, pH 7,4, por 12 h. Posteriormente, as amostras foram lavadas em água corrente por 12 h e desidratadas em bateria de álcool, diafanisadas em xilol e embebidas em Paraplast (Sigma-Aldrich, EUA). Os cortes histológicos foram desparafinizados em xilol, reidratados em bateria de álcool e foi realizada a recuperação antigênica em tampão citrato (citrato de sódio 10 mM, Tween-20 0,05%, pH 6,0) a 125°C, por 30 min e, posteriormente, lavados em água destilada. A atividade da peroxidade endógena foi bloqueada pela incubação dos cortes em peróxido de hidrogênio 3%, por 20 min, seguido de lavagem em água destilada e tampão Tris-Tween 0.1% (Tris 10 mM, 0,1% Tween-20 0,1%). O anticorpo primário específico para Ki-67 (marcador de proliferação celular) (1:100, Spring Bioscience, EUA) foi adicionado seguindo a recomendação do fabricante e foi incubado por 40 min, em TA, em câmara úmida. Os cortes foram lavados em tampão Tris-Tween 0,1% e foi adicionado polímero N-Histofine Simple Stain Rat MAX PO® (Nichirei, Japão) e incubado por 30 min, em TA, em câmara úmida, seguido de lavagem com tampão Tris-Tween 0,1%. Posteriormente, foi adicionado DAB (Sigma-Aldrich, EUA) e incubado por 10 min, em TA, seguido de lavagem em água corrente. A contra-coloração foi com hematoxilina de Harris, por 3 min, e os cortes foram desidratados em bateria de álcool e xilol. As lâminas foram montadas em meio de montagem permanente Entellan® (MerckMillipore, EUA) e analisadas utilizando-se programa Image-Pro Plus (Media Cybernetics, EUA). Contou-se cinco campos em cada lâmina, escolhidos aleatoriamente, e os resultados foram expressos como número de células positivamente marcadas por mm2.
3.9 Coloração com Giemsa
Células W256 foram plaqueadas, com 5 x 105 células por poço, em placas de 6 cavidades. Após atingir entre 85-90% de confluência, as células foram tratadas ou não com 10 mM de metformina por 24, 48 ou 72 h. Após o tempo de tratamento, o meio foi removido e os poços lavados com PBS. As células foram, então, fixadas em solução de PBS/metanol (1/1, V/V), por 2 min, em TA. Posteriormente, adicionou-se metanol PA., deixando a reação ocorrer por 10
min, em TA, sendo descartado e adicionando-se novo volume de metanol PA para lavagem das células. O metanol foi, então, descartado e adicionou-se Giemsa por 2 min. O corante foi removido adicionando-se água corrente e agitação durante 2 min.
3.10 Imunocitoquímica/Imunofluorescência
Células W256 isoladas em nosso laboratório (conforme descrito anteriormente, item 3.3.) foram cultivadas em placas de 12 cavidades, em lamínula, com concentração de 1 x 104 células/mL, em 1 mL, pelo período de 24, 48 e 72 h e tratadas ou não com metformina 10 mM. Após os períodos, as células foram lavadas 2 vezes com PBS, em TA, e fixadas em paraformaldeído 4% em PBS, pH 7,4, por 10 min, também em TA. Posteriormente, após três lavagens com PBS, por 3 min, em TA e incubou-se as células com solução de permeabilização (Triton X-100® 0,1% em PBS, pH 7,4), por 5 min, em TA. Removeu-se a solução de permeabilização, substituindo por solução de bloqueio contendo albumina bovina 0,1% em PBS, pH 7,4, por 20 min, em TA. Posteriormente, após remoção da solução de bloqueio, adicionou-se anti-actina (1:250, Abcam, EUA) e incubou-se por 12 h, a 4 °C, em câmara úmida. Após esse período, as lamínulas foram lavadas por três vezes com PBS, por 3 min, em TA, seguida de incubação das células aderidas às lamínulas com anticorpo secundário anti-rabbit conjugado com Alexa Fluor 647 (1:250, Abcam, EUA) por 1 h, em TA, no escuro. Novamente, após três lavagens com PBS, por 3 min, em TA, e adicionou-se Hoechst 33258 0,2 µg/mL, por 10 min, em TA, também no escuro. Lavou-se rapidamente as lamínulas com PBS, por cinco vezes, em TA, e as lamínulas foram montadas em lâminas com meio de montagem aquoso (glicerol 50% em PBS, pH 7,4, n-propil galato 25 mM). As células foram visualizadas em microscópio de fluorescência (Floid Cell Image Station, Life Technologies, EUA).
3.11 Análise hormonal
A análise da concentração dos hormônios insulina, glucagon e IGF-1 foi realizada utilizando-se beads conjugadas com anticorpos de captura específicos para cada proteína de interesse.
Amostras de soro contendo, aproximadamente, 20 µg de proteínas foram aplicadas aos poços de placas 96 cavidades, aos quais foram aplicados, previamente, beads conjugadas com anticorpos específicos contra os hormônios acima especificados. A placa foi incubada overnight sob agitação, a 4°C, e após esse período o material não acoplado às beads foi removido mediante sucessivas lavagens com tampão fornecido pelo fabricante (MerckMillipore, EUA) e remoção do tampão por vácuo. Na sequência, adicionou-se biotina, incubando sob agitação por 30 min, em TA. Novamente, aplicou-se vácuo para posterior adição de estreptavidina conjugada com ficoeritrina, seguindo de incubação sob agitação por 30 min, em TA. Após esse período, ao meio contendo amostra e estreptavidina conjugada com ficoeritrina foi adicionado tampão de amplificação fornecido pelo fabricante e nova incubação, sob agitação, por 15 min, em TA. Em seguida, as placas foram colocadas no equipamento Luminex® para detecção de fluorescência emitida pelas amostras. A análise foi feita segundo programa XPonent, utilizado com o equipamento Luminex®.
3.12 Ensaio de síntese proteica
Amostras do tecido tumoral com, aproximadamente, 5 mm3 foram
adicionadas a tubos contendo tampão Krebs-Hanseleits (KHB) e incubadas previamente por 30 min, a 37ºC, com agitação contínua e gaseamento com 95% de O2 e 5% de CO2 (FEDELE et al., 2001). Após esse período, adicionou-se novo KHB suplementado com fenilalanina (5 Ci de L-[2,6-3H]fenilalanina/mL) (Amershan, Reino Unido). Ao final de 2 h de incubação, os fragmentos foram retirados do meio, secos, pesados, congelados em nitrogênio líquido e guardados a -80ºC.
Os fragmentos de tecido tumoral foram homogeneizados em TCA 30%, seguido de centrifugação a 10 000 x g por, 15 min, a 4ºC; o pellet obtido foi lavado duas vezes com TCA 10% para eliminar a radioatividade não associada às proteínas, seguido de nova centrifugação. O pellet foi ressuspendido em NaOH 1N e incubado por 30 min, a 40ºC. Alíquotas foram analisadas quanto ao teor de proteína (LOWRY et al., 1951) e a radioatividade foi medida adicionando-se líquido de cintilação e leitura em contador (LS 6000TA, Beckman Coulter,
EUA). A síntese proteica foi expressa em nmol de fenilalanina/mg de proteína presente na amostra.
Células W256 foram cultivadas em placas de 12 poços na concentração de 5,0 x 104 células/poços por 24, 48 e 72 h e foram tratadas ou não com metformina 10 mM. À essas células, adicionou-se 5 µCi de L-[2,3,4,5,6-3H]fenilalanina (Amersham, Reino Unido) diluída em PBS, incubando-as por 6 h para determinação da síntese de proteínas. Após esse período, o meio contendo material radioativo foi removido, seguido de lavagem dessas células por mais duas vezes com PBS para remoção máxima do material radioativo não ligado às proteínas. Para cada poço contendo células, adicionou-se 1 mL de TCA 0,6 M gelado e incubou-se a placa, no gelo, por 10 min. Removeu-se o TCA 0,6 M e novamente adicionou-se 1 mL de TCA 0,6 M, por 5 min. Descartou-se o TCA, lavou-se as células com metanol absoluto e, então, as células foram secas ao ar. Após isso, adicionou-se 300 µL de SLS 1% em NaOH 0,3 M e incubou-se por 30 min, em TA. Posteriormente, homogeneizou-se o conteúdo do poço, transferindo-o para tubos aos quais adicionou-se 3 mL de líquido de cintilação. A contagem de emissão de partículas beta foi realizada em contador de cintilação líquida (LS6000, Beckham Coulter, EUA) e os valores normalizados pelo número de células e expressos como contagens por minuto (CPM).
3.13 Atividade de caspases 3 e 7
Células W256 foram cultivadas em placas com 6 cavidades, contendo 2 x 105 células viáveis por poço, mantendo-as por 24, 48 ou 72 h, tratadas ou não com metformina 10 mM. Posteriormente, removeu-se o meio de cultura, lavou-se a monocamada com PBS; as células foram coletadas por raspagem e suspensas em PBS e centrifugadas a 600 x g, por 5 min, a 4°C. Removeu-se o sobrenadante e ao pellet celular adicionou-se 1 mL de PBS. As células foram novamente centrifugadas a 600 x g, por 5 min, a 4°C e o sobrenadante foi removido. As células foram lisadas adicionando-se 100 µL de tampão de lise (HEPES 25 mM, pH 7,4, CHAPS 25 mM e DTT 25 mM) e sonicadas por 15 s, em intensidade baixa e mantidas no gelo por 15 min. Posteriormente, centrifugou-se a 20 000 x g, por 10 min, a 4°C. Em placas pretas de 96 cavidades, adicionou-se volumes de sobrenadante correspondente à
concentração de 100 a 200 µg de proteína por poço e adicionou-se volume igual de assay buffer (HEPES 20 mM, pH 7,4, CHAPS 0,1%, DTT 5 mM e EDTA 2 mM). Adicionou-se 10 µL de substrato de caspase 3/7 (#AS-25273-5, Anaspec, EUA) (10 µM em DMSO) e incubou-se a placa por 2 h, a 37°C, no escuro. Após esse período, foi realizada a leitura da fluorescência com filtros de 385/535 nm (excitação/emissão). A atividade das capases 3/7 foi expressa como unidade arbitrária de fluorescência por micrograma de proteína.
Para a análise da atividade de caspases 3/7 no tecido tumoral, o homogeneizado tecidual utilizado para immunoblot (conforme descrito no item 3.8) foi processado segundo todos os passos descritos acima.
3.14 Atividade de enzimas antioxidantes
A atividade da enzima catalase foi determinada por meio da degradação do peróxido de hidrogênio (H2O2) e monitoramento da variação de absorbância. Utilizou-se amostras dos homogeneizados de músculo gastrocnêmio e tecido tumoral e lisados de células W256 (obtidos conforme descrito no item 3.7). Pipetou-se, em placas específicas para leitura em luz ultravioleta, 10 µL de amostra (aproximadamente 10 µg de proteína) e 150 µL de H2O2 10 mM em tampão fosfato (K2HPO4) 50 mM, pH 7,4. A variação na absorbância foi monitorada utilizando-se espectrofotômetro com filtro de 240 nm, durante 5 min, em TA (BEERS; SIZER, 1952). Os valores da absorbância em função do tempo foram plotados e, por meio de regressão linear, determinou-se a área sob a curva (AUC). Os valores de AUC foram normalizados pela concentração de proteína.
A atividade da enzima superóxido dismutase mitocondrial (MnSOD) em amostras do homogeneizados de músculo gastrocnêmio e tecido tumoral e no lisado de células W256 (obtidos conforme descrito no item 3.8) foi determinada a partir da reação de 10 µL de amostra com 150 µL de substrato (xantina oxidase 50 U/mL, hipoxantina 100 µM, NBT 600 µM) e leitura em espectrofotômetro com filtro de 560 nm, por 10 min (WINTERBOURN et al., 1975). Os valores da absorbância em função do tempo foram plotados e, por meio de regressão linear, determinou-se a AUC. Os valores de AUC foram normalizados pela concentração de proteína.
3.15 Vias de degradação proteica
Amostras do músculo gastrocnêmio foram adicionadas à PBS gelado contendo 1% de Triton X-100 e homogeneizadas em politron por 15 s. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 16 000 x g, 15 min, a 4°C e o sobrenadante foi utilizado para determinação da atividade das enzimas catepsina B e catepsina H, calpaína e quimotripsina.
Para a análise da atividade da catepsina B, alíquota do sobrenadante foi diluída em KH2PO4 352 mM, Na2HPO4 48 mM EDTA 4 mM, pH 6,0, suplementado com 8 mM de cisteína. A reação foi iniciada com a adição do substrato de catepsina B 0,02 mM (Z-Phe-Arg-NMec dissolvido em DMSO) e diluído em tampão Brij-35 0,1%. Para a análise da atividade da catepsina H, alterou-se o tampão para KH2PO4 200 mM, Na2HPO4 200 mM, pH 6,8 e o substrato da enzima utilizado (Arg-NMec dissolvido em DMSO). Para ambas enzimas a fluorescência foi monitorada em fluorímetro com filtros de excitação/emissão de 350/460 nm durante 30 min, com intervalos de 1 min (BARRETT, 1980). A atividade de ambas as enzimas foi expressa como unidade arbitrária de fluorescência por miligrama de proteína.
A atividade de calpaína foi realizada diluindo-se alíquota do sobrenadante em tampão imidazol-HCl, pH 7,5, contendo 2-mercaptoetanol 10 mM, NaN3 1,0 mM e 4 mg/mL de caseína. A mistura foi incubada por 5 min, em TA, e então, adicionou-se CaCl2 para iniciar a reação. A alteração na absorbância foi monitorada em espectrofotômetro com filtro de 500 nm com intervalos de 1 min, durante 10 min (JIANG et al., 1997). A atividade da enzima foi normalizada pela concentração de proteína e expressa em unidades arbitrárias por miligrama de proteína.
A atividade de quimotripsina-like foi analisada adicionando-se alíquota do sobrenadante a 0,167 μg/L de substrato da enzima (succinyl-Leu-Leu-Val-Try-7-amino-4-methylcoumarin, diluído em tampão Tris-HCl, pH 7,4). A variação na fluorescência foi monitorada em fluorímetro com filtros de excitação/emissão de 350/460 nm durante 30 min, com intervalos de 1 min (ORINO et al., 1991). A atividade da enzima foi normalizada pela concentração de proteína e expressa em unidades arbitrárias por miligrama de proteína.
3.16 Taxa de síntese de DNA
Células W256 foram cultivadas em placas de 12 poços, na concentração de 5,0 x 104 células/poços, por 24, 48 e 72 h e foram tratadas ou não com
metformina 10 mM. Após a adição de 1 µCi de [metil-3H]Timidina (Amersham,
Reino Unido) diluída em PBS, as células foram incubadas por 6 h para determinação da síntese de ácido desoxirribonucleico (DNA). Após esse período, o meio contendo material radioativo foi removido e lavou-se as células, duas vezes com PBS, para remoção de material radioativo não ligado ao DNA. Posteriormente, adicionou-se 1 mL de TCA 0,6 M gelado, incubando a placa, no gelo, por 10 min. Removeu-se o TCA, acrescentando nova solução de TCA 0,6 M, conforme descrito anteriormente, por 5 min. Depois do descarte do TCA, adicionou-se 300 µL de SLS 1% em NaOH 0,3 M, incubando por 30 min, a 37°C. Posteriormente, homogeneizou-se o conteúdo do poço, transferindo-o para tubo com 3 mL de líquido de cintilação. A contagem de emissão de partículas beta foi realizada em contador de cintilação líquida (LS6000, Beckham Coulter, EUA) e os valores normalizados pela concentração de proteína e expressos em CPM por miligrama de proteína.
3.17 Análise estatística
Utilizou-se o programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, EUA), utilizando-se as médias e erro padrão das médias (SEM), e comparação dos múltiplos grupos por ANOVA two-way seguido do teste de Bonferroni para detecção de diferenças significativas entre os grupos, para probabilidade menor que 5% (GAD; WEIL, 1994). Quando a análise de comparação foi feita entre apenas dois grupos utilizou-se teste t-Student. Para analisar se as amostras apresentavam distribuição gaussiana utilizou-se o teste de D’Agostino e Pearson.
4 RESULTADOS
4.1 Padronização da concentração de metformina
O ganho de peso animais foi avaliado sob o tratamento com diferentes concentrações de metformina para verificar se esse fármaco seria ou não
