Efeitos dos estresses recorrentes e contínuos com a w reduzida em

3. Resultados

3.1 Efeitos dos estresses recorrentes e contínuos com a w reduzida em

A suscetibilidade de S. Senftenberg (IOC 2319) e S. Typhimurium (ATCC 14028) a diferentes estresses de atividade de água ao longo do tempo foi analisada por plaqueamento, calculando o número de reduções decimais (

l

). A média e desvio padrão da contagem inicial de células dessas cepas foram de, respectivamente, 8,39 ± 0,26 e 8,61 ± 0,32 log UFC.mL-1_{. Os dados de}

l

_{dos patógenos avaliados em 24}

horas de tratamento e 5 dias após a exposição aos estresses a 25 ºC são mostrados na Figura 3 e no apêndice (Tabela 1).

Inicialmente, pode-se observar que quanto maior o tempo de exposição ao estresse, maior o valor de

l

, exceto para o tratamento controle (aw = 0,99). Os

estresses com atividade de água abaixo de 0,7 foram os que obtiveram os maiores valores de reduções para ambas as cepas estudadas, sendo o

l

máximo obtido experimentalmente de 6,86 ± 0,885 para S. Senftenberg (aw 0,4) e 8,51 ± 0,543 para

S. Typhimurium (aw 0,5).

Para ambas as cepas pode-se observar que nos tratamentos contínuo e recorrente de atividade de água 0,9 e 0,99, não houve diferença significativa de

l

no tempo (p > 0,05). Similarmente, o tratamento contínuo de aw 0,5 das duas cepas e os

tratamentos recorrentes de aw 0,5 e 0,4 da cepa S. Typhimurium não houveram

diferença significativa no comportamento. Para a cepa S. Senftenberg, nos tratamentos que diferiram, houve um aumento de 1,95 a 3,07 vezes maiores na perda de contagens de células entre os tempos para os tratamentos contínuos e entre 2,07 e 3,31 para os recorrentes. Nos estresses contínuos e recorrentes, em 24 horas, os tratamentos abaixo de 0,8 não tiverem diferença significativa (p > 0,05) para esta cepa. E quando expostos até o quinto dia, esse comportamento se mantém para os estresses com aw abaixo de 0,6 nos tratamentos contínuos e nas aw abaixo de 0,7

tiveram maiores reduções decimais do que os contínuos. E quando se compara paralelamente com a mesma aw e nos mesmos tempos, apenas no ultimo dia de

exposição os tratamentos com aw 0,5 e 0,4 foram diferentes estatisticamente (p <

0,05).

Diferentemente, na cepa S. Typhimurium não houve diferença entre os procedimentos R e C. Os tratamentos contínuos de aw 0,8, 0,7, 0,6 e 0,4 diferiram no

tempo para esta linhagem, e as reduções foram de 4,72, 2,88, 2,84 e 1,67 vezes maior, respectivamente. Já no estresse recorrente essa redução teve um aumento de 1,75, 1,58 e 3,01 para os tratamentos de aw 0,6, 0,7 e 0,8. -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 0.99 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 l Aw

S. Senftenberg

Contínuo D1 Contínuo D5 Recorrente D1 Recorrente D5

Fig. 3. Relação dos valores de l e desvio padrão no dia um (D1) e dia cinco (D5) para os diferentes estresses de atividade de água contínuo e recorrente sob as cepas S. Senftenberg e S. Typhimurium a 25 ºC.

O comportamento das cepas estudadas no tempo em função da variação de atividade de água seguiu um modelo polinomial de segunda ordem conforme os parâmetros apresentados na Tabela 1. Os modelos demonstram que em geral ao receber múltiplos estresses diários da mesma atividade de água no tempo estudado, não somente há uma maior redução na contagem de células, independentemente do tempo avaliado, mas também maiores reduções ocorrem quando a atividade de água esta abaixo de 0,6. Além disso, pode se verificar que a cepa S. Senftenberg possui os menos valores de reduções quando comparado com a cepa S. Typhimurium.

-2.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 0.99 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 l Aw

S. Typhimurium

Contínuo D1 Contínuo D5 Recorrente D1 Recorrente D5

Tabela 1

Estimativa dos coeficientes a, b e c do modelo polinomial de segunda ordem para o efeito dos estresses de baixa atividade de água nas cepas S. Senftenberg e S. Typhimurium no tempo de um dia (D1) e cinco dias (D5) de estresse a 25 ºC. Além do coeficiente de regressão do modelo e a atividade de água que fornece o número de redução decimal máximo (l𝑚á𝑥).

Tratamento l (𝑎𝑤) R2 _a

w red l𝑚á𝑥 S. Senftenberg Continuo D1 -10,063aw2_{+ 9,529aw – 0,0013} _{0,927 0,473 2,255}

Continuo D5 -36,768aw2_{+ 43,302aw – 7,5282} _{0,890 0,589 5,221}

Recorrente D1 -12,077aw2_{+ 10,867aw + 0,5676} _{0,980 0,450 3,012}

Recorrente D5 -33,208aw2_{+ 33,883aw– 1,6465} _{0,975 0,510 6,996} S. Typhimurium Continuo D1 -2,4916aw2_{– 3,7076aw + 5,9812} _{0,934 0,400 4,100}

Continuo D5 -37,305aw2_{+ 43,04aw – 5,9797} _{0,847 0,577 6,434}

Recorrente D1 -10,698aw2_{+ 7,3654aw + 3,5225} _{0,912 0,344 4,790}

Recorrente D5 -43,827aw2_{+ 49,764aw – 6,5774} _{0,910 0,568 7,549}

3.2 Efeitos dos estresses recorrentes e contínuos com aw reduzida em Salmonella na viabilidade celular por citometria de fluxo em comparação com a culturabilidade

Para estudar a viabilidade celular de S. Senftenberg e S. Typhimurium expostas ao tratamento de baixa atividade de água a um dia e cinco dias na temperatura de 25 ºC, foi realizado análises de citometria de fluxo. Os corantes SYTO9™ e PI foram utilizados, respectivamente, para estudar a integridade da membrana celular, característica que indica a viabilidade celular. O corante permeável SYTO9™ atua nas células viáveis e mortas enquanto o PI apenas nas células mortas. Dessa forma, a partir das porcentagens dos corantes obtidas nos tratamentos

(Tabelas 2 e 3 do Apêndice) foram calculados os valores em log UFC.mL-1 _{das células}

viáveis. A Figura 4 e 5 mostram os resultados obtidos desta análise junto aos valores de culturabilidade celular em log UFC.mL-1_{para cada tratamento recorrente e continuo}

das duas cepas estudadas no tempo.

Ao comparar os valores de contagens em ambas as análises no tempo zero para cada tratamento estudado, foram observadas que não houve divergência estatística dos dados (p > 0,05) o que demostra uma maior exatidão no cálculo realizado para obtenção das células viáveis. Pode-se verificar que embora ao longo do tempo a viabilidade das células reduziram para alguns tratamentos, elas permaneceram elevadas, variando entre 7 e 9 log UFC.mL-1_{. Por outro lado, as cepas}

perderam culturabilidade a medida que o tratamento se tornava mais drástico e com o tempo. Para a cepa S. Senftenberg, o estresse com atividade de água contínua de 0,6 e estresse recorrente abaixo de 0,7 foram os que resultaram em uma maior perda de culturabilidade ao longo do tempo avaliado. Além disso, vale ressaltar que nesta cepa para o tratamento contínuo, os estresses com aw 0,5 e 0,4 houve uma menor

perda do número de células cultiváveis comparado ao estresse com aw 0,6 e 0,7. Já

com relação a S. Typhimurium, o estresse de aw 0,6 foi o mais expressivo em ambos

os tratamentos C e R atingindo uma contagem de 0,70 e 1,55 log UFC.mL-1_,

Fig. 4. Efeito dos estresses de atividade de água na viabilidade celular e culturabilidade celular de S. Senftenberg. As barras representam os valores das contagens no plaqueamento e as linhas os valores de células viáveis em log UFC.mL-1_.

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.99 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Vi abi lidade (Log U FC/ m L) Cu ltu rab ili dad e (L og U FC/ m L) Aw

S. Senftenberg x Continuo

Culturabilidade Contínuo D0 Culturabilidade Contínuo D1 Culturabilidade Contínuo D5 Viabilidade Contínuo D0 Viabilidade Contínuo D1 Viabilidade Contínuo D5

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.99 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Vi abi lidade cel ul ar (L og U FC/ m L) Cu ltu ra bi lid ad e (Lo g U FC/m L) Aw

S. Senftenberg x Recorrente

Culturabilidade Recorrente D0 Culturabilidade Recorrente D1 Culturabilidade Recorrente D5 Viabilidade Recorrente D0 Viabilidade Recorrente D1 Viabilidade Recorrente D5

Fig. 5. Efeito dos estresses de atividade de água na viabilidade celular e culturabilidade celular de S. Typhimurium. As barras representam os valores das contagens no plaqueamento e as linhas os valores de células viáveis em log UFC.mL-1_.

S. Typhimurium x Continuo

Culturabilidade Continuo D0 Culturabilidade Contínuo D1 Culturabilidade Contínuo D5 Viabilidade Continuo D0 Viabilidade Continuo D1 Viabilidade Contínuo D5

S. Typhimurium x Recorrente

Culturabilidade Recorrente D0 Culturabilidade Recorrente D1 Culturabilidade Recorrente D5 Viabilidade Recorrente D0 Viabilidade Recorrente D1 Viabilidade Recorrente D5

4. Discussão

Avaliando os modelos de comportamento das bactérias estudadas sob efeito dos tratamentos aplicados, os dados sugerem uma maior resistência aos estresses de atividade de água para a cepa S. Senftenberg IOC 2319 do que a cepa padrão S. Typhimurium ATCC 14028. O diferencial desta cepa pode ser explicado devido ela ter sido isolada de um alimento de baixa atividade de água, o farelo de soja. Nesse ambiente, Salmonella pode ter desenvolvido mecanismo de sobrevivência que a tornou adaptável a resistir à essas condições (Kapetanakou et al., 2019). Inclusive, essa cepa é conhecida por desenvolver resistência a altas temperaturas e dessecação após estresse de baixa atividade de água (Beuchat et al., 2013; Syamaladevi et al., 2016).

O estresse causado pelos tratamentos de baixa atividade de água reduziu o número de colônias dos microrganismos após 24 horas e cinco dias no plaqueamento. Os efeitos de estresses na inativação de microrganismos com base na contagem em placas são geralmente as análises mais usuais em estudos. No entanto, com base apenas na contagem em placas não é possível verificar o impacto desses estresses no estado vital e funções estruturais da célula bacteriana (Gruzdev et al., 2011). A citometria de fluxo combinado a corantes de fluorescência fornecem informações importantes quanto ao estado fisiológico e o impacto de processos químicos ou físicos nos microrganismos (Comas-Riu and Rius, 2009; Díaz et al., 2010). Dessa forma, após aplicação dos tratamentos propostos, nas aw mais baixas

como 0,4, 0,5 e 0,6, houve uma maior perda da culturabilidade e as células mantiveram viáveis. Na literatura, são encontrados estudos que demonstram divergência nos dados de contagens em placa e viabilidade celular perante os

estresses causados na bactéria (Arioli et al., 2019; Kramer and Muranyi, 2014; Kramer and Thielmann, 2016). Essa divergência sugere subpopulações sob estresses subletais que não são capazes de crescer em agar (Paparella et al., 2008), além de sugerir uma possível entrada ao estado VNC. A indução neste estado é reportado em Salmonella além de outras bactérias patogênicas, em resposta a estresses (Oliver, 2010). Nessa condição, a bactéria entra em um estado metabolicamente ativo baixo e consequentemente não é detectada em análises convencionais de laboratório. Assim, a bactéria em VNC mantém sua viabilidade e quando em condições favoráveis voltam a crescer podendo levar a um risco maior pro consumidor (Finn et al., 2013; Mutz et al., 2019).

Embora não houve uma avaliação de recuperação pós-tratamento dessas cepas analisadas no presente estudo para verificar se elas seriam ou não capazes de se desenvolver novamente após o estresse, Salmonella é capaz de recuperar-se após estresse osmótico, ácido e diferentes temperaturas em meios mais propícios pro seu desenvolvimento (Gómez-Baltazar et al., 2019). Quando presentes nos alimentos, a sobrevivência dessa bactéria pode ser resultado do efeito sinergético entre a composição alimentar e as condições de baixa atividade de água (Beuchat et al., 2013). De fato, os maiores surtos envolvendo Salmonella em produtos de baixa atividade de água que ocorreram nos últimos anos são em alimentos nessa faixa de menor culturabilidade mas viável, como chocolate (aw 0,5-0,4) e pasta de amendoim

5. Conclusão

Os estresses de baixa atividade de água afetou o comportamento das cepas S. Senftenberg (IOC 2319) e S. Typhimurium (ATCC 14028). Em estresses em atividade de água abaixo de 0,7 foram onde ocorreram as maiores reduções decimais em meio de cultivo, mas as cepas permaneceram em estado viável com contagens elevadas, sendo a cepa S. Senftenberg mais resistente que a S. Typhimurium.

Dessa forma, métodos mais adequados e seguros para avaliação microbiológica padrão e mais estudos investigando a fisiologia e comportamento da célula são de extrema importância, uma vez que quando em condições favoráveis e principalmente em uma matriz alimentar onde á mais fatores envolvidos para sua sobrevivência, essas bactérias patogênicas podem se adaptar e causar sérios riscos para os consumidores.

6. Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq) por conceder o financiamento da bolsa e pesquisa (#138820/2017-1). Ao Dr. Fernando Pradella do Departamento de Genética e Biologia Molecular do Instituto de Biologia/Unicamp pelas orientações para análise dos dados da citometria de fluxo. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001

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CONCLUSÕES GERAIS

Salmonella enterica é um dos patógenos alimentares de grande importância para a saúde pública e seu envolvimento em surtos de alimentos de baixa atividade de água tem contribuído para diversos estudos. De acordo com os resultados obtidos, a cepa S. Senftenberg demonstrou ser mais resistente aos estresses quando comparada a S. Typhimurium. Além disso, os dados adquiridos na contagem das células e viabilidade celular pelo citômetro no tempo de 24 horas e cinco dias permitiram verificar uma divergência no estado fisiológico da bactéria. Em geral, quanto mais baixa a atividade de água, maiores as reduções decimais em meio de cultivo. No entanto, as células permaneceram em estado viável com contagens elevadas. Esse resultado abre o questionamento se elas podem se recuperar e adaptar numa matriz alimentar, causando um maior risco ao consumidor. A citometria de fluxo pode ser uma técnica útil para compreender melhor o estado fisiológico dos microrganismos e sugere a importância de métodos mais seguros e rápidos para avaliação microbiológica padrão.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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No documento Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) e Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028) sob estresses de baixa atividade de água : efeitos na culturabilidade e viabilidade celular (páginas 30-55)