Faculdade de Engenharia de Alimentos
SYLLAS BORBUREMA SILVA OLIVEIRA
Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) E Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028) SOB ESTRESSES DE BAIXA ATIVIDADE DE ÁGUA: EFEITOS NA
CULTURABILIDADE E VIABILIDADE CELULAR
CAMPINAS 2019
SYLLAS BORBUREMA SILVA OLIVEIRA
Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) e Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028) sob estresses de baixa atividade de água: Efeitos na culturabilidade e
viabilidade celular
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do titulo de Mestre em CIÊNCIA DE ALIMENTOS
Orientador: Prof. Dr. ANDERSON DE SOUZA SANT’ANA
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO SYLLAS BORBUREMA SILVA OLIVEIRA E ORIENTADA PELO PROF. DR. ANDERSON DE SOUZA SANT’ANA.
CAMPINAS 2019
Agência de fomento e nº de processo: CNPq #138820/2017-1
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Oliveira, Syllas Borburema Silva, 1992-
OL4s Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) e Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028) sob estresses de baixa atividade de água : efeitos na culturabilidade e viabilidade celular / Syllas Borburema Silva Oliveira. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
Orientador: Anderson de Souza Sant'Ana.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
1. Citometria de fluxo. 2. Patógenos. 3. Contagem em placas. 4. Alimentos de baixa umidade. 5. Segurança de alimentos. I. Sant'Ana, Anderson de Souza. II. Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) and Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028) under stresses of low water activity : effects on cell culturability and viability
Palavras-chave em inglês: Flow cytometry Pathogens Plate counts Low-moisture foods Food safety
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Mestre em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Anderson de Souza Sant'Ana [Orientador] Alessandro dos Santos Farias
Alessandra Regina da Silva Data de defesa: 02-05-2019
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-6129-4813 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/5582706815803600
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________
Prof. Dr. Anderson de Souza Sant’Ana (FEA/Unicamp) - Orientador
_____________________________________________________
Prof. Dr. Alessandro dos Santos Farias (IB/Unicamp) - Membro Titular
_____________________________________________________
Dra. Alessandra Regina da Silva (Fundação André Tosello) - Membro
Titular
A ATA da defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora consta no processo de vida acadêmica do aluno
Dedico a meu pai, Claudemar Borburema (In memoriam), que sempre acreditou no meu melhor e me incentivou a correr atrás dos meus sonhos.
Agradeço a minha família, amigos e a todos que contribuíram direta ou indiretamente para realização desta etapa da minha vida.
Além disso, agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq) pelo suporte financeiro (#138820/2017-1). O presente trabalho também foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001
RESUMO
Salmonella é um dos patógenos alimentares mais importantes para saúde pública no mundo e sua associação em surtos envolvendo alimentos de baixa atividade de água vem ganhando destaque de estudo. Desta forma, neste trabalho foi avaliado o comportamento de Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) e Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028) após a exposição de diferentes estresses contínuos e recorrentes de atividade de água entre 0,4 e 0,99 ao longo de 24 horas e cinco dias por contagem em plaqueamento e citometria de fluxo. De acordo com os resultados obtidos, a cepa S. Senftenberg demonstrou ser mais resistente aos estresses quando comparada a S. Typhimurium. Em geral, quanto mais baixa a atividade de água dos tratamentos, maior a perda no número de contagens celular, chegando a 6,86 e 8,51 número de reduções decimais (l) para, respectivamente, S. Senftenberg na aw 0,4 e
para S. Typhimurium na aw 0,5. Um modelo polinomial de segunda ordem demonstrou
o padrão mais apropriado para descrever o comportamento das cepas. Embora as células após os tratamentos perderam a culturabilidade, elas permaneceram em estado viável variando entre 7,09 e 9,23 log UFC.mL-1. Esse resultado abre o
questionamento se elas podem se recuperar e adaptar numa matriz alimentar, causando um maior risco ao consumidor. A citometria de fluxo pode ser uma técnica útil para compreender melhor o estado fisiológico dos microrganismos e sugere a importância de métodos mais seguros e rápidos para avaliação microbiológica padrão.
Palavras-chave: citometria de fluxo, patógenos, contagem em placas, alimentos de baixa umidade, segurança de alimentos
ABSTRACT
Salmonella is one of the most important public health foodborne pathogens in the world and its association in outbreaks involving low water activity foods has been gaining prominence in the study. Thus, in this work the behavior of Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) and Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028) was evaluated after exposure of different continuous and recurrent stresses of water activity between 0.4 and 0.99 over 24 hours and five days by plating count and flow cytometry. According to the obtained results, S. Senftenberg strain was shown to be more resistant to stress when compared to S. Typhimurium. In general, the lower the water activity of the treatments, the greater the loss in the number of cell counts, reaching 6.86 and 8.51 number of decimal reductions (l) for, respectively, S. Senftenberg at aw
0.4 and for S. Typhimurium at aw 0.5. A second order polynomial model demonstrated
the most appropriate pattern to describe the behavior of the strains. Although the cells after the treatments lost culturability, they remained in a viable physiological state ranging from 7.09 to 9.23 log CFU.mL-1. This result opens the question of whether they
can recover and adapt in a food matrix, causing a greater risk to the consumer. Flow cytometry may be a useful technique to better understand the physiological state of microorganisms and suggests the importance of safer and faster methods for standard microbiological evaluation.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ... 10
REVISÃO DE LITERATURA ... 12
Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) E Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028) SOB ESTRESSES DE BAIXA ATIVIDADE DE ÁGUA: EFEITOS NA CULTURABILIDADE E VIABILIDADE CELULAR ... 19
Resumo ... 21
1. Introdução ... 22
2. Material e Métodos ... 23
2.1 Preparação do inóculo ... 24
2.2 Preparação do caldo com aw ajustada ... 24
2.3 Estresses recorrentes e contínuos com aw reduzida em Salmonella ... 24
2.4 Análise de culturabilidade e modelos ... 26
2.5 Análise de viabilidade das células de bactérias patogênicas usando-se a citometria de fluxo ... 27
2.6 Análise estatística dos dados ... 30
3. Resultados ... 30
3.1 Efeitos dos estresses recorrentes e contínuos com aw reduzida em Salmonella no número de reduções decimais (l). ... 30
3.2 Efeitos dos estresses recorrentes e contínuos com aw reduzida em Salmonella na viabilidade celular por citometria de fluxo em comparação com a culturabilidade ... 34 4. Discussão ... 38 5. Conclusão ... 40 6. Agradecimentos ... 40 7. Referências ... 41 CONCLUSÕES GERAIS ... 45 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 46 APÊNDICE ... 50
INTRODUÇÃO GERAL
Sorotipos de Salmonella enterica são responsáveis por graves infecções alimentares em todo o mundo. Dentre as bactérias patogênicas envolvendo surtos de doenças veiculadas por alimentos (DVA’s), ela é a maior causadora dos casos de hospitalizações e mortes anuais globalmente (Majowicz et al., 2010). Embora alimentos de origem animal, tais como carne, ovos e leite contaminados sejam a principal fonte de veiculação da salmonelose, nos últimos anos tem aumentado os relatos de surtos causados por esse microrganismo associado a alimentos de baixa atividade de água (CDC, 2018; Syamaladevi et al., 2016). De fato, com base nos surtos envolvendo estes alimentos, mais de 76 % tem sido associado com Salmonella spp. (Beuchat et al., 2013).
A presença de Salmonella em alimentos é de grande preocupação para a saúde pública. E dependendo da matriz alimentar, temperatura de armazenamento, sorotipo e susceptibilidade do hospedeiro, a severidade pode ser maior (Finn et al., 2013; Podolak et al., 2010). Pequenas doses podem ser suficientes para causar uma infecção (Aviles et al., 2013; Beuchat et al., 2013; Podolak et al., 2010). Além disso, como alguns dos alimentos de baixa atividade de água não passa por uma etapa de cozimento para seu consumo e possuem uma vida de prateleira longa. Esses fatores combinado a níveis baixos de Salmonella encontrados em alimentos de baixa atividade de água podem aumentar a ocorrência de surtos, uma vez que são difíceis encontrar métodos para detecção de níveis baixos de patógenos (Beuchat et al., 2013). Dessa forma, mesmo com uma população baixa, Salmonella pode levar a consideráveis riscos ao consumidor (Finn et al., 2013).
Além disso, nessas condições em ambiente de baixa atividade de água, Salmonella desenvolve diversos mecanismos de adaptações que influenciam sua subsequente sobrevivência, persistência e patogenicidade (Gayán et al., 2016; Wesche et al., 2009). Diversos estudos têm mostrado que em condições subletais de estresse como as facilmente encontradas no processamento de alimentos e alimentos de baixa atividade, esse patógeno pode desenvolver resistência térmica e as células podem entrar em um estado metabolicamente baixo viável, mas não cultivável (VNC) (Finn et al., 2013; Mutz et al., 2019; Oliver, 2010). Quando em condições ambientais favoráveis, essas células nesse estado podem retornar ao estado metabólico normal e se desenvolverem (Podolak et al., 2010), ocasionando um potencial risco a população uma vez que essas células nesse estado não são identificadas por análises convencionais.
Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar se os estresses de baixa atividade de água afetam a viabilidade e culturabilidade celular de Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) e Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028).
REVISÃO DE LITERATURA
1. Salmonella spp. e alimentos de baixa atividade de água (aw)
Salmonella é um gênero da família Enterobacteriaceae, definido como bacilos gram-negativos, não esporulados e anaeróbios facultativos. Essa bactéria possui relativa resistência a diversos fatores externos, adaptabilidade fisiológica e pode crescer na temperatura entre 5 e 46 °C, sendo a temperatura ótima de 35 °C à 43 °C. O intervalo de pH para crescimento varia entre 3,8 e 9,5, com ótimo entre 7,0 e 7,5 (Jay et al., 2005), e já com relação a atividade de água seu crescimento é favorecido acima de 0,94, com ótima de 0,995 (FDA, 2012). A partir da fermentação da glicose e outros carboidratos, espécies desse gênero possuem a capacidade de produzir gás e ácido, e geralmente, não utilizam lactose e sacarose. São catalase positiva e oxidase negativa além de crescer utilizando somente citrato como fonte de carbono (Doyle and Buchanan, 2012).
É responsável por graves infecções alimentares em todo o mundo, e sua presença em alimentos é de grande preocupação para a saúde pública. Dentre as bactérias patogênicas, ela é a maior causadora dos casos de hospitalizações e mortes anuais nos Estados Unidos da América (EUA) (CDC, 2018). No Brasil, é o principal agente etiológico implicado nos casos notificados de surtos de doenças veiculadas por alimentos, totalizando 35 % dos casos notificados e identificados nos últimos 18 anos (Brasil, 2018). Quase todos os sorotipos desse gênero são considerados patogênicos ao homem, e dependendo da variação no mecanismo de patogenicidade, idade e condições de saúde do hospedeiro, pode apresentar diferentes sintomas (Jay et al., 2005). Salmonella enterica sorotipos Enteritidis, Typhimurium, Bredeney e Tenessee são os mais usualmente responsáveis por surtos alimentares em humanos
(Stepanović et al., 2003). Embora alimentos mais frescos de origem animal, tais como carne, ovos e leite contaminados sejam a principal fonte de veiculação da salmonelose, nos últimos anos tem aumentado os relatos de surtos causados por esse microrganismo associado a alimentos de baixa atividade de água (Syamaladevi et al., 2016). De fato, com base nos surtos envolvendo estes alimentos, mais de 76 % tem sido associado com Salmonella spp. (Beuchat et al., 2013).
A sobrevivência de Salmonella em alimentos de baixa atividade de água não somente depende da atividade de água do alimento, mas também de outros fatores, tais como, temperatura de armazenamento, composição da matriz alimentar, sorotipo, dentre outros (Finn et al., 2013; Podolak et al., 2010). Cepas de Salmonella podem sobreviver por meses chegando a períodos superiores a um ano em alimentos desse grupo tais como pasta de amendoim (Burnett et al., 2000), sementes de gergelim (Torlak et al., 2013), sementes de nozes (Blessington et al., 2012), amêndoas (Uesugi and Harris, 2006) e fórmula infantil em pó (Barron and Forsythe, 2007). A principal causa de contaminação de Salmonella em alimentos desse tipo esta relacionado com design de equipamento, manutenção inapropriada e praticas sanitária e instalações precárias (Carrasco et al., 2012).
Alguns dos mecanismos de sobrevivência que Salmonella desenvolve nessas condições de ambiente de baixa atividade de água são o acúmulo de metabólitos osmoprotetores no meio intracelular para evitar a perda de água, mudança dos fatores sigma que direcionam a transcrição para produzir proteínas de resposta aos estresses e entrada ao estado metabolicamente ativo baixo chamado de viável, mas não cultivável (VNC) (Finn et al., 2013; Mutz et al., 2019; Oliver, 2010).
As principais características fenotípicas associadas à bactéria Salmonella isoladas de alimentos desse grupo é a baixa dose de infecção, tolerância ao calor e
proteção cruzada ou cross-protection a outros estresses. O número baixo de células de Salmonella é muitas vezes suficiente para causar infecção em surtos de salmonelose e a composição da matriz alimentar contribui com a proteção e sobrevivência dessa bactéria durante o transito ao trato gastrointestinal (Aviles et al., 2013; Beuchat et al., 2013). De fato, doses dessa bactéria abaixo de 0,005 UFC.g-1
em amostras de chocolate, por exemplo, foram envolvidas em um surto no Canadá (Beuchat et al., 2013; Komitopoulou and Peñaloza, 2009). Resistência ao calor pode ser adquirida pela Salmonella e é afetada por diversos fatores antes do aquecimento, como a composição do meio de crescimento, temperatura, calor ou ácido, e durante o aquecimento, tais como acidez, solutos na matriz, porcentagem de lipídios ou até mesmo a linhagem da Salmonella (Cui et al., 2019; Podolak et al., 2010; Syamaladevi et al., 2016).
Salmonella é resistente a diversas condições de estresse, incluindo aquelas empregadas durante o processamento de alimentos como uso do calor. A exposição de células de Salmonella em condições subletais tais como encontradas em alimentos com baixa atividade de água podem levar a adaptações que influenciam sua subsequente sobrevivência, persistência e patogenicidade (Gayán et al., 2016; Wesche et al., 2009). E uma dessas adaptações é a resistência a outros tipos de estresses, a chamada proteção cruzada (Burgess et al., 2016).
Assim, embora Salmonella não possa crescer em alimentos com baixa atividade de água, quando contaminam esses produtos, essas bactérias desenvolvem mecanismo de adaptação e se mantêm viáveis por extensivos períodos de tempo, podendo aumentar a possibilidade de ocorrência de surtos e consequentes riscos a saúde da população.
2. Estado fisiológico celular e Citometria de Fluxo
Segundo Yousef e Juneja (2002), o termo “estresse” se refere a qualquer condição prejudicial que afeta a multiplicação ou sobrevivência microbiana. Em outras palavras, na perspectiva da microbiologia de alimentos, estresse bacteriano pode ser definido como uma condição física, química ou nutricional insuficientemente severa para inativar, porém que resulta em microrganismos injuriados (Gayán et al., 2016; Hill et al., 2002; Wesche et al., 2009). Em população microbiana, células viáveis são as geralmente contáveis em ambos meios seletivos e não seletivos enquanto as estressadas são capazes de formar colônias no meio não seletivo, mas não contáveis no meio seletivo. Em alimentos, as diversas condições no ambiente como composição da matriz alimentar, temperatura, pH, temperatura, ou falta de nutrientes podem levar a danos subletais nos microrganismos (Cebrián et al., 2010; Wesche et al., 2009). Nessas condições, podem causar a bactéria a entrar no estado viável, mas não cultivável, induzindo células cultiváveis a entrar em uma fase que são metabolicamente ativas, mas não produz colônias nos meios de cultura (Oliver, 2010).
A citometria de fluxo combinado à fluorescência é uma ferramenta que fornece informações importantes das propriedades estruturais e funcionais dos microrganismos a níveis de células individuais. Essa técnica pode ser utilizada para estudar a resposta celular a diferentes situações de estresses tais como as condições subletais de um ambiente de baixa atividade água. Inicialmente, ela foi desenvolvida para a área médica, mas nos últimos anos vem ganhando destaque em outras áreas como bioprocessos, ciências ambientais, microbiologia de alimentos, dentre outras (Díaz et al., 2010). Os dados obtidos pela Citometria de fluxo na microbiologia são
utilizados para o entendimento do estado metabólico ou fisiológico de uma célula, contagem rápida, estudo de populações bacterianas heterogêneas, melhoria da cepa para microbiologia industrial, separação de bactérias para analises molecular, desenvolvimento de métodos e estratégias para detecção e quantificação (Comas-Riu and Rius, 2009).
Em resumo, seu principio de funcionamento se baseia na incidência de um feixe de laser nas partículas ou células, e as intensidades dos sinais óticos gerados pelos desvios da luz e fluorescência são finalmente correlacionadas com a estrutura e/ou funcionamento dos parâmetros celular (Díaz et al., 2010; Shapiro, 2005). Inicialmente, a suspensão de células é sugada pelo equipamento, sendo misturada com um fluxo de solução salina que as guiam para um canal estreito que induz as partículas a formarem uma única linha. As partículas então atravessam o raio laser uma por uma, permitindo assim que sejam analisadas individualmente. Quando cada partícula passa pelo raio laser, ela dispersa luzes em múltiplas direções e emitem fluorescência de acordo com os fluorocromos ligados nas partículas. O citômetro detecta as luzes dispersas de maneira direta, chamadas de Foward Scatter (FSC) e as luzes dispersas lateralmente, chamadas de Side Scatter (SSC). O FSC de cada partícula é identificado pelo detector através do laser e é proporcional ao tamanho da partícula. Já o SSC é identificado por um detector localizado perpendicularmente ao raio laser e é proporcional ao formato e complexidade interna da partícula (Comas-Riu and (Comas-Rius, 2009). Essas luzes dispersadas e a emissão de fluorescência de diferentes comprimentos de onda são convertidos em sinais elétricos. Esses dados são convertidos em gráficos de pontos (dots plot) ou histogramas e a análise dos mesmos permite dividir a população de células heterogêneas de acordo com o tamanho, formato e complexidade celular, sendo uma das principais características
da técnica de citometria de fluxo. Outra característica da utilização dessa técnica é a capacidade de poder medir em grandes números, chegando até 1 trilhão de partículas por segundos dependendo do equipamento (Díaz et al., 2010).
Ainda que outros meios de avaliação fisiológica como potencial de membrana e atividade metabólica auxiliam na determinação de uma célula viável, a capacidade de manter a integridade da membrana celular é a melhor opção para avaliar a viabilidade celular (Díaz et al., 2010). Células com danos na membrana não conseguem manter uma efetiva barreira com o meio externo e são geralmente classificadas como mortas. A integridade da membrana pode ser detectada por corantes de exclusão que coram os ácidos nucleicos das células com membranas não integras. A combinação de corantes permeáveis nas células, tais como o SYTO 9 ™ e corantes não permeáveis como o iodeto de propídio (PI) podem ser usados juntos para diferenciar entre células vivas e mortas. Com isso, as células serão coradas com um fluorocromo ou o outro dependendo do estado fisiológico. O corante SYTO 9™ entra todas as células, independente da integridade de sua membrana, ligando ao DNA e RNA e emite fluorescência verde (Células vivas) enquanto o PI entra apenas em células com membranas comprometidas, ligando-se ao DNA e RNA e emitindo sinal de fluorescência vermelha (Células mortas) (Stocks, 2004). Kits comerciais de viabilidade celular utilizam esses dois corantes e são frequentemente utilizados para estudos envolvendo bactéria e processos de inativação/estresses (Berney et al., 2007).
Diversos estudos utilizaram a citometria de fluxo para avaliação da viabilidade celular de, leveduras, bactérias patogênicas e probióticos em alimentos (Fröhling and Schlüter, 2015; Muller et al., 2010; Raymond and Champagne, 2015). Por fim, a utilização dessa ferramenta na microbiologia de alimentos é de grande
importância por fornecer informações relevantes do estado fisiológico e metabólico de células principalmente após aplicações de estresses quando muitas vezes técnicas padrões não são capazes.
CAPÍTULO 1
Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) E Salmonella enterica
Typhimurium (ATCC 14028) SOB ESTRESSES DE BAIXA ATIVIDADE
DE ÁGUA: EFEITOS NA CULTURABILIDADE E VIABILIDADE
CELULAR
Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) AND Salmonella enterica
Typhimurium (ATCC 14028) UNDER STRESSES OF LOW WATER
ACTIVITY: EFFECTS ON CELL CULTURABILITY AND VIABILITY
Artigo formatado de acordo com as normas de submissão da revista
“Food Microbiology”
Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) e Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028) expostas a estresses de baixa atividade de água: efeitos na
culturabilidade e viabilidade celular
Syllas Borburema Silva Oliveira1, Mayara Messias de Oliveira1, Leticia dos Santos
Lopes1, Rafael Djalma Chaves1, Anderson de Souza Sant’Ana1*
1Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil
*Autor correspondente: Prof. Anderson de Souza Sant’Ana : and@unicamp.br Rua Monteiro Lobato, 80. Cidade Universitária Zeferino Vaz. CEP: 13083-862. Campinas, SP, Brasil.
Resumo
A exposição a estresses de baixa atividade de água pode levar há mudanças no comportamento celular de bactérias. Após aplicação dos tratamentos de estresses contínuos e recorrentes em atividade de água entre 0,4 e 0,99 ao longo de 24 horas e cinco dias, a cepa S. Senftenberg demonstrou ser mais resistente aos estresses com relação a S. Typhimurium. Houve uma redução no número de contagens celular dessas cepas de até 6,86 e 8,51 número de reduções decimais, respectivamente. Embora as células perderam a culturabilidade, elas permaneceram em estado fisiológico viável variando entre 7,09 e 9,23 log UFC.mL-1. Esse resultado abre o
questionamento se elas podem se recuperar e adaptar numa matriz alimentar, causando um maior risco ao consumidor. A citometria de fluxo pode ser uma técnica útil para compreender melhor o estado fisiológico dos microrganismos e sugere a importância de métodos mais seguros e rápidos para avaliação microbiológica padrão.
Palavras-chave: citometria de fluxo, patógenos, contagem de placas, alimentos de baixa umidade, segurança de alimentos.
1. Introdução
Sorotipos de Salmonella enterica são responsáveis por graves infecções alimentares em todo o mundo. Dentre as bactérias patogênicas envolvendo surtos de doenças veiculadas por alimentos (DVA’s), ela é a maior causadora dos casos de hospitalizações e mortes anuais globalmente (Majowicz et al., 2010). Embora alimentos de origem animal, tais como carne, ovos e leite contaminados sejam a principal fonte de veiculação da salmonelose, nos últimos anos tem aumentado os relatos de surtos causados por esse microrganismo associado a alimentos de baixa atividade de água (CDC, 2018; Syamaladevi et al., 2016). De fato, com base nos surtos envolvendo estes alimentos, mais de 76 % tem sido associado com Salmonella spp. (Beuchat et al., 2013).
A presença de Salmonella em alimentos é de grande preocupação para a saúde pública. E dependendo da matriz alimentar, temperatura de armazenamento, sorotipo e susceptibilidade do hospedeiro, a severidade pode ser maior (Finn et al., 2013; Podolak et al., 2010). Pequenas doses podem ser suficientes para causar uma infecção (Aviles et al., 2013; Beuchat et al., 2013; Podolak et al., 2010). Além disso, como alguns dos alimentos de baixa atividade de água não passa por uma etapa de cozimento para seu consumo e possuem uma vida de prateleira longa. Esses fatores combinado a níveis baixos de Salmonella encontrados em alimentos de baixa atividade de água podem aumentar a ocorrência de surtos, uma vez que são difíceis encontrar métodos para detecção de níveis baixos de patógenos (Beuchat et al., 2013). Dessa forma, mesmo com uma população baixa, Salmonella pode levar a consideráveis riscos ao consumidor (Finn et al., 2013).
Além disso, nessas condições em ambiente de baixa atividade de água, Salmonella desenvolve diversos mecanismos de adaptações que influenciam sua subsequente sobrevivência, persistência e patogenicidade (Gayán et al., 2016; Wesche et al., 2009). Diversos estudos têm mostrado que em condições subletais de estresse como as facilmente encontradas no processamento de alimentos e alimentos de baixa atividade, esse patógeno pode desenvolver resistência térmica e as células podem entrar em um estado metabolicamente baixo viável, mas não cultivável (VNC) (Finn et al., 2013; Mutz et al., 2019; Oliver, 2010). Quando em condições ambientais favoráveis, essas células nesse estado podem retornar ao estado metabólico normal e se desenvolverem (Podolak et al., 2010), ocasionando um potencial risco a população uma vez que essas células nesse estado não são identificadas por análises convencionais.
Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar se os estresses de baixa atividade de água afetam a viabilidade e culturabilidade celular de Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) e Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028).
2. Material e Métodos
Foi avaliada a influência de estresse contínuo com aw reduzida sobre o
comportamento de células de Salmonella simulando um teste de sobrevivência da mesma quando exposta à ambiente de baixa atividade de água bem como a influência de múltiplos estresses simulando sua exposição a ambientes com oferta constante de nutrientes como tubulações de equipamentos.
2.1 Preparação do inóculo
As bactérias patogênicas Salmonella enterica Senftenberg (IOC 2319) e Salmonella enterica Typhimurium (ATCC 14028), foram obtidas do estoque de coleção de culturas do Laboratório de Microbiologia Quantitativa de Alimentos do Departamento de Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). As culturas foram mantidas em tubos eppendorf de 1 mL contendo caldo de soja tripticaseína (TSB) e glicerol em temperatura –80 ºC. A ativação das cepas foi realizada por três repiques consecutivos em TSB sem glicose e incubação na temperatura de 35 ºC para o crescimento do microrganismo até atingir a contagem aproximada de 108 UFC/ml, que foi verificada
por contagem em placas.
2.2 Preparação do caldo com aw ajustada
Glicerol foi utilizado para reduzir a aw do caldo TSB sem glicose.
Inicialmente, foram realizados testes preliminares para determinação da quantidade adequada desse composto que deveria ser adicionado ao TSB para se atingir a aw
desejada. O caldo TSB ajustado com o glicerol foi esterilizado a 121 ºC por 15 minutos e a aw ajustada do caldo foi de 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 e 0,9. A aw foi medida utilizando
o equipamento de medição de atividade de água (Aqua Lab) a 25 ºC (Chiewchan et al., 2007).
Células de S. Senftenberg e S. Typhimurium foram expostas a estresses com atividade de água reduzida recorrentes (R) e contínuos (C) por até 5 dias. Para o estresse recorrente, após o período de incubação, os meios de TSB contendo o inóculo na concentração de aproximadamente 108 UFC/ml foram centrifugados a
10000 rpm por 15 minutos a 4 ºC, seguido de duas lavagens nas mesmas condições mas por 5 minutos cada. Os sobrenadantes foram descartados e os pellets foram resuspendidos em 10 mL de caldo TSB de cada aw ajustada. Em seguida, os tubos
contendo o caldo modificado de aw e o inóculo foram incubados a 25 ºC por 24 horas.
Após este período, o mesmo procedimento de centrifugações e incubação foi realizado todos os dias até o quinto dia. Já o estresse contínuo foi realizado da mesma maneira, exceto que o inóculo foi mantido no mesmo caldo inicial até o último dia estudado. A sequência dos procedimentos das análises realizadas pode ser conferida na Figura 1.
Fig. 1. Metodologia esquematizada dos estresses e análises realizadas.
2.4 Análise de culturabilidade e modelos
Nos dias 0, 1° e 5°, foram realizadas contagens de colônias em placa por diluição seriada decimal e técnica de plaqueamento em superfície no meio TSA sem glicose de todos os tratamentos em ambos os procedimentos, condições de estresse recorrente e contínuo. A culturabilidade celular foi estimada por contagem em placas após 48 horas de incubação à 35 ºC. A contagem do controle foi determinada realizando o mesmo procedimento, porém o inóculo foi adicionado em caldo sem o ajuste da atividade de água (0,99). Em seguida, o número de reduções decimais (l) de S. Senftenberg e S. Typhimurium foi determinado nos experimentos em função do tempo de 24 horas e 5 dias após o estresse conforme metodologia adaptada de Alvarenga et al. (2018). O número de reduções decimais foi calculado conforme a equação 1, envolvendo o log da população inicial subtraído do log da população final.
l
= 𝑙𝑜𝑔 &'(Onde No é a contagem inicial do microrganismo e N a contagem final.
Utilizando os dados do número de reduções decimais, foi gerado um modelo polinomial de segunda ordem para estimar o número de reduções decimais no tempo em função da variação de atividade de água (Equação 2).
l
(𝑎𝑤) = 𝑎 ∗ 𝑎𝑤 / + 𝑏 ∗ 𝑎𝑤 + 𝑐 (2) Onde l (𝑎𝑤) é o número de reduções decimais em função da atividade de água; 𝑎𝑤 é a atividade de água; 𝑎, 𝑏, 𝑐 são os coeficientes do modelo.
2.5 Análise de viabilidade das células de bactérias patogênicas usando-se a citometria de fluxo
2.5.1 Preparo dos Corantes
Para o preparo do corante iodeto de propídio (PI) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Estados Unidos da América) foi misturado 1 mg em 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) e estocado sob refrigeração de 8 ºC. Já para solução do corante SYTO9 ™ (Invitrogen, Corporation, Estados Unidos da América), foi preparado a partir da solução estoque de concentração de 5 mM, misturando-se 4 µL em 996 µL de DMSO, obtendo uma concentração de 5 μM conforme recomendação do fabricante e armazenado sob refrigeração de -20 ºC para posterior uso.
2.5.2 Preparo das Amostras e análise no citômetro
A viabilidade das células de S. enterica Senftenberg IOC 2319 e Typhimurium ATCC 14028 após exposição aos estresses mencionados anteriormente, foram analisadas pela combinação do corante impermeável PI e do corante permeável SYTO 9TM. Foram coletados volumes de 1000 µL da suspensão
de células em um tubo eppendorf para leitura no citômetro de fluxo BD FACSVerse (BD Biosciences, Estados Unidos da América) do Instituto de Biologia da Unicamp. Em seguida, essa alíquota foi centrifugada por 15 minutos a 10000 rpm, seguido por duas lavagens consecutivas com água esterilizada peptonada tamponada BPW modificada 0,1 % de peptona na mesma rotação por 5 minutos cada. Por fim, os pellets finais foram resuspendidos em 1000 µL de BPW e diluições apropriadas foram preparadas para que a concentração final de células no momento das análises no citômetro fosse de 5 a 6 logUFC.mL-1 (Diamond and DeMaggio, 2012).
Após esta etapa, foi adicionado uma alíquota de 10 μl de SYTO 9TM (5 μM)
e deixado em repouso por 20 minutos para o corante reagir. Depois, foi acrescentado uma alíquota de 5 μl de PI (1 mg.L-1) e por fim realizado a leitura da amostra no
equipamento. O branco da amostra foi preparado a partir da suspensão das células em BPW modificada 0,1 % e esterilizada sem a adição dos corantes.
2.5.3 Obtenção e análise dos dados de citometria de fluxo
O fluxo utilizado para a leitura das amostras foi o médio, equivalente a 60 µL por minuto e o número de eventos observado foi de pelo menos 30.000 em toda alíquota amostral. As amostras foram excitadas em comprimentos de onda de 488 nm e a fluorescência emitida na região 503 nm foi detectada utilizando o canal de fluorescência verde para SYTO 9TM (Invitrogen, Brasil). Já para o PI, as amostras
foram excitadas em comprimento de ondas de 488 nm, porém a fluorescência foi detectada na região de 620/30 nm pelo canal de fluorescência vermelho. O tratamento dos dados foram realizados utilizando o software FlowJo™ conforme Figura 2. Para cada tratamento, as porcentagens de células viáveis e mortas nas gates desenhadas bem como o tempo máximo de leitura da análise foram utilizados para calcular o
número total de células nas amostras, o número total de células mortas (marcadas com PI e SYTO 9TM) e o número total de células viáveis (marcadas apenas com o
SYTO 9TM) conforme as equações 3 e 4.
𝑁𝑐 = '5 ∗67∗ 89;7 : (3)
𝑉𝐿 =>∗?@áBC9 (4)
Onde Nc é o número total de células em UFC/mL; Ne é o número de eventos da leitura da análise; DL é a diluição realizada para análise; VL é o volume de leitura da amostra em µL; F o fluxo médio de velocidade de leitura do citômetro de fluxo em µL/min e Tmáx é o tempo máximo de leitura da análise pelo equipamento em segundos.
Fig. 2. Esquematização da análise dos dados pelo software FlowJo ™ para obtenção das porcentagens de células viáveis e mortas da população analisada no citômetro de fluxo. Onde Q1 e Q2 representam as regiões marcadas pelo corante SYTO9 ™; Q2 e Q3 as regiões marcadas pelo corante PI; Q4 é a região de debris celular não marcada por corante.
Os dados obtidos por essa análise quando combinados com os dados obtidos pela análise de culturabilidade celular (contagem de colônias por plaqueamento), poderão auxiliar na compreensão e entendimento do comportamento
celular pós-estresses, uma vez que após as induções a um estado de injuria/estresse, as células podem continuar viáveis ou não, ou muitas vezes elas podem estar viáveis, mas não cultiváveis o que pode ser um problema na detecção dessas células pela indústria e posterior consequências para a saúde pública.
2.6 Análise estatística dos dados
Foram realizadas 5 repetições para a bactéria S. Senftenberg e 4 repetições para a bactéria S. Typhimurium, sendo as análises em duplicatas. A análise estatística dos dados foi realizada através da análise de variância para medidas repetidas considerando os efeitos fixos de microrganismo, tratamentos, tempo e a interação entre eles, através do procedimento MIXED do software SASÔ (2012) e 15 tipos de estruturas de matriz de variâncias e covariâncias foram testadas, conforme Xavier (2000). A estrutura aplicada na análise, Componente de Variância, foi escolhida com base no menor valor do Critério de Informação de Akaike (AIC). As comparações entre as médias foram realizadas através do teste Tukey (p ≤ 0,05). Além disso, a comparação entre as variáveis de culturabilidade e viabilidade no tempo zero foi realizada através do teste t para duas amostras ao nível de 5 % de significância.
3. Resultados
3.1 Efeitos dos estresses recorrentes e contínuos com aw reduzida em Salmonella no número de reduções decimais (
l
).A suscetibilidade de S. Senftenberg (IOC 2319) e S. Typhimurium (ATCC 14028) a diferentes estresses de atividade de água ao longo do tempo foi analisada por plaqueamento, calculando o número de reduções decimais (
l
). A média e desvio padrão da contagem inicial de células dessas cepas foram de, respectivamente, 8,39 ± 0,26 e 8,61 ± 0,32 log UFC.mL-1. Os dados del
dos patógenos avaliados em 24horas de tratamento e 5 dias após a exposição aos estresses a 25 ºC são mostrados na Figura 3 e no apêndice (Tabela 1).
Inicialmente, pode-se observar que quanto maior o tempo de exposição ao estresse, maior o valor de
l
, exceto para o tratamento controle (aw = 0,99). Osestresses com atividade de água abaixo de 0,7 foram os que obtiveram os maiores valores de reduções para ambas as cepas estudadas, sendo o
l
máximo obtido experimentalmente de 6,86 ± 0,885 para S. Senftenberg (aw 0,4) e 8,51 ± 0,543 paraS. Typhimurium (aw 0,5).
Para ambas as cepas pode-se observar que nos tratamentos contínuo e recorrente de atividade de água 0,9 e 0,99, não houve diferença significativa de
l
no tempo (p > 0,05). Similarmente, o tratamento contínuo de aw 0,5 das duas cepas e ostratamentos recorrentes de aw 0,5 e 0,4 da cepa S. Typhimurium não houveram
diferença significativa no comportamento. Para a cepa S. Senftenberg, nos tratamentos que diferiram, houve um aumento de 1,95 a 3,07 vezes maiores na perda de contagens de células entre os tempos para os tratamentos contínuos e entre 2,07 e 3,31 para os recorrentes. Nos estresses contínuos e recorrentes, em 24 horas, os tratamentos abaixo de 0,8 não tiverem diferença significativa (p > 0,05) para esta cepa. E quando expostos até o quinto dia, esse comportamento se mantém para os estresses com aw abaixo de 0,6 nos tratamentos contínuos e nas aw abaixo de 0,7
tiveram maiores reduções decimais do que os contínuos. E quando se compara paralelamente com a mesma aw e nos mesmos tempos, apenas no ultimo dia de
exposição os tratamentos com aw 0,5 e 0,4 foram diferentes estatisticamente (p <
0,05).
Diferentemente, na cepa S. Typhimurium não houve diferença entre os procedimentos R e C. Os tratamentos contínuos de aw 0,8, 0,7, 0,6 e 0,4 diferiram no
tempo para esta linhagem, e as reduções foram de 4,72, 2,88, 2,84 e 1,67 vezes maior, respectivamente. Já no estresse recorrente essa redução teve um aumento de 1,75, 1,58 e 3,01 para os tratamentos de aw 0,6, 0,7 e 0,8. -1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 0.99 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 l Aw
S. Senftenberg
Contínuo D1 Contínuo D5 Recorrente D1 Recorrente D5Fig. 3. Relação dos valores de l e desvio padrão no dia um (D1) e dia cinco (D5) para os diferentes estresses de atividade de água contínuo e recorrente sob as cepas S. Senftenberg e S. Typhimurium a 25 ºC.
O comportamento das cepas estudadas no tempo em função da variação de atividade de água seguiu um modelo polinomial de segunda ordem conforme os parâmetros apresentados na Tabela 1. Os modelos demonstram que em geral ao receber múltiplos estresses diários da mesma atividade de água no tempo estudado, não somente há uma maior redução na contagem de células, independentemente do tempo avaliado, mas também maiores reduções ocorrem quando a atividade de água esta abaixo de 0,6. Além disso, pode se verificar que a cepa S. Senftenberg possui os menos valores de reduções quando comparado com a cepa S. Typhimurium.
-2.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 0.99 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 l Aw
S. Typhimurium
Contínuo D1 Contínuo D5 Recorrente D1 Recorrente D5Tabela 1
Estimativa dos coeficientes a, b e c do modelo polinomial de segunda ordem para o efeito dos estresses de baixa atividade de água nas cepas S. Senftenberg e S. Typhimurium no tempo de um dia (D1) e cinco dias (D5) de estresse a 25 ºC. Além do coeficiente de regressão do modelo e a atividade de água que fornece o número de redução decimal máximo (l𝑚á𝑥).
Tratamento l (𝑎𝑤) R2 a
w red l𝑚á𝑥 S. Senftenberg Continuo D1 -10,063aw2 + 9,529aw – 0,0013 0,927 0,473 2,255
Continuo D5 -36,768aw2 + 43,302aw – 7,5282 0,890 0,589 5,221
Recorrente D1 -12,077aw2 + 10,867aw + 0,5676 0,980 0,450 3,012
Recorrente D5 -33,208aw2 + 33,883aw– 1,6465 0,975 0,510 6,996 S. Typhimurium Continuo D1 -2,4916aw2 – 3,7076aw + 5,9812 0,934 0,400 4,100
Continuo D5 -37,305aw2 + 43,04aw – 5,9797 0,847 0,577 6,434
Recorrente D1 -10,698aw2 + 7,3654aw + 3,5225 0,912 0,344 4,790
Recorrente D5 -43,827aw2 + 49,764aw – 6,5774 0,910 0,568 7,549
3.2 Efeitos dos estresses recorrentes e contínuos com aw reduzida em Salmonella na viabilidade celular por citometria de fluxo em comparação com a culturabilidade
Para estudar a viabilidade celular de S. Senftenberg e S. Typhimurium expostas ao tratamento de baixa atividade de água a um dia e cinco dias na temperatura de 25 ºC, foi realizado análises de citometria de fluxo. Os corantes SYTO9™ e PI foram utilizados, respectivamente, para estudar a integridade da membrana celular, característica que indica a viabilidade celular. O corante permeável SYTO9™ atua nas células viáveis e mortas enquanto o PI apenas nas células mortas. Dessa forma, a partir das porcentagens dos corantes obtidas nos tratamentos
(Tabelas 2 e 3 do Apêndice) foram calculados os valores em log UFC.mL-1 das células
viáveis. A Figura 4 e 5 mostram os resultados obtidos desta análise junto aos valores de culturabilidade celular em log UFC.mL-1 para cada tratamento recorrente e continuo
das duas cepas estudadas no tempo.
Ao comparar os valores de contagens em ambas as análises no tempo zero para cada tratamento estudado, foram observadas que não houve divergência estatística dos dados (p > 0,05) o que demostra uma maior exatidão no cálculo realizado para obtenção das células viáveis. Pode-se verificar que embora ao longo do tempo a viabilidade das células reduziram para alguns tratamentos, elas permaneceram elevadas, variando entre 7 e 9 log UFC.mL-1. Por outro lado, as cepas
perderam culturabilidade a medida que o tratamento se tornava mais drástico e com o tempo. Para a cepa S. Senftenberg, o estresse com atividade de água contínua de 0,6 e estresse recorrente abaixo de 0,7 foram os que resultaram em uma maior perda de culturabilidade ao longo do tempo avaliado. Além disso, vale ressaltar que nesta cepa para o tratamento contínuo, os estresses com aw 0,5 e 0,4 houve uma menor
perda do número de células cultiváveis comparado ao estresse com aw 0,6 e 0,7. Já
com relação a S. Typhimurium, o estresse de aw 0,6 foi o mais expressivo em ambos
os tratamentos C e R atingindo uma contagem de 0,70 e 1,55 log UFC.mL-1,
Fig. 4. Efeito dos estresses de atividade de água na viabilidade celular e culturabilidade celular de S. Senftenberg. As barras representam os valores das contagens no plaqueamento e as linhas os valores de células viáveis em log UFC.mL-1.
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.99 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Vi abi lidade (Log U FC/ m L) Cu ltu rab ili dad e (L og U FC/ m L) Aw
S. Senftenberg x Continuo
Culturabilidade Contínuo D0 Culturabilidade Contínuo D1 Culturabilidade Contínuo D5 Viabilidade Contínuo D0 Viabilidade Contínuo D1 Viabilidade Contínuo D5
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.99 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Vi abi lidade cel ul ar (L og U FC/ m L) Cu ltu ra bi lid ad e (Lo g U FC/m L) Aw
S. Senftenberg x Recorrente
Culturabilidade Recorrente D0 Culturabilidade Recorrente D1 Culturabilidade Recorrente D5 Viabilidade Recorrente D0 Viabilidade Recorrente D1 Viabilidade Recorrente D5
Fig. 5. Efeito dos estresses de atividade de água na viabilidade celular e culturabilidade celular de S. Typhimurium. As barras representam os valores das contagens no plaqueamento e as linhas os valores de células viáveis em log UFC.mL-1.
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.99 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Vi abi lidade (Log U FC/ m L) Cu ltu rab ili dad e (L og U FC/ m L) Aw
S. Typhimurium x Continuo
Culturabilidade Continuo D0 Culturabilidade Contínuo D1 Culturabilidade Contínuo D5 Viabilidade Continuo D0 Viabilidade Continuo D1 Viabilidade Contínuo D5
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 0.99 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Vi abi lidade cel ul ar (L og U FC/ m L) Cu ltu ra bi lid ad e (Lo g U FC/m L) Aw
S. Typhimurium x Recorrente
Culturabilidade Recorrente D0 Culturabilidade Recorrente D1 Culturabilidade Recorrente D5 Viabilidade Recorrente D0 Viabilidade Recorrente D1 Viabilidade Recorrente D5
4. Discussão
Avaliando os modelos de comportamento das bactérias estudadas sob efeito dos tratamentos aplicados, os dados sugerem uma maior resistência aos estresses de atividade de água para a cepa S. Senftenberg IOC 2319 do que a cepa padrão S. Typhimurium ATCC 14028. O diferencial desta cepa pode ser explicado devido ela ter sido isolada de um alimento de baixa atividade de água, o farelo de soja. Nesse ambiente, Salmonella pode ter desenvolvido mecanismo de sobrevivência que a tornou adaptável a resistir à essas condições (Kapetanakou et al., 2019). Inclusive, essa cepa é conhecida por desenvolver resistência a altas temperaturas e dessecação após estresse de baixa atividade de água (Beuchat et al., 2013; Syamaladevi et al., 2016).
O estresse causado pelos tratamentos de baixa atividade de água reduziu o número de colônias dos microrganismos após 24 horas e cinco dias no plaqueamento. Os efeitos de estresses na inativação de microrganismos com base na contagem em placas são geralmente as análises mais usuais em estudos. No entanto, com base apenas na contagem em placas não é possível verificar o impacto desses estresses no estado vital e funções estruturais da célula bacteriana (Gruzdev et al., 2011). A citometria de fluxo combinado a corantes de fluorescência fornecem informações importantes quanto ao estado fisiológico e o impacto de processos químicos ou físicos nos microrganismos (Comas-Riu and Rius, 2009; Díaz et al., 2010). Dessa forma, após aplicação dos tratamentos propostos, nas aw mais baixas
como 0,4, 0,5 e 0,6, houve uma maior perda da culturabilidade e as células mantiveram viáveis. Na literatura, são encontrados estudos que demonstram divergência nos dados de contagens em placa e viabilidade celular perante os
estresses causados na bactéria (Arioli et al., 2019; Kramer and Muranyi, 2014; Kramer and Thielmann, 2016). Essa divergência sugere subpopulações sob estresses subletais que não são capazes de crescer em agar (Paparella et al., 2008), além de sugerir uma possível entrada ao estado VNC. A indução neste estado é reportado em Salmonella além de outras bactérias patogênicas, em resposta a estresses (Oliver, 2010). Nessa condição, a bactéria entra em um estado metabolicamente ativo baixo e consequentemente não é detectada em análises convencionais de laboratório. Assim, a bactéria em VNC mantém sua viabilidade e quando em condições favoráveis voltam a crescer podendo levar a um risco maior pro consumidor (Finn et al., 2013; Mutz et al., 2019).
Embora não houve uma avaliação de recuperação pós-tratamento dessas cepas analisadas no presente estudo para verificar se elas seriam ou não capazes de se desenvolver novamente após o estresse, Salmonella é capaz de recuperar-se após estresse osmótico, ácido e diferentes temperaturas em meios mais propícios pro seu desenvolvimento (Gómez-Baltazar et al., 2019). Quando presentes nos alimentos, a sobrevivência dessa bactéria pode ser resultado do efeito sinergético entre a composição alimentar e as condições de baixa atividade de água (Beuchat et al., 2013). De fato, os maiores surtos envolvendo Salmonella em produtos de baixa atividade de água que ocorreram nos últimos anos são em alimentos nessa faixa de menor culturabilidade mas viável, como chocolate (aw 0,5-0,4) e pasta de amendoim
5. Conclusão
Os estresses de baixa atividade de água afetou o comportamento das cepas S. Senftenberg (IOC 2319) e S. Typhimurium (ATCC 14028). Em estresses em atividade de água abaixo de 0,7 foram onde ocorreram as maiores reduções decimais em meio de cultivo, mas as cepas permaneceram em estado viável com contagens elevadas, sendo a cepa S. Senftenberg mais resistente que a S. Typhimurium.
Dessa forma, métodos mais adequados e seguros para avaliação microbiológica padrão e mais estudos investigando a fisiologia e comportamento da célula são de extrema importância, uma vez que quando em condições favoráveis e principalmente em uma matriz alimentar onde á mais fatores envolvidos para sua sobrevivência, essas bactérias patogênicas podem se adaptar e causar sérios riscos para os consumidores.
6. Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq) por conceder o financiamento da bolsa e pesquisa (#138820/2017-1). Ao Dr. Fernando Pradella do Departamento de Genética e Biologia Molecular do Instituto de Biologia/Unicamp pelas orientações para análise dos dados da citometria de fluxo. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001
7. Referências
Alvarenga, V.O., Campagnollo, F.B., Pia, A.K.R., Conceição, D.A., Abud, Y., Sant’Anna, C., Hubinger, M.D., Sant’Ana, A.S., 2018. Quantifying the Responses of Three Bacillus cereus Strains in Isothermal Conditions and During Spray Drying of Different Carrier Agents. Frontiers in Microbiology 9. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01113
Arioli, S., Montanari, C., Magnani, M., Tabanelli, G., Patrignani, F., Lanciotti, R., Mora, D., Gardini, F., 2019. Modelling of Listeria monocytogenes Scott A after a mild heat treatment in the presence of thymol and carvacrol: Effects on culturability and viability. Journal of Food Engineering 240, 73–82. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2018.07.014
Aviles, B., Klotz, C., Smith, T., Williams, R., Ponder, M., 2013. Survival of Salmonella enterica Serotype Tennessee during Simulated Gastric Passage Is Improved by Low Water Activity and High Fat Content. Journal of Food Protection 76, 333–337. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-12-280
Barron, J.C., Forsythe, S.J., 2007. Dry stress and survival time of Enterobacter sakazakii and other Enterobacteriaceae in dehydrated powdered infant formula. Journal of food protection 70, 2111–7.
Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H.-U., Egli, T., 2007. Assessment and Interpretation of Bacterial Viability by Using the LIVE/DEAD BacLight Kit in Combination with Flow Cytometry. Applied and Environmental Microbiology 73, 3283–3290. https://doi.org/10.1128/AEM.02750-06
Beuchat, L.R., Komitopoulou, E., Beckers, H., Betts, R.P., Bourdichon, F., Fanning, S., Joosten, H.M., Ter Kuile, B.H., 2013. Low–Water Activity Foods: Increased Concern as Vehicles of Foodborne Pathogens. Journal of Food Protection 76, 150–172. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-12-211
Blessington, T., Elizabeth, JM., Linda, JH., 2012. Survival of Salmonella enterica, Escherichia coli O157:H7, and Listeria monocytogenes on Inoculated Walnut Kernels during Storage. Journal of Food Protection 75, 245–254. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-11-278
Brasil, 2018. Doenças Transmitidas por Alimentos [WWW Document]. URL http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2018/abril/02/Apresentacao-Surtos-DTA-Marco-2018.pdf
Burgess, C.M., Gianotti, A., Gruzdev, N., Holah, J., Knøchel, S., Lehner, A., Margas, E., Esser, S.S., Sela (Saldinger), S., Tresse, O., 2016. The response of foodborne pathogens to osmotic and desiccation stresses in the food chain. International Journal of Food Microbiology 221, 37–53. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.12.014
Burnett, S.L., Gehm, E.R., Weissinger, W.R., Beuchat, L.R., 2000. Survival of Salmonella in peanut butter and peanut butter spread. Journal of applied microbiology 89, 472–7. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2000.01138.x Carrasco, E., Morales-Rueda, A., García-Gimeno, R.M., 2012. Cross-contamination
and recontamination by Salmonella in foods: A review. Food Research International 45, 545–556. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2011.11.004
CDC, 2018. National Outbreak Reporting System (NORS) Dashboard | CDC [WWW Document]. URL https://wwwn.cdc.gov/norsdashboard/ (accessed 6.2.18).
Cebrián, G., Sagarzazu, N., Pagán, R., Condón, S., Mañas, P., 2010. Development of stress resistance in Staphylococcus aureus after exposure to sublethal environmental conditions. International Journal of Food Microbiology 140, 26– 33. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2010.02.017
Chiewchan, N., Pakdee, W., Devahastin, S., 2007. Effect of water activity on thermal resistance of Salmonella krefeld in liquid medium and on rawhide surface. International Journal of Food Microbiology 114, 43–49. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2006.10.037
Comas-Riu, J., Rius, N., 2009. Flow cytometry applications in the food industry. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 36, 999–1011. https://doi.org/10.1007/s10295-009-0608-x
Cui, X., Hu, C., Ou, L., Kuramitsu, Y., Masuda, Y., Honjoh, K., Miyamoto, T., 2019. Transcriptional analysis on heat resistance and recovery from thermal damage in Salmonella under high salt condition. LWT 106, 194–200. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2019.02.056
Diamond, R.A., DeMaggio, S., 2012. In Living Color: Protocols in Flow Cytometry and Cell Sorting. Springer Science & Business Media.
Díaz, M., Herrero, M., García, L.A., Quirós, C., 2010. Application of flow cytometry to industrial microbial bioprocesses. Biochemical Engineering Journal 48, 385– 407. https://doi.org/10.1016/j.bej.2009.07.013
Doyle, M.P., Buchanan, R.L., 2012. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. American Society for Microbiology Press.
FDA, 2012. Bad Bug Book Handbook of Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins, 2nd ed.
Finn, S., Condell, O., McClure, P., Amézquita, A., Fanning, S., 2013. Mechanisms of survival, responses and sources of Salmonella in low-moisture environments. Front. Microbiol. 4. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00331
Fröhling, A., Schlüter, O.K., 2015. Flow cytometric evaluation of physico-chemical impact on Gram-positive and Gram-negative bacteria. Front. Microbiol. 6. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00939
Gayán, E., Cambré, A., Michiels, C.W., Aertsen, A., 2016. Stress-Induced Evolution of Heat Resistance and Resuscitation Speed in Escherichia coli O157:H7 ATCC 43888. Applied and Environmental Microbiology 82, 6656–6663. https://doi.org/10.1128/AEM.02027-16
Gómez-Baltazar, A., Vázquez-Garcidueñas, Ma.S., Larsen, J., Kuk-Soberanis, M.E., Vázquez-Marrufo, G., 2019. Comparative stress response to food preservation conditions of ST19 and ST213 genotypes of Salmonella enterica serotype
Typhimurium. Food Microbiology 82, 303–315.
https://doi.org/10.1016/j.fm.2019.03.010
Gruzdev, N., Pinto, R., Sela, S., 2011. Effect of Desiccation on Tolerance of Salmonella enterica to Multiple Stresses. Applied and Environmental Microbiology 77, 1667–1673. https://doi.org/10.1128/AEM.02156-10
Hill, C., Cotter, P.D., Sleator, R.D., Gahan, C.G.M., 2002. Bacterial stress response in Listeria monocytogenes: jumping the hurdles imposed by minimal processing. International Dairy Journal 12, 273–283. https://doi.org/10.1016/S0958-6946(01)00125-X
Jay, J.M., Loessner, M.J., Golden, D.A., 2005. Modern Food Microbiology, 7th ed, Food Science Text Series. Springer US.
Kapetanakou, A.E., Makariti, I.P., Nazou, E.Ν., Manios, S.G., Karavasilis, K., Skandamis, P.N., 2019. Modelling the effect of osmotic adaptation and
temperature on the non–thermal inactivation of Salmonella spp. on brioche-type products. International Journal of Food Microbiology 296, 48–57. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2019.02.010
Komitopoulou, E., Peñaloza, W., 2009. Fate of Salmonella in dry confectionery raw materials. Journal of Applied Microbiology 106, 1892–1900. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2009.04144.x
Kramer, B., Muranyi, P., 2014. Effect of pulsed light on structural and physiological properties of Listeria innocua and Escherichia coli. Journal of Applied Microbiology 116, 596–611. https://doi.org/10.1111/jam.12394
Kramer, B., Thielmann, J., 2016. Monitoring the live to dead transition of bacteria during thermal stress by a multi-method approach. Journal of Microbiological Methods 123, 24–30. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2016.02.009
Majowicz, S.E., Musto, J., Scallan, E., Angulo, F.J., Kirk, M., O’Brien, S.J., Jones, T.F., Fazil, A., Hoekstra, R.M., 2010. The Global Burden of Nontyphoidal Salmonella Gastroenteritis. Clinical Infectious Diseases 50, 882–889. https://doi.org/10.1086/650733
Muller, J.A., Stanton, C., Sybesma, W., Fitzgerald, G.F., Ross, R.P., 2010. Reconstitution conditions for dried probiotic powders represent a critical step in determining cell viability. Journal of Applied Microbiology 108, 1369–1379. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2009.04533.x
Mutz, Y. da S., Rosario, D.K.A., Paschoalin, V.M.F., Conte-Junior, C.A., 2019. Salmonella enterica: A hidden risk for dry-cured meat consumption? Critical Reviews in Food Science and Nutrition 0, 1–15. https://doi.org/10.1080/10408398.2018.1555132
Oliver, J.D., 2010. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews 34, 415–425. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2009.00200.x
Paparella, A., Taccogna, L., Aguzzi, I., Chaves-López, C., Serio, A., Marsilio, F., Suzzi, G., 2008. Flow cytometric assessment of the antimicrobial activity of essential oils against Listeria monocytogenes. Food Control 19, 1174–1182. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2008.01.002
Podolak, R., Enache, E., Stone, W., Black, D.G., Elliott, P.H., 2010. Sources and Risk Factors for Contamination, Survival, Persistence, and Heat Resistance of Salmonella in Low-Moisture Foods. Journal of Food Protection 73, 1919–1936. https://doi.org/10.4315/0362-028X-73.10.1919
Raymond, Y., Champagne, C.P., 2015. The use of flow cytometry to accurately ascertain total and viable counts of Lactobacillus rhamnosus in chocolate. Food Microbiology 46, 176–183. https://doi.org/10.1016/j.fm.2014.07.002
Scallan, E., Hoekstra, R.M., Angulo, F.J., Tauxe, R.V., Widdowson, M.-A., Roy, S.L., Jones, J.L., Griffin, P.M., 2011. Foodborne Illness Acquired in the United States—Major Pathogens. Emerging Infectious Diseases 17, 7–15. https://doi.org/10.3201/eid1701.P11101
Shapiro, H.M., 2005. Practical Flow Cytometry. John Wiley & Sons.
Stepanović, S., Ćirković, I., Mijač, V., Švabić-Vlahović, M., 2003. Influence of the incubation temperature, atmosphere and dynamic conditions on biofilm formation by Salmonella spp. Food Microbiology 20, 339–343. https://doi.org/10.1016/S0740-0020(02)00123-5
Stocks, S.M., 2004. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A 61A, 189–195. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20069
Syamaladevi, R.M., Tang, J., Villa-Rojas, R., Sablani, S., Carter, B., Campbell, G., 2016. Influence of Water Activity on Thermal Resistance of Microorganisms in Low-Moisture Foods: A Review: Influence of water activity…. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 15, 353–370. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12190
Torlak, E., Sert, D., Serin, P., 2013. Fate of Salmonella during sesame seeds roasting and storage of tahini. International Journal of Food Microbiology 163, 214–217. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.03.010
Uesugi, A.R., Harris, L.J., 2006. Growth of Salmonella Enteritidis phage type 30 in almond hull and shell slurries and survival in drying almond hulls. Journal of Food Protection 69, 712–718.
Wesche, A.M., Gurtler, J.B., Marks, B.P., Ryser, E.T., 2009. Stress, Sublethal Injury, Resuscitation, and Virulence of Bacterial Foodborne Pathogens. Journal of Food Protection 72, 1121–1138. https://doi.org/10.4315/0362-028X-72.5.1121 Yousef, A., Juneja, V., 2002. Microbial Stress Adaptation and Food Safety [WWW
Document]. CRC Press. URL https://www.crcpress.com/Microbial-Stress-Adaptation-and-Food-Safety/Yousef-Juneja/p/book/9781566769129
CONCLUSÕES GERAIS
Salmonella enterica é um dos patógenos alimentares de grande importância para a saúde pública e seu envolvimento em surtos de alimentos de baixa atividade de água tem contribuído para diversos estudos. De acordo com os resultados obtidos, a cepa S. Senftenberg demonstrou ser mais resistente aos estresses quando comparada a S. Typhimurium. Além disso, os dados adquiridos na contagem das células e viabilidade celular pelo citômetro no tempo de 24 horas e cinco dias permitiram verificar uma divergência no estado fisiológico da bactéria. Em geral, quanto mais baixa a atividade de água, maiores as reduções decimais em meio de cultivo. No entanto, as células permaneceram em estado viável com contagens elevadas. Esse resultado abre o questionamento se elas podem se recuperar e adaptar numa matriz alimentar, causando um maior risco ao consumidor. A citometria de fluxo pode ser uma técnica útil para compreender melhor o estado fisiológico dos microrganismos e sugere a importância de métodos mais seguros e rápidos para avaliação microbiológica padrão.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alvarenga, V.O., Campagnollo, F.B., Pia, A.K.R., Conceição, D.A., Abud, Y., Sant’Anna, C., Hubinger, M.D., Sant’Ana, A.S., 2018. Quantifying the Responses of Three Bacillus cereus Strains in Isothermal Conditions and During Spray Drying of Different Carrier Agents. Frontiers in Microbiology 9. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01113
Arioli, S., Montanari, C., Magnani, M., Tabanelli, G., Patrignani, F., Lanciotti, R., Mora, D., Gardini, F., 2019. Modelling of Listeria monocytogenes Scott A after a mild heat treatment in the presence of thymol and carvacrol: Effects on culturability and viability. Journal of Food Engineering 240, 73–82. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2018.07.014
Aviles, B., Klotz, C., Smith, T., Williams, R., Ponder, M., 2013. Survival of Salmonella enterica Serotype Tennessee during Simulated Gastric Passage Is Improved by Low Water Activity and High Fat Content. Journal of Food Protection 76, 333–337. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-12-280
Barron, J.C., Forsythe, S.J., 2007. Dry stress and survival time of Enterobacter sakazakii and other Enterobacteriaceae in dehydrated powdered infant formula. Journal of food protection 70, 2111–7.
Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H.-U., Egli, T., 2007. Assessment and Interpretation of Bacterial Viability by Using the LIVE/DEAD BacLight Kit in Combination with Flow Cytometry. Applied and Environmental Microbiology 73, 3283–3290. https://doi.org/10.1128/AEM.02750-06
Beuchat, L.R., Komitopoulou, E., Beckers, H., Betts, R.P., Bourdichon, F., Fanning, S., Joosten, H.M., Ter Kuile, B.H., 2013. Low–Water Activity Foods: Increased Concern as Vehicles of Foodborne Pathogens. Journal of Food Protection 76, 150–172. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-12-211
Blessington, T., Elizabeth, JM., Linda, JH., 2012. Survival of Salmonella enterica, Escherichia coli O157:H7, and Listeria monocytogenes on Inoculated Walnut Kernels during Storage. Journal of Food Protection 75, 245–254. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-11-278
Brasil, 2018. Doenças Transmitidas por Alimentos [WWW Document]. URL http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2018/abril/02/Apresentacao-Surtos-DTA-Marco-2018.pdf
Burgess, C.M., Gianotti, A., Gruzdev, N., Holah, J., Knøchel, S., Lehner, A., Margas, E., Esser, S.S., Sela (Saldinger), S., Tresse, O., 2016. The response of foodborne pathogens to osmotic and desiccation stresses in the food chain. International Journal of Food Microbiology 221, 37–53. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.12.014
Burnett, S.L., Gehm, E.R., Weissinger, W.R., Beuchat, L.R., 2000. Survival of Salmonella in peanut butter and peanut butter spread. Journal of applied microbiology 89, 472–7. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2000.01138.x Carrasco, E., Morales-Rueda, A., García-Gimeno, R.M., 2012. Cross-contamination
and recontamination by Salmonella in foods: A review. Food Research International 45, 545–556. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2011.11.004
CDC, 2018. National Outbreak Reporting System (NORS) Dashboard | CDC [WWW Document]. URL https://wwwn.cdc.gov/norsdashboard/ (accessed 6.2.18). Cebrián, G., Sagarzazu, N., Pagán, R., Condón, S., Mañas, P., 2010. Development of
