Efeitos da fascina na adesão, migração e invasão das células de câncer oral

Para melhor compreender o papel da fascina na adesão, migração e invasão das células de CEC oral, optamos em construir linhagens de células expressando estavelmente um shRNA contra o mRNA de interesse. Como controle, utilizamos uma sequência de shRNA incapaz de modular a expressão de genes conhecidos. As linhagens parentais também foram utilizadas em todos os ensaios. As linhagens HSC-3 e SCC-15 foram escolhidas para realizarmos os ensaios funcionais por apresentarem alta expressão de fascina, mas diferentes potenciais de migração e invasão. O ensaio de western blot confirmou que os níveis elevados de produção de fascina nas linhagens celulares escolhidas (Fig. 19).

Fig. 19. Análise de western blot para fascina nas linhagens HGK, SCC-15 e HSC- 3. Este ensaio confirmou a elevada expressão de fascina nas linhagens de CEC oral.

Após a transdução das linhagens celulares com as partículas lentivirais, as celulares foram selecionadas com puromicina. A Fig. 20 ilustra o ensaio de western blot confirmando que a produção de fascina foi eficientemente diminuída nas linhagens celulares HSC-3 e SCC-15 e diferenças significativas na produção entre as células parental e controle não foram observadas.

Fig. 20. Análise da produção de fascina nas linhagens transduzidas com partículas lentivírais. As linhagens HSC-3 shFSCN e SCC-15 shFSCN demonstraram níveis drasticamente menores de fascina em comparação as células controle.

A influência da neutralização estável de fascina na adesão celular foi testada por meio de ensaios de adesão utilizando superfícies tratadas com fibronectina, matrigel e miogel. Superfícies não tratadas, nomeadas aqui como BSA, também foram testadas. O silenciamento de fascina na linhagem HSC-3 promoveu um aumento significativo na adesão ao BSA e à fibronectina (Fig. 21). As células HSC-3 shFSCN apresentaram maior adesão quando comparadas à linhagem HSC-3 parental (p=0,01 e p<0,0001) e à linhagem HSC-3 shControle (p=0,008 e p<0,0001). Não foram observadas diferenças na capacidade de adesão ao BSA e à fibronectina entre a linhagem HSC-3 parental e HSC-3 shControle. Enquanto o silenciamento estável de fascina foi capaz de aumentar a adesão das células HSC-3 ao substrato BSA e fibronectina, não foi capaz de promover aumento de adesão celular ao matrigel e ao miogel (Fig. 21).

Na linhagem SCC-15, a neutralização de fascina (SCC-15 shFSCN) induziu um aumento significativo na adesão à fibronectina em comparação às linhagens SCC-15 parental (p<0,0001) e SCC-15 shControle (p=0,001) (Fig. 22). Não houve diferença na adesão à fibronectina entre a linhagem SCC-15 parental e SCC-15 shControle. A neutralização de fascina nas células SCC-15 não foi capaz de aumentar a adesão celular aos substratos matrigel e miogel (Fig. 22).

A d e s ã o 1 2 3 4 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 0 .2 5 H S C -3 H S C -3 s h C o n tro le B S A H S C -3 s h F S C N F ib r o n e c tin a M a tr ig e l M io g e l

Fig. 21. O silenciamento de fascina nas células HSC-3 induziu a adesão as superfícies não-tratadas e tratadas com fibronectina. Enquanto a adesão das células HSC-3 shFSCN foi significantemente maior nas superfícies BSA (p=0,008) e fibronectina (p<0,0001) em relação as células HSC-3 shControle, nenhuma diferença significante foi observada com as superfícies tratadas com matrigel ou miogel. A d e s ã o 1 2 3 4 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 0 .2 5 S C C -1 5 S C C -1 5 s h C o n tro le B S A S C C -1 5 s h F S C N F ib r o n e c tin a M a tr ig e l M io g e l

Fig. 22. A neutralização de fascina influencia a adesão das células SCC-15 em superfícies sensibilizadas com fibronectina. As células foram submetidas a ensaios de adesão em superfícies tratadas com fibronectina, matrigel e miogel. A adesão das células SCC-15 shFSCN foi significantemente maior nas superfícies tratadas com fibronectina (p<0,0001).

As células SCC15 shFSCN demonstraram uma adesão significantemente maior na superfície tratada com fibronectina (p=0,001) que as células HSC-3 shControle. Não existiram diferenças na adesão nas superfície tratadas com matrigel ou miogel e nem na superfície não-tratada (BSA).

O silenciamento estável de fascina e sua influência na migração celular foi avaliado nas linhagens HSC-3 e SCC-15 utilizando o sistema Transwell. Soro fetal bovino foi utilizado como agente quimiotático. A neutralização da expressão da proteína fascina foi capaz de diminuir drasticamente a motilidade das linhagens estudadas (Fig. 24 e 25). As células HSC-3 shFSCN e SCC-15 shFSCN demonstraram uma significante redução na capacidade migratória em relação às células parentais HSC-3 (p<0,0001) e SCC-15 (p<0,0001) e aos controles HSC-3 shControle (p<0,0001) e SCC-15 shControle (p<0,0001). Diferenças significativas na migração entre as células parentais e os controles não foram observadas.

Com a finalidade de confirmar os resultados obtidos no ensaio de migração no sistema Transwell, nós realizamos o ensaio de migração horizontal (wound healing) utilizando as células HSC-3. As imagens foram capturadas ao tempo 0 e após 9 h do início do ensaio. Não foram observadas diferenças na porcentagem de fechamento da ferida entre as células HSC-3 parental e a controle (HSC-3 shControle), sendo que ambas apresentaram a ferida totalmente fechada após 9 h. As células HSC-3 shFSCN no tempo 9 h ainda apresentava em média 20% da ferida aberta, conforme ilustrado na Fig. 26, confirmando uma diminuição na capacidade migratória promovida pelo silenciamento de fascina.

M ig ra ç ã o H SC -3 H SC -3 s hC on tro le H SC -3 s hF SC N 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0

Fig. 23. Fascina controla a migração das células HSC-3. A neutralização de fascina foi acompanhada por uma significante redução na capacidade migratória das células HSC-3 (p<0,0001). M ig ra ç ã o S CC -1 5 S CC -1 5 sh R N A c o n trol S CC -1 5 sh F S C N 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5

Fig. 24. Efeito da redução nos níveis de expressão de fascina na migração das células SCC-15. Migração celular foi acessada pelo ensaio de migração vertical no sistema Transwell. Células SCC-15 shFSCN apresentam uma redução significantiva na capacidade de migração em relação as células SCC-15 (p<0,0001) e SCC-15 shControle (p<0,0001).

Fig. 25. Ensaio de migração horizontal (wound healing) com as células HSC-3. Após de 9 h, as células HSC-3 e HSC-3 shControle apresentaram fechamento completo da ferida, enquanto ainda restava uma média de 20% de ferida aberta na linhagem HSC-3 shFSCN.

Com o intuito de verificar a influência do silenciamento de fascina na invasão celular foram utilizados os ensaios de invasão com o sistema Transwell/Miogel e o modelo organotípico em mioma uterino. O ensaio de invasão vertical nos transwells recobertos com miogel demonstrou uma diminuição significativa na capacidade invasiva entre as linhagens HSC-3 parental e HSC-3 shFSCN (p<0,0001) e entre HSC-3 shControle e HSC-3 shFSCN (p<0,0001) (Fig. 26). Uma diminuição similar foi observada entre as linhagens SCC-15 parental e SCC-15 shFSCN (p<0,0001) e entre SCC-15 shControle e SCC-15 shFSCN (p<0,0001) (Fig. 27). Diferenças não foram encontradas entre as células parentais e os controles.

O modelo organotípico em mioma permite mimetizar o processo de invasão celular que ocorre in vivo. Com este ensaio é possível verificar, o número, a área e a profundidade de invasão das ilhas de células tumorais. Todas as

linhagens celulares demonstraram capacidade em invadir os tecidos, porém a invasão das células HSC-3 foi mais pronunciada em todos os parâmetros (Fig. 28). Contudo, nenhuma diferença significante na capacidade de invasão foi observada (Fig. 29 e 30). In v a s ã o H SC -3 H SC -3 s hC o n trole H SC -3 s hF S C N 0 .0 0 0 .0 5 0 .1 0 0 .1 5 0 .2 0 0 .2 5

Fig. 26. A neutralização de fascina promoveu um fenótipo menos invasivo das células HSC-3. O ensaio de invasão celular no sistema Transwell/Miogel evidenciou um aumento significante na invasão das células HSC-3-shFSCN em comparação as células HSC-3 e HSC-3-shControle (p<0,0001).

In v a s ã o S CC -1 5 S CC -1 5 sh R N A c o n trol S CC -1 5 sh F S C N 0 .0 0 .1 0 .2 0 .3 0 .4

Fig. 27. Efeito da neutralização de fascina sobre a invasão das células SCC-15. Ensaio de invasão celular no sistema Transwell/Miogel indicou uma menor invasão nas células SCC-15 shFSCN em relação à SCC-15 e SCC-15 shControle (p<0,0001).

Fig. 28. Efeito da neutralização de fascina na invasão em modelo organotípico em mioma. Nesta imagem são mostrados cortes histológicos representativos da invasão celular nos miomas pelas linhagens celulares HSC-3 (A), HSC-3 shControle (B), HSC-3 shFSCN (C), SCC-15 (D), SCC-15 shControle (E) e SCC- 15 shFSCN (F).

Fig. 29. Quantificação dos ensaios de invasão em modelo organotípico em mioma das linhagens HSC-3, HSC-3 shControle e HSC-3 shFSCN. (A) Número de ilhas, (B) Área de invasão e (C) Profundidade de invasão.

Fig. 30. Ensaio de invasão em modelo organotípico em mioma das linhagens SCC-15, SCC-15 shControle e SCC-15 shFSCN. (A) Número de ilhas, (B) Área de invasão e (C) Profundidade de invasão.

6 DISCUSSÃO

O CEC oral apresenta taxas significantes de mortalidade e de morbidade (Alam et al., 2012). Os fatores prognósticos utilizados atualmente são subjetivos e relativamente não confiáveis, visto que o tumor possui um curso clínico variável (Shiptzer et al., 2009). O principal marcador prognóstico utilizado para pacientes com CEC oral ainda é o estadio clínico (sistema TNM), apesar de seu limitado valor, diante das diferenças na evolução clínica e tempo de sobrevida em pacientes classificados com um mesmo estadio (Bitu et al., 2012). Mesmo diante dos significativos avanços alcançados nas últimas décadas na identificação de novos biomarcadores relacionados ao CEC oral, nenhum é utilizado rotineiramente na prática clínica. Dessa maneira, um melhor entendimento do comportamento biológico do CEC oral é necessário para o desenvolvimento de potenciais ferramentas diagnósticas e prognósticas auxiliares para o uso clínico. A fascina e a plectina são proteínas que desempenham um importante papel nos processos de adesão e motilidade celular e demonstram uma expressão aumentada em vários tipos de carcinomas. A expressão de fascina é ausente ou reduzida no epitélio normal (Zhang et al., 2008; Jayo & Parsons, 2010) e a plectina é expressa em quase todos os tecidos humanos (Castañón et al., 2013; Winter & Wiche, 2013), porém a expressão aumentada de fascina e plectina tem sido descrita no CEC oral e correlacionada à um pior prognóstico para o paciente (Lee et al., 2007; Alam et al., 2012; Katada et al., 2012). No entanto, o papel biológico dessas proteínas na tumorigênese oral ainda é desconhecido. Além disso, estudos que avaliem a expressão de fascina e plectina e seu papel na progressão e/ou desenvolvimento tumoral, especificamente em CEC oral, são muito escassos (Lee et al., 2007; Chen et al., 2009; Takkunen et al., 2009; Shimamura et al., 2011; Alam et al., 2012; Katada et al., 2012). O estudo da expressão dessas proteínas torna-se, dessa maneira, um importante passo para elucidar seus possíveis papéis na oncogênese e progressão do CEC oral.

Os resultados desse estudo confirmaram que as amostras de CEC oral mostram uma maior expressão de fascina em comparação com as amostras de mucosa oral normal quando analisadas por imuno-histoquímica e qRT-PCR. No estudo atual, fascina mostrou um padrão de marcação citoplasmático restrito às células da camada basal e suprabasal no epitélio oral normal e um padrão de marcação mais difuso nas ilhas tumorais nas amostras de CEC oral semelhante ao encontrado em outros estudos (Hashimoto et al., 2006; Alam et al., 2012). Além disso, algumas células inflamatórias e endoteliais também demonstraram marcação positiva para fascina. Hashimoto e colaboradores (2005) demonstraram a superexpressão imuno-histoquímica de fascina em carcinoma escamoso esofágico, apresentando um padrão de marcação citoplasmático e difuso no carcinoma e marcação positiva para células endoteliais. De maneira semelhante, Alam e colaboradores (2012) demonstraram uma expressão elevada de fascina em CEC oral por imuno-histoquímica em comparação ao tecido normal, com a fascina mostrando um padrão de marcação citoplasmático e de membrana. Hu e colaboradores (2006) demonstraram que fascina tem uma expressão diferencial em amostras de carcinoma pancreático em comparação ao tecido normal e Yamaguchi e colaboradores (2007) também analisaram a expressão de fascina em carcinoma pancreático. Gao e colaboradores (2012) de maneira similar analisaram amostras frescas de carcinoma de laringe e como nos estudos anteriores demonstraram uma maior expressão de fascina nas amostras tumorais em comparação ao tecido normal. Nosso estudo demonstrou ainda uma expressão aumentada de fascina em linhagens celulares derivadas de CEC oral em comparação à linhagem celular de queratinócitos não-tumorigênicos (HGK), estando de acordo com os achados da literatura que demonstram uma maior expressão de fascina (Hashimoto et al., 2007; Alam et al., 2012) nas linhagens tumorais.

Neste estudo a expressão aumentada de fascina foi observada nas displasias e CEC oral. Nossos achados demonstraram que fascina é mais expressa nas displasias e no CEC oral em comparação às hiperplasias com

mucosa oral normal. Nas displasias, as células positivas para fascina apresentaram um padrão de marcação não restrito às camadas inferiores do epitélio, diferindo do que foi observado na maioria dos casos de hiperplasia fibrosa. Esses achados são suportados pelo estudo de Shimamura e colaboradores (2011), que observaram um aumento gradual no nível de expressão de fascina na progressão tumoral, do tecido benigno para displasia e finalmente CEC oral. A expressão de fascina em lesões malignizáveis de pâncreas (Zhang et al., 2006), cólon e reto (Hashimoto et al., 2006), esófago (Takikita et al., 2011) e papiloma invertido sinunasal com displasia (Wang et al., 2007) foi relatada. Zhang e colaboradores (2006) demonstraram que os níveis e a frequência de superexpressão de fascina aumenta gradualmente durante a carcinogênese do esôfago. De maneira similar, Yamagushi e colaboradores (2007) mostraram por imuno-histoquímica que a expressão de fascina aumentada em neoplasias de pâncreas e correlaciona com um aumento do grau histológico.

Na literatura há uma série de estudos correlacionando a expressão de fascina à um pior prognóstico para o paciente (Hashimoto et al., 2004; Gu et al., 2014; Katada et al., 2012). A superexpressão de fascina foi preditiva de metástases linfáticas em carcinoma pulmonar (Liu et al., 2011), em câncer gástrico a expressão elevada de fascina se correlacionou com um pior prognóstico (Hashimoto et al., 2004; Li et al., 2008; Kim et al., 2012) e em câncer intestinal, Gu e colaboradores (2012) demonstraram que a expressão de fascina se correlaciona com a diminuição de sobrevida, sendo um fator independente de prognóstico. No presente estudo, a expressão imuno-histoquímica de fascina não mostrou associação significativa com os parâmetros clínico-patológicos dos CECs orais, estando em desacordo com os resultados encontrados por Lee e colaboradores (2007) que encontraram uma relação entre a expressão de fascina, metástase linfonodal e recorrência e diferindo também dos resultados de Alam e colaboradores (2012) que observaram uma relação da imuno-expressão de fascina com o tamanho tumoral, presença de metástase linfonodal, diferenciação tumoral e taxa de recorrência. Em nosso estudo, a expressão aumentada de

fascina mostrou correlação com uma menor sobrevida global e sobrevida específica da doença nos pacientes com CEC oral, sendo essa relação confirmada na análise multivariada pelo método de regressão de Cox. Fascina demonstrou, dessa maneira, ser um marcador independente para sobrevida global reduzida e sobrevida específica da doença. Nossos resultados estão de acordo com os achados de Lee e colaboradores (2007), que também encontraram uma relação positiva entre a expressão de fascina e a sobrevida global em pacientes com CEC oral. Similarmente, Alam e colaboradores (2012) observaram uma correlação entre a superexpressão de fascina e diminuição na sobrevida dos pacientes com CEC oral.

Nossos resultados sugerem que a superexpressão de fascina está relacionada à progressão do CEC oral, sendo a fascina um possível marcador prognóstico independente de sobrevida global e específica da doença. Como o exato papel da fascina no comportamento do CEC oral é parcialmente conhecido, nós optamos em realizar os ensaios funcionais para verificar o papel da fascina na adesão, migração e invasão celular. As linhagens HSC-3 e SCC-15 foram escolhidas para os ensaios funcionais neste estudo devido à alta expressão de fascina e por apresentaram diferentes potenciais de migração e invasão. Os níveis elevados de produção de fascina nas linhagens celulares escolhidas foram confirmados por western blot. Para realizar os ensaios funcionais, os níveis de expressão de fascina foram neutralizados por meio da expressão de um shRNA contra o mRNA de interesse, e como controle, utilizamos uma sequência de shRNA incapaz de modular a expressão de genes conhecidos.

A fascina desempenha um papel importante na adesão e motilidade celular. Tem sido demonstrado que a adesão celular às macromoléculas específicas da matriz extracelular é capaz de regular a distribuição de fascina e a formação de microspikes (Adams et al.,1999; Adams, 2004). Na fibronectina, as projeções ricas em fascina são formadas inicialmente de forma transitória e logo após a adesão inicial, são rapidamente perdidas e as células epiteliais adotam uma morfologia poligonal. A fascina se mostra então, uniformemente difusa na

célula. A adesão à fibronectina é mediada por integrinas e pela fosforilação de proteína quinase C dependente de fascina na serina 39, regulando negativamente a capacidade da fascina em agregar actina (Ono et al., 1997; Adams et al.,1999). A modulação da atividade agregadora de actina da fascina por meio da fosforilação parece ser um passo obrigatório e importante para a adesão celular e adesão focal a fibronectina (Adams et al.,1999; Adams, 2004). Chen et al. (2009) demonstraram que a neutralização de fascina em linhagens de CEC oral foi capaz de levar a um aumento na adesão celular. Em carcinoma de bexiga, a neutralização de fascina também levou à um aumento na adesão das células tumorais. Nossos resultados estão de acordo com os anteriores, demonstrando um aumento na adesão das linhagens celulares HSC-3 e SCC-15 à fibronectina pela neutralização de fascina. Uma característica importante da superexpressão de fascina é a formação aumentada de projeções celulares que contribuem para a motilidade celular, além de alterar a estrutura das adesões focais (Hwang et al., 2008; Bi et al., 2013). A depleção de fascina leva à diminuição no número de filopodes e à alteração na morfologia das protrusões, diminuindo a migração (Bi et al., 2013). Alguns estudos têm demonstrado que a fascina contribui para a organização principalmente de duas estruturas ricas em actina: protrusões celulares corticais que mediam as interações celulares e a migração, e os feixes de microfilamentos citoplasmáticos que contribuem para a arquitetura celular e movimentos intracelulares (Adams, 2004). A formação de protrusões ricas em fascina é estreitamente correlacionada com a migração celular por estímulo fisiológico, sendo a fascina importante para a funcionalidade dessas protrusões durante a migração celular, o que poderia explicar o porquê da superexpressão de fascina aumentar a motilidade das células tumorais (Adams, 2004; Hashimoto et al., 2011).

A inibição de fascina em linhagens celulares de CEC oral diminuiu as protrusões celulares e resultou em uma diminuição na migração e invasão celular (Chen et al., 2009). O presente estudo está de acordo com esses achados, demonstrando um declínio no potencial de migração e invasão nas linhagens

celulares de CEC oral HSC-3 e SCC-15 silenciadas para fascina. Adicionalmente, Alam e colaboradores (2012) demonstraram que linhagens de CEC oral superexpressando fascina apresentaram um aumento na migração e invasão celular, além de apresentarem um aumento na atividade de MMP-2. Hashimoto e colaboradores (2007) demonstraram em um modelo animal com células de carcinoma de cólon que a neutralização de fascina foi capaz de promover uma diminuição significativa no crescimento, desenvolvimento e invasão tumoral. Utilizando de metodologia similar, Vignjevic e colaboradores (2007) obtiveram os mesmos resultados. Esse mesmo estudo mostrou ainda que a superexpressão de fascina foi capaz de aumentar a migração e invasão nos experimentos celulares in vitro. Bi e colaboradores (2013) demonstraram que em células de câncer de bexiga, a depleção de fascina foi capaz de diminuir a migração e a invasão das células tumorais. Nós realizamos ainda o ensaio de invasão celular com as linhagens HSC-3 e SCC-15, utilizando um modelo organotípico em miomas uterinos (Nurmenniemi et al., 2009), que se assemelha ao ambiente tumoral. Nesse ensaio, apesar de todas as linhagens (parentais, controles e silenciadas) terem sido capazes de invadir os tecidos do mioma, não encontramos diferenças no potencial invasivo das linhagens HSC-3 e SCC-15 silenciadas para fascina. Isso pode ser explicado pelas diferenças encontradas entre os miomas, apesar dos discos serem obtidos de um único exemplar, ainda assim o material biológico pode apresentar diferenças que levam a variações nos resultados. Além disso esse ensaio foi realizado uma única vez em triplicata, sendo necessário, mais repetições para confirmar os resultados obtidos.

A plectina assim como a fascina também se mostrou mais expressa nas amostras de CEC oral em comparação às amostras de mucosa oral normal analisadas por meio de imuno-histoquímica e qRT-PCR. Plectina também demonstrou uma expressão aumentada nas linhagens de CEC oral em comparação à linhagem de queratinócitos não-tumorigênicos. A marcação imuno- histoquímica para plectina foi similar ao padrão de marcação demonstrado pela fascina, sendo restrita às células da camada basal e suprabasal no epitélio oral

normal e uma marcação mais difusa nas ilhas tumorais, além de demonstrar positividade para algumas células endoteliais e inflamatórias. Esta observação é semelhante ao relatado em outros estudos. Katada e colaboradores (2012) demonstraram uma maior expressão imuno-histoquímica de plectina no CEC oral em comparação à mucosa normal. Com um padrão de marcação citoplasmático, Bausch e colaboradores (2011) também demonstraram maior expressão de plectina em carcinoma pancreático, com plectina apresentando uma marcação citoplasmática e mostrando ainda uma marcação neural. Além disso, plectina foi descrita superexpressa em células de carcinoma colorretal (Lee et al., 2004).

Bausch e colaboradores (2009), em uma análise por imuno- histoquímica, demonstraram que a plectina é menos expressa em displasias leve e moderada em comparação à displasia intensa e carcinoma mucinoso intraductal pancreático e apresentava também maior expressão nos linfonodos. Em 2011, Bausch e colaboradores também demonstraram que a expressão de plectina aumenta durante a carcinogênese no câncer pancreático, mostrando-se ausente no tecido benigno, sendo ausente ou com baixa expressão nas lesões precursoras PanIN I/II, mostrando maior expressão nas lesões precursoras PanIN III e nas lesões metastáticas. Nossos resultados demonstraram que plectina apresenta maiores níveis de expressão no CEC em comparação às hiperplasias fibrosas com epitélio oral normal e displasias. No entanto, a expressão de plectina não foi diferente entre as displasias (independente da graduação) e as hiperplasias fibrosas. Interessantemente, estudos prévios utilizando câncer pancreático