Priscila Campioni Rodrigues
“Análise dos efeitos biológicos associados a fascina e plectina no carcinoma espinocelular oral”
PIRACICABA 2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
Priscila Campioni Rodrigues
“Análise dos efeitos biológicos associados a fascina e plectina no carcinoma
espinocelular oral”
Tese de doutorado apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas para obtenção do título de Doutora em Estomatopatologia, área de concentração em Patologia.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Della Coletta Co-orientadora: Profa. Dra. Tuula Anneli Salo
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA
PELA ALUNA PRISCILA CAMPIONI RODRIGUES
E ORIENTADA PELO PROF DR RICARDO DELLA COLETTA
__________________________________ Assinatura do orientador
PIRACICABA 2015
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Agência de fomento: Capes Nº processo: 0
Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba Marilene Girello - CRB 8/6159
Rodrigues, Priscila Campioni,
R618a RodAnálise dos efeitos biológicos associados a fascina e plectina no
carcinoma espinocelular oral / Priscila Campioni Rodrigues. – Piracicaba, SP : [s.n.], 2015.
RodOrientador: Ricardo Della Coletta. RodCoorientador: Tuula Anneli Salo.
RodTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
Rod1. Plectina. I. Della Coletta, Ricardo,1972-. II. Salo, Tuula Anneli. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Analysis of biological effects related to fascin and plectin on oral squamous cell carcinoma
Palavras-chave em inglês: Plectin
Área de concentração: Patologia Titulação: Doutora em Estomatopatologia Banca examinadora:
Ricardo Della Coletta [Orientador] Fabricio Passador-Santos
Cyntia Helena Pereira de Carvalho Marcelo Rocha Marques
Márcia Cristina da Costa Miguel Data de defesa: 25-08-2015
Resumo
Fascina e plectina são proteínas estruturais e funcionais do citoesqueleto com atividades envolvidas na modulação da motilidade celular. Embora a expressão alterada destas proteínas tenha sido descrita em alguns tipos de câncer, sendo consideradas como possíveis biomarcadores tumorais, estudos avaliando a contribuição de fascina e plectina no carcinoma espinocelular (CEC) oral são escassos. Em estudo prévio, nós demonstramos que os níveis de fascina e plectina foram significantemente maiores no CEC oral em comparação com tecido oral normal. O objetivo deste estudo foi compreender o papel de fascina e plectina na tumorigênese oral. Visando esse objetivo, 1) nós inicialmente confirmamos a superexpressão de fascina e plectina em linhagens celulares e amostras tumorais em comparação à tecidos normais por qRT-PCR e imuno-histoquímica, 2) analisamos a expressão imuno-histoquímica de fascina e plectina em amostras orais que caracterizam a evolução histopatológica do CEC oral, 3) realizamos a análise da distribuição imuno-histoquímica dessas proteínas em 113 amostras de CEC oral e correlacionamos com as características clínico-patológicas, de recorrência e sobrevida dos pacientes e 4) neutralizamos estavelmente a expressão da fascina nas linhagens celulares derivadas de CEC oral SCC-15 e HSC-3 e realizamos ensaios de adesão, migração e invasão celular. Nossos resultados confirmaram que a expressão de fascina e plectina são significantemente maiores no CEC oral em comparação com a mucosa oral normal (fascina p<0,0001; plectina p<0,0001). Em linhagens celulares, as expressões de fascina e plectina foram também significantemente maiores em células de CEC oral em comparação a linhagem de queratinócitos não-tumorigênicos (fascina p<0,0001 para SCC-4, SCC-9, SCC-25, SCC-9 ZsGreen LN-1, SCC-9 e HSC-3 e p<0,001 para ZsGreen LN-2 e plectina p<0,0001 para SCC-4, SCC-15, SCC-25, SCC-9 ZsGreen LN-1, SCC-9 ZsGreen LN-2 e p<0,001 para SCC-9 e HSC3). Quanto à progressão do CEC oral, fascina demonstrou uma expressão significantemente maior nas amostras de displasia e CEC quando comparada com o grupo das hiperplasias fibrosas com epitélio normal (p<0,0001),
enquanto que a expressão de plectina foi significantemente maior nos CECs em comparação as hiperplasias fibrosas e displasias (p<0,0001), mas não entre as hiperplasias fibrosas e displasias. A superexpressão de fascina foi associada com um pior prognóstico, como revelado por uma menor sobrevida global (p=0,0005) e sobrevida específica (p=0,001). A neutralização de fascina nas linhagens derivadas de CEC oral foi capaz de aumentar significantemente a adesão à fibronectina (HSC-3 p<0,0001 e SCC-15 p<0,0001), diminuir a migração (HSC-3 p<0,0001 e SCC-15 p p<0,0001) e a invasão celular em ambas as linhagens(HSC-3 p<0,0001 e SCC-15 p p<0,0001) quando comparadas aos controles. Em conclusão, os resultados deste estudo sugerem que a proteína fascina é um marcador prognóstico independente para sobrevida global e sobrevida específica da doença em pacientes com CEC oral e revelam que fascina é capaz de regular eventos importantes para o desenvolvimento e progressão do CEC oral. Embora a expressão de plectina tenha sido maior em CEC oral comparado com mucosa oral normal, nenhuma correlação com sobrevida foi observada.
Abstract
Fascin and plectin are structural and functional proteins of the cytoskeleton with activities involved in cell motility. Although the expression of these proteins has been described in some cancers, being considered as potential tumor biomarkers, studies evaluating the contribution of fascin and plectin in oral squamous cell carcinoma (OSCC) are limitted. In a previous study, we demonstrated that the levels of fascin and plectin are significantly higher in OSCCs compared to normal oral tissues. The aim of this study was to characterize the role of fascin and plectin in oral tumorigenesis. To achive this purpose: 1) we initially confirmed the overexpression of fascin and plectin in cell lines and oral samples of normal and tumor tissues!by qRT-PCR and immunohistochemistry, 2) we analyzed the immunohistochemical expression of fascin and plectin in oral samples featuring the histopathological evolution of OSCC 3) we performed the analysis of those proteins in 113 OSCCs and correlated with the clinical and pathological features, recurrence and survival of patients, and 4) we stably neutralized the expression of fascin in OSCC cell lines SCC-15 and HSC-3 and performed adhesion, cell migration and invasion assays.!Our results confirmed that the expressions of fascin and plectin are significantly higher in OSCC compared to normal oral mucosa. In cell lines, fascin and plectin expression was also significantly higher in OSCC cells compared with non-tumorigenic keratinocytes. Regarding OSCC progression, fascin showed a significantly higher expression in dysplasia and OSCC samples compared to fibrous hyperplasia containing normal oral epithelium, whereas plectin immunoexpresion was higher in OSCCs compared to fibrous hyperplasia and samples with dysplasia but not between fibrous hyperplasia and samples with dysplasia. The overexpression of fascin was associated with worse prognosis, as revealed by shortened overall survival and disease-specific survival. Fascin silencing in cell lines derived from OSCC increased significantly the adhesion to fibronectin and decreased cell migration and invasion in both cell lines when compared to controls. In conclusion, the results of this study suggest that fascin is an independent prognostic marker for overall survival and disease-specific survival
in patients with OSCC and reveal that fascin regulate important events associated with OSCC development and progression. Although plectin expression was higher in OSCCs compared to normal oral mucosa, no correlation with survival was observed.
Keywords: migration, invasion, adhesion, cancer, biomarkers, prognosis
SUMÁRIO
Dedicatória xiii Agradecimentos xv Epígrafe xix 1 INTRODUÇÃO 1 2 REVISÃO DA LITERATURA 52.1 Carcinoma espinocelular (CEC) 5
2.2 Fascina 11
2.3 Plectina 17
3 PROPOSIÇÃO 23
4 MATERIAL E MÉTODOS 25
4.1 Aprovação do Comitê de Ética 25
4.2 Amostras 25
4.3 Reação Imuno-histoquímica 27
4.3.1 Análise da Marcação Imuno-histoquímica 27
4.4 Cultura de Células 28
4.5 Análise da Expressão Gênica por RT-PCR Quantitativo (qR-PCR) 29
4.5.1 Isolamento do RNA total 29
4.5.2 Síntese de cDNA 29
4.5.3 qRT-PCR 29
4.6 Transdução das Linhagens Celulares HSC3 e SCC15 com Partículas
Lentivirais 30
4.6.1 Western Blot 31
4.6.2 Ensaio de Adesão Celular 32
4.6.3 Ensaio de Migração Celular em Sistema Transwell® 32
4.6.4 Ensaio de Migração Celular Horizontal (“Wound Healing”) 33
4.6.6 Ensaio de Invasão Celular em Modelo Organotípico de Mioma Uterino 34
4.7 Análise Estatística 35
5 RESULTADOS 37
5.1 Espectrometria de massas 37
5.2 Validação da superexpressão de fascina e plectina em CECs orais 38 5.3 Análise da expressão de fascina e plectina em amostras orais frescas de
mucosa normal e de CEC 42
5.4 Análise das expressões de fascina e plectina em linhagens celulares de
queratinócitos não-tumorigênicos e CEC oral 43
5.5 Avaliação da expressão de fascina e plectina em amostras orais que
caracterizam a evolução histopatológica do CEC oral 45 5.6 Correlação da expressão de fascina e plectina com as variáveis clínico-patológicas, de recorrência e de sobrevida dos pacientes com CEC oral 47 5.7 Efeitos da fascina na adesão, migração e invasão das células de câncer oral
57 6 DISCUSSÃO 69 7 CONCLUSÃO 77 REFERÊNCIAS* 79 Anexo 1 109 !
Dedicatória
Dedico este trabalho à minha família por compartilharem meus sonhos, apoiarem minhas escolhas e não medirem esforços para que eu conquiste meus ideais.
Agradecimentos
À Universidade Estadual de Campinas, por meio do Reitor Professor Doutor José Tadeu Jorge, à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, por meio de seu diretor, Professor Doutor Guilherme Elias
Pessanha Neto.
À Professora Doutora Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora da Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas pela dedicação aos alunos de pós-graduação.
Ao Professor Doutor Alan Roger dos Santos Silva, coordenador do Programa de Pós-Graduação em Estomatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas por toda a disponibilidade e oportunidades.
Ao meu orientador Professor Doutor Ricardo Della Colleta, meu mais sincero agracimento pela paciência e confiança a mim depositadas. Por todo o
conhecimento a mim passado, por despertar em mim o interesse e paixão pela pesquisa e por todas as oportunidades a mim concedidas. És um exemplo de dedicação à pesquisa e tem todo o meu respeito e admiração.
À minha co-orientadora Professora Doutora Tuula Salo, que me recebeu carinhosamente na Universidade de Oulu. Agradeço também pela amizade, carinho, apoio e oportunidades. Muito obrigada! ( To my co-supervisor Professor Tuula Salo, which kindly welcomed me at!University of Oulu. I also thank for the friendship, care, support and the oppotyunities. Thank you so much!)
Aos Professores Doutrores da área de Estomatopatologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Ricardo Della Coletta, Alan Roger dos Santos Silva, Edgard Graner, Pablo Vargas Oslei Paes de Almeida, Mario Ajudarte Lopes e Jacks Jorge Júnior por todos os ensinamentos e exemplos de profissionalismo.
Aos profissionais do Laboratório de Patologia Oral da Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, Adriano Luís Martins, Emílo Salles, João Carlos da Silva Júnior, Fábio Haach Téo pelo suporte, atenção e carinho. E especialmente à Fabiana Facco Casarotti por toda a ajuda prestada, conversas e conhecimentos divididos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pelo apoio financeiro para a realização desse estudo, por meio das bolsas de estudos a mim concedida.
Aos amigos do laboratório Ana Camila, Andréia Silva, Carolina, Estêvão, Fernanda, Florence, Luciana, Marco Antônio, Maurício, Elizabete, Rebeca e Renato por todos os momentos compartilhados e por toda a ajuda.
Aos pós-graduandos do curso de Estomatopatologia Alicia, Ana Carolina, Camilla, Celeste, Ciro, Débora, Diego, Felipe, Harim, José Laurentino, Juscelino, Karina, Leonardo, Marcondes, Marco Aurélio, Mariana, Marisol, Priscilla, Raiza, Renata, Rodrigo, Sabrina, Vinícius e Wagner pela ótima convivência em Piracicaba.
À Carine Ervolino de Oliveira e à Nilva Cervigne, pelos momentos divididos, conversas, conselhos e ajuda. Meu muito obrigada!
Aos amigos do Programa de pós graduação em Estomatopatologia: Alicia Rumayor Piña, Fernanda Moreira, Harim Dos Santos, Karina Morais, Katya Díaz, Luciana Yamamoto De Almeida, Estêvão Azevedo Melo, José Laurentino Ferreira Filho, Juscelino De Freitas Jardim, Nathalia Caroline De Souza Lima, Renato Assis Machado, Rodrigo Neves Silva, Wagner Gomes Da Silva, Ana Carolina Amorim Pellicioli, Marcondes Sena Filho.
Aos meus amigos e profissionais da Universidade de Oulu: Professora Tuula, Professor Leo, Carolina, Emma, Pirjo, Maija, Mallu, Virve, Ehsan, Meeri, Krista e Tanja. Obrigada pelo carinho e acolhida! (To my friends and professionals from
University of Oulu: Professor Tuula, Professor Leo, Carolina, Emma, Johanna, Pirjo, Maija, Mallu, Virve, Eshan, Meeri, Krista and Tanja.Thank you for the kindness and the warm welcome!)
Aos meus pais José Luís Rahme Rodrigues e Lucila Campioni Rodrigues por sempre estarem presentes e apoiarem incondicionalmente todas as minhas ecolhas. Amo muito vocês!
Aos meus irmãos e amigos Karina Campioni Rodrigues e Eduardo Campioni Rodrigues por todos os momentos em família, por todo o carinho e cumplicidade. Amo vocês!
Aos meus cunhados Marina Corteccioni e Tiago Anibal por estarem presentes em todos os momentos. Obrigada!
Ao meu avô Lucilo e minha avó Neuza e ao meu avô Luiz e minha avó Maria Helena (in memorian), pelo exemplo de família.
Ao meu namorado Hirley Alves, pelo amor, paciência e carinho. Seu apoio foi essencial nessa caminhada. Obrigada por ser meu porto seguro. Amo você.
Aos meus amigos Carolina Bitu, Pedro e Amandinha, por serem minha família em Oulu e pelos muitos momentos compartilhados. Obrigada por sempre estarem presentes.
Às minhas amigas desde o colégio, Fernanda Miranda Machado e Maria Paula Giovaninni, por todos os momentos dividido durante esses muitos anos de amizade. Obrigada por todo o apoio e torcida. Vocês sempre terão um lugar no meu coração.
Aos meus amigos desde a graduação Karina Matheus, Antônio Pedro, Luciana Berto, Débora Suzigan, Paulinha Tomé, Débora Bastos por sempre estarem estarem presente. Agradeço pela amizade!
Às minhas amigas Camila Batista, Lívia, Carolina Bosso, Bruna Fronza e Thaylla Hellen por serem minha família piracicabana. Obrigada pelo apoio, carinho, risadas, momentos de desabafos, convivência e cumplicidade.
À todos que direta ou indiretamente participaram de alguma forma no desenvolvimento dessa pesquisa.
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Epígrafe
“Cada passo que dás é necessário para chegar ao local que escolheste."
1 INTRODUÇÃO
O carcinoma espinocelular (CEC) oral corresponde à cerca de 95% das lesões malignas que ocorrem na cavidade oral (Scully & Bagan, 2009, O'Callaghan et al., 2015). Apesar dos avanços terapêuticos, as taxas de sobrevida dos pacientes com CEC oral continuam desanimadoras (Shah et al., 2011; Bitu et al., 2012; Noguti et al., 2012). Esse baixo índice de sobrevida é principalmente associado ao diagnóstico tardio da doença, colocando a prevenção e o diagnóstico precoce como importantes desafios para os pesquisadores que estudam a doença (Scully & Bagan, 2009). Em adição, a falta de biomarcadores de prognóstico contribui de maneira expressiva para este cenário ruim. Apesar de várias características moleculares e histopatológicas terem sido propostas como fatores prognósticos para o CEC oral, nada é ainda utilizado rotineiramente na clínica. O tradicional sistema de estadiamento clínico do paciente (sistema TNM) continua a ser o principal fator utilizado para decidir o manejo e o prognóstico do paciente com CEC oral. No entanto, esse sistema muitas vezes apresenta limitações, tendo em vista que pacientes com o mesmo estadio da doença podem apresentar evolução clínica e tempo de sobrevida distintos (Dissanayaka et al., 2012). A busca por biomarcadores é necessária para melhor compreender o comportamento biológico do CEC oral, monitorar a doença e predizer o prognóstico dos pacientes, bem como para o planejamento de novas estratégias de tratamento (Shah et al., 2011), alterando assim este cenário ruim.
A fascina e a plectina são proteínas do citoesqueleto celular e desempenham atividades relacionadas ao desenvolvimento e/ou progressão tumoral, principalmente no que diz respeito à motilidade celular. A fascina é uma proteína de 55 kDa com função de agregar filamentos de actina, sendo fundamental para a formação de uma vasta gama de protrusões celulares, incluindo as microspikes, filopodia e invadopodia, além de ser importante para a funcionalidade dessas protrusões durante a migração celular (Adams, 2015; Tümer et al., 2015). As interações entre fascina e actina são reguladas pela matriz
extracelular e outras proteínas de ligação (Adams, 2004; Ma & Machesky, 2014). Em tecidos humanos adultos, fascina é expressa principalmente em células endoteliais vasculares, neurônios, fibroblastos e células dendríticas e está ausente ou em baixa expressão em células epiteliais normais (Zhang et al., 2008; Jayo & Parsons, 2010). A expressão aumentada de fascina tem sido demonstrada em uma série de tumores, incluindo os de cólon, mama, pâncreas, pulmão, esôfago, estômago, laringe, pele e ovário e, de maneira geral, a expressão correlaciona com a agressividade do tumor (Jayo & Parsons, 2010).
A plectina é uma proteína de 500 kDa membro da família das plaquinas, um grupo de proteínas do citoesqueleto celular que desempenham um papel crucial na manutenção da estrutura e integridade celular e tecidual (Rezniczek et al., 2010; Winter & Wiche, 2013). Plectina é expressa em uma grande variedade de células e tecidos, principalmente em tecidos expostos à estresse mecânico, como os tecidos musculares e epiteliais (Castañón et al., 2013). Nas células epiteliais associa-se as junções celulares do tipo hemidesmossomos, desmossomos e adesões focais (Litjens et al., 2003). Nas células se localiza na superfície intracelular da membrana plasmática, nos sítios de fixação dos filamentos intermediários (FI), microtúbulos e microfilamentos (Wiche, 1998; Wiche & Winter, 2011). Defeitos no gene da plectina têm sido relacionados ao desenvolvimento de múltiplas doenças, sendo a epidermólise bolhosa simples a mais comum entre elas (Gache et al., 1996; Winter & Wiche, 2013). A plectina possui funções fundamentais para o citoesqueleto, no que tange às propriedades mecânicas e a sua dinâmica, sendo frequentemente associada a tumorigênese (Osmanagic-Myer et al., 2006). A superexpressão de plectina tem sido relatada em vários tipos de tumores epiteliais, como o carcinoma de hipofaringe, pâncreas, colo e reto, esofago (Castañón et al., 2013) e cavidade oral (Katada et al., 2012). Além disso, tem se sugerido que plectina seja um biomarcador para o prognóstico do câncer de pâncreas (Bausch et al., 2009).
Embora a expressão aumentada de fascina e plectina tenha sido descrita em uma variedade de carcinomas, há uma escassez de estudos que
avaliam o papel biológico destas proteínas no desenvolvimento do CEC oral. Lee e colaboradores (2007) foram os primeiros a demonstrarem uma expressão aumentada de fascina no CEC oral, e poucos estudos subsequentes revelaram que a superexpressão de fascina correlacionou com parâmetros clínico-patológicos relacionados a um pior prognóstico (Shimamura et al., 2011; Alam et al., 2012). A superexpressão de plectina em CEC oral foi inicialmente demonstrada por Katada et al. (2012). Esses autores demonstraram ainda uma correlação entre a expressão de plectina e metástase à distância, um evento pouco frequente no câncer oral. Em um estudo prévio, 10 pares de amostras orais de mucosa histologicamente normal (tecido adjacente ao tumor) e CEC foram microdissecadas a laser e submetidas a espectrometria de massa associada a cromatografia líquida. Com uma taxa de falso-positivo de 1%, 107 proteínas foram identificadas como superexpressas no tecido tumoral em relação ao tecido normal, com destaque para fascina e plectina (Flores, 2013).
Levando-se em conta o reduzido número de estudos que avaliaram o papel biológico da fascina e plectina em CECs orais, os objetivos deste estudo foram validar a expressão de fascina e plectina em amostras de CEC oral, verificar a expressão dessas proteínas nas lesões que caracterizam a evolução histológica do CEC oral, avaliar a correlação da expressão de plectina e fascina com os parâmetros clínicos-patológicos e sobrevida dos pacientes com CEC oral e verificar o efeito da neutralização de fascina nos fenótipos associados à tumorigênese do CEC oral, incluindo adesão, migração e invasão.
2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Carcinoma espinocelular (CEC)
O CEC, também denominado de carcinoma de células escamosas ou carcinoma epidermóide, é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo (Alam et al., 2012; Deboni et al., 2012; O'Callaghan et al., 2015). No Brasil, representa a quinta neoplasia mais comum no sexo masculino e a décima primeira no sexo feminino com uma estimativa de 15.290 casos novos para o ano de 2015 (Instituto Nacional do Câncer-INCA, 2014). O CEC oral corresponde à cerca de 95% das neoplasias malignas que ocorrem na cavidade bucal e tem sua origem a partir de células malignas derivadas do epitélio pavimentoso estratificado (Sculy & Bagan, 2009). No entanto, outras lesões malignas também podem ocorrer nessa localidade, como neoplasias de glândulas salivares, tumores odontogênicos malignos, sarcomas, neoplasias hematopoiéticas e tumores metastáticos (Scully & Porter, 2001; Daley & Darling, 2003).
O CEC oral apresenta uma alta taxa de mortalidade e morbidade, pois o diagnóstico é frequentemente realizado tardiamente, devido à sua progressão assintomática até os estágios avançados da doença, sendo considerado um problema de saúde pública (Parkin et al., 2005; Vargas-Ferreira et al., 2012; O'Callaghan et al., 2015). Usualmente o CEC oral acomete homens entre a quinta e sexta décadas de vida, fumantes e etilistas de longa duração (Gervásio et al., 2001; Scully & Felix, 2006; Sturgis & Cinciripini, 2007; Petti, 2009; Johnson et al., 2011; Santos-Silva et al., 2011; Vargas-Ferreira et al., 2012). Porém, uma mudança nesse perfil tem sido observada, com um aumento no número de casos de CEC oral em pacientes com idade inferior a 40 anos, do sexo feminino e com associação limitada aos fatores de risco tradicionais (Kuriakose et al., 1992; Mackenzie et al., 2000; Llewellyn et al., 2001; Barnes et al., 2005; Ribeiro et al., 2009; Falaki et al., 2010; Soudry et al., 2010; Santos-Silva et al., 2011; Túri et al., 2013). Esta alteração no perfil dos pacientes vem gerando um impacto significativo na epidemiologia do CEC oral no que diz respeito aos novos possíveis fatores de
risco para o desenvolvimento dessa neoplasia, como predisposição ou instabilidade genética (Westra, 2009; Santos-Silva et al., 2011). A língua é a localização mais comum para o câncer de boca e juntamente com o assoalho bucal somam mais da metade dos cânceres orais excluindo aqueles que afetam lábios (Bello et al., 2010).
O CEC oral apresenta uma etiologia multifatorial, sendo o tabaco e o álcool os principais fatores de risco para o seu desenvolvimento (Scully et al., 2000; Das & Nagpal, 2002; Gandini et al., 2008; Hoffmannová et al., 2010; Anantharaman et al., 2014). A exposição aos carcinógenos presentes no álcool e no tabaco apresenta uma relação dose/tempo dependente (Scully et al., 2000; Bsoul et al., 2005; Hoffmannová et al., 2010) e a combinação desses dois fatores aumenta significativamente o risco para o desenvolvimento do CEC oral (Brown et al., 2012). O tabaco é de longe o principal fator de risco para o desenvolvimento do CEC oral e esse fato é válido não apenas para o tabaco convencional, mas também para o consumo do tabaco sem fumaça, ainda que em menor grau (Vigneswaran et al., 1995; Johnson, 2001; Vallecillo Capilla et al., 2007; Warnakulasuriya & Ralhan, 2007; Boffetta et al., 2008; Gandini, 2008; Hirota et al., 2008). O álcool não é diretamente um agente carcinogênico, porém o seu metabolismo leva a liberação de acetaldeído, seu principal metabólito, que apresenta efeitos genotóxicos. Além disso, o sinergismo do álcool com o tabaco promove um aumento na permeabilidade da mucosa oral, agindo como um solvente para os carcinógenos presentes no tabaco (Scully et al., 2000; Pöschl & Seitz, 2004; Boffeta & Hashibe, 2006, Goldstein et al., 2010; Feller et al., 2013). O consumo do tabaco associado ao álcool é capaz de aumentar em 20 vezes o risco para o desenvolvimento de recidivas ou segundos tumores primários na cavidade oral ou trato aerodigestivo, principalmente quando o consumo é mantido após o diagnóstico do tumor primário (Carvalho et al., 2004; Leston & Dios, 2010). O consumo de tabaco e álcool, além de serem importantes fatores de risco para o desenvolvimento do CEC oral, são também associados como um dos principais
fatores capazes de interferir no prognóstico da doença (Kantola et al., 2000; Aguiar et al., 2007; Rodrigues et al., 2014).
Nos casos de CEC do lábio inferior, a exposição crônica à radiação solar, principalmente os raios ultravioletas, é o principal fator etiológico associado. Os raios ultravioletas provocam alterações no DNA pela formação de dímeros de pirimidina e supressão imunológica (Busick et al., 2005; Cotran & Kumar, 2005; Vieira et al., 2012). A associação do desenvolvimento do CEC oral com outros fatores de risco tem sido sugerida, tais como o estado sistêmico do paciente incluindo desnutrição, anemia ferropriva e deficiência de algumas vitaminas (McDowell, 2006), o baixo nível socioeconômico associado à uma higiene oral precária (Hoffmannová et al., 2010; Carnelio et al., 2011) e, mais atualmente, o papiloma vírus humano (HPV) (Feller et al., 2010; Gogilashvili et al., 2012). No entanto, a implicação desses fatores de risco para o desenvolvimento do CEC oral ainda é controversa. Existe ainda uma minoria de pacientes que desenvolvem CEC oral sem apresentar nenhum dos fatores de risco citados (Johnson, 2001).
As lesões clínicas do CEC oral podem ter origem a partir da mucosa oral aparentemente normal sem associação a lesões prévias ou se desenvolver a partir de uma série de estágios clínico-patológicos, evoluindo de uma hiperplasia benigna, para uma displasia epitelial, então para um carcinoma in situ e deste para um carcinoma potencialmente invasivo (Shah et al., 2011). Clinicamente esta evolução pode ser observada pela presença de lesões potencialmente malignas previamente ao surgimento do CEC oral, que consistem principalmente de manchas brancas (leucoplasia) ou vermelhas (eritroplasia). A taxa de transformação maligna é superior a 15% para as leucoplasias e quase 100% para as eritoplasias (Vered et al., 2007). Alguns fatores como tabagismo e consumo de bebidas alcoólicas, localização da lesão e apresentação clínica estão associados ao risco de transformação das lesões potencialmente malignas orais, contudo a presença de displasia epitelial tem se mostrado como o principal fator (Reibel, 2003).
de acordo com o grau de envolvimento epitelial (Barnes et al., 2005; Speight, 2007). A displasia leve apresenta proliferação ou hiperplasia das células das camadas basal e parabasal que não se estendem além do terço inferior do epitélio. A atipia celular, caracterizada pelo pleomorfismo celular ou nuclear, é geralmente leve. Mitoses não são proeminentes e quando presentes são frequentemente localizadas basalmente e são normais. Em geral, as alterações arquiteturais são mínimas (Barnes et al., 2005; Speight, 2007). A displasia moderada apresenta proliferação de células atípicas se estendendo até o terço médio do epitélio. A atipia celular é mais intensa que na displasia leve e as alterações como hipercromatismo e pleomorfismo celular e nuclear proeminentes podem ser observadas. Mitoses atípicas podem estar presentes, mas são usualmente localizadas na camada basal. As alterações arquiteturais podem ser observadas na metade inferior do epitélio e são caracterizadas por perda de polaridade e hiperplasia, levando a um padrão de cristas epiteliais bulbosas. No entanto, a estratificação e maturação são relativamente normais (Barnes et al., 2005; Speight, 2007). Na displasia intensa há uma proliferação anormal a partir da camada basal para o terço superior do epitélio. As alterações citológicas e arquiteturais são proeminentes. A displasia intensa é caracterizada por um marcado pleomorfismos celular e nuclear e nucléolos múltiplos e proeminentes. Mitoses atípicas e corpos apoptóticos podem ser proeminentes. As alterações arquiteturais são intensas, frequentemente com perda completa de estratificação e queratinização intensa, até mesmo com formação de pérolas de queratina. A presença de cristas epiteliais bulbosas é uma particularidade importante para o diagnóstico das displasias intensas (Barnes et al., 2005; Speight, 2007).
Clinicamente, o CEC oral pode se apresentar como uma massa exofítica com ou sem ulceração, uma lesão branca (leucoplásica), avermelhada (eritroplásica) ou eritro-leucoplásica (Cotrim et al., 2001; Regezi & Sciubba, 2000). Embora a apresentação clínica dos CECs orais seja variável, o aspecto mais comumente encontrado no momento do diagnóstico é o de uma lesão ulcerada com bordas elevadas e necrose central presente na cavidade bucal por um longo
período de tempo (Neville et al., 2009; Pontes et al., 2012). O CEC oral apresenta um curso clínico variável, por essa razão o diagnóstico geralmente é tardio o que contribui para o crescimento e a disseminação do tumor, acarretando em piora no prognóstico do paciente levando a uma taxa de sobrevida global entre 50-60% em 5 anos (Scully & Bagan, 2009; Warnakulasuriya, 2009; Shah et al., 2011, Bitu et al., 2012).
Microscopicamente, as lesões de CEC oral apresentam como característica uma proliferação epitelial com células pleomórficas de núcleos hipercromáticos, nucéolos evidentes e figuras mitóticas atípicas. A proliferação epitelial mostra com frequência um padrão invasivo ao tecido conjuntivo subjacente, formando ilhas ou ninhos de células epiteliais malignas (Regezi & Sciubba, 2000). A graduação histopatológica dos tumores é feita baseada no grau em que esses tumores se assemelham ao seu tecido de origem (epitélio escamoso) e no grau de produção de queratina. De acordo com a graduação histopatológica recomendada pela OMS (Organização Mundial da Saúde), descrita inicialmente por Broders (1920), os CECs orais são classificados em bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pobremente diferenciado. Esta graduação é feita de acordo com os graus de diferenciação celular e atividade mitótica. Os carcinomas bem diferenciados representam a maior parte dos CECs orais. Estes tumores apresentam frequentemente um padrão sólido, com proporções variadas de células escamosas e basais, evidente queratinização e poucas figuras de mitoses. Geralmente os carcinomas bem diferenciados apresentam crescimento lento com margens bem definidas, sem invasão vascular e resposta inflamatória linfomonoplasmocitária evidente, o que os torna menos invasivos quando comparados aos carcinomas pobremente diferenciados. Os carcinomas moderadamente diferenciados exibem células neoplásicas bem evidentes com acentuado pleomorfismo nuclear, grande número de mitoses, hipercromatismo, nucléolos bem evidentes e poucas pérolas de queratina, embora possa ocorrer queratinização de células individuais. Geralmente são mais invasivos e mostram um crescimento mais rápido que os carcinomas bem
diferenciados. Os carcinomas pobremente diferenciados apresentam pouca ou nenhuma evidência de queratinização e as células neoplásicas mostram alto grau de pleomorfismo e hipercromasia. Apresentam um crescimento difuso com as células demonstrando elevado potencial mitótico. Os CECs pobremente diferenciados apresentam um comportamento bastante agressivo, caracterizado pela alta capacidade de invasão e de causar metástases. O estadiamento clínico do carcinoma oral é baseado no tamanho da lesão primária, em sua dispersão para linfonodos regionais e na presença ou ausência de metástases à distância. O sistema foi desenvolvido pela União Internacional Contra o Câncer (UICC) e é denominado de sistema TNM de Classificação dos Tumores Malignos. A letra T representa o tamanho e as características do tumor primário, N as características dos linfonodos das cadeias de drenagem linfática do órgão em que o tumor se localiza e M presença ou ausência de metástases à distância. O estadiamento TNM varia para cada tipo específico de câncer, mas existem princípios gerais aonde estes parâmetros recebem graduações, geralmente de T0 a T4, de N0 a N3 e de M0 a M1. Uma lesão in situ é classificada como Tis (Cotran et al., 2005). O símbolo ‘‘X” é utilizado, substituindo o número referente à graduação, quando uma categoria não pode ser devidamente avaliada. Uma vez que os três parâmetros são determinados, seus valores são registrados conjuntamente com a finalidade de determinar o estadio clínico. O estadiamento clínico apresenta categorias que variam de I a IV, sendo o estadio IV subdividido em IVA, IVB e IVC. Quanto maior for o estadio, pior é o prognóstico (Sobin & Wittekind, 2002). O sistema de estadiamento TNM ainda é o principal marcador de prognóstico usado para determinar o manejo dos pacientes com CEC oral, apesar de seu limitado valor, tendo em vista que muitos pacientes com o mesmo estágio da doença podem apresentar uma evolução clínica e tempo de sobrevida distintos (Kantola et al., 2000; Kademani et al.,2005; Bitu et al., 2012; Dissanayaka et al., 2012).
A terapia para o câncer oral é baseada principalmente em cirurgia, quimioterapia e radioterapia (Deboni et al., 2012). A opção por uma terapia específica ou suas associações dependem de cada caso específico. A ressecção
cirúrgica do tumor é recomendada quando há a possibilidade de cura e a condição geral de saúde do paciente possibilita o procedimento (Rodgers et al., 1993; Wolff et al., 2012). O tratamento radioterápico (RT) tem como principal objetivo controlar o tumor com o mínimo de dano aos tecidos adjacentes. A radioterapia pós-operatória ou associada à quimioterapia é indicada nos casos de pacientes com tumores avançados e têm demonstrado uma melhora no controle local da doença e no prognóstico para esses pacientes (Furness et al., 2011). A combinação de radioterapia e quimioterapia pode ser utilizada também nos casos de tumores irressecáveis com o objetivo de diminuir o tamanho do tumor, como adjuvante na cirurgia ou quando não se opta pela cirurgia (Hino et al., 2011; Huang & O’Sullivan, 2013). Nos casos de tumores irressecáveis, a utilização de radioterapia e quimioterapia de maneira concomitante ou alternada demonstrou uma associação com a melhora na sobrevida e qualidade de vida dos pacientes (Furness et al., 2011).
Atualmente a conduta clínica relacionada ao tratamento dos pacientes é baseada principalmente no estadiamento clínico da doença e os protocolos atuais acabam sendo limitados para classificar corretamente os pacientes que apresentam um alto risco de recorrências loco-regionais, um problema comum dos pacientes com CEC oral. Dessa maneira, muitos pacientes acabam desenvolvendo recorrências mesmo após a ressecção cirúrgica com margens histopatologicamente livres de doença (Sepiashvili et al., 2012). A maioria dos fatores prognósticos utilizados atualmente não são capazes de fornecer informações sobre o comportamento biológico do tumor e seu potencial para recorrência (Avirovic et al., 2013). Portanto, a busca por novos biomarcadores é necessária para se entender o comportamento biológico do CEC oral, monitorar a doença e predizer o prognóstico dos pacientes, bem como para o planejamento de novas estratégias de tratamento para o CEC oral.
2.2 Fascina
A fascina é uma proteína globular, agregadora de actina, com peso molecular de 55 kDa, que foi originalmente purificada a partir de extratos de
oócitos de ouriço do mar (Otto et al., 1979). A clonagem molecular do gene responsável por codificar a fascina do ouriço do mar, e posteriormente de humano, camundongo e Xenopus (Bryan et al., 1993; Duh et al 1994; Holthuis et al., 1994; Mosialos et al., 1994), demonstrou que a fascina é uma proteína altamente conservada ao longo da evolução (Duh et al., 1994; Jayo & Parsons, 2010; Tümer et al., 2015). O genoma dos mamíferos codifica três isoformas da proteína: FSCN1 (fascin 1, também conhecida apenas como fascina), a qual é amplamente expressa pelos tecidos mesenquimais e tecidos do sistema nervoso, FSCN2, que é expressa por células fotorreceptoras da retina, e FSCN3, que é expressa especificamente no testículo (Kureshy et al, 2002; Adams, 2004). Em humanos, o gene que codifica fascina está localizado no cromossomo 7p22 e codifica um polipeptídio de 493 aminoácidos, com uma sequência distinta de qualquer outra proteína de agregação da actina (Adams, 2004). A análise da sequência padrão e da estrutura cristalina de fascina revelou que essa proteína é um membro da família de proteínas β-trefoil fold, possuindo quatro domínios β-trefoil (Adams, 2004; Jansen et al., 2011; Tümer et al., 2015) onde cada um desses domínios é composto por seis 2-strand β-hairpins (Kureishy et al., 2002; Chen et al., 2010). A fascina apresenta dois sítios de ligação à actina, um entre os aminoácidos 29-42 e outro entre os aminoácidos 277-493, ambos localizados no primeiro domínio
β-trefoil. Essa região é similar ao sítio de ligação de actina ao substrato da quinase
C rico em alanina miristolada (MARCKS)(Kureishy et al., 2002). Os transcritos de fascina são expressos principalmente no sistema nervoso em desenvolvimento e tecido mesenquimal durante a embriogênese de camundongos, sendo que esses tecidos apresentam migração e diferenciação celular ativas (De Arcangelis et al., 2004). Nos tecidos humanos adultos a fascina é expressa principalmente nas células vasculares endoteliais, células neuronais, fibroblastos e células dendríticas e se mostra ausente ou com baixa expressão em células epiteliais normais (Zhang et al., 2008; Jayo & Parsons, 2010).
A análise em células dendríticas demonstrou que fascina é superexpressa durante a maturação celular (Ross et al., 2003; Yamashiro, 2012) e
é um marcador importante para doenças imunológicas, tais como histiocitose das células de Langerhans e doenças de Hodgkin (Yamashiro, 2012). A fascina mostrou ter uma importante contribuição na neurogênese, atuando na polarização e motilidade do neuroblastos via sua fosforilação/desforilação que é regulada por sinais extracelulares (Sonego et al., 2013). Outros estudos sugerem que a β-catenina teria um papel na regulação de fascina, enquanto outros não encontraram tal relação, sugerindo que a contribuição da β-catenina pode variar de acordo com o contexto celular (Vignjevic et al., 2007; Hashimoto et al., 2009). Há evidências de um importante papel na regulação positiva dos transcritos de fascina pelo fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), fator de crescimento insulina-like 1 (IGF-1) e interleucina 6 (IL-6) em certos tipos de células tumorais, porém os mecanismos pelos quais essa regulação ocorre permanecem desconhecidos (Jayo & Parsons, 2010). Há estudos evidenciando ainda um papel importante dos microRNAs na regulação negativa dos transcritos de fascina tanto em células normais quanto em células tumorais (Quintavalle et al., 2010). Os principais microRNAs envolvidos na regulação de fascina são miR133 e miR143/145 (Jayo & Parsons, 2010; Hashimoto et al., 2011; Yamamoto et al., 2013). Existem também evidências de que fascina é regulada por SLUG (SNAIL-2), um fator de transcrição que orquestra a transição epitélio-mesênquima (TEM) (Li et al., 2014).
A fascina tem a função de organizar actina em feixes paralelos e é requerida na formação de protrusões celulares ricas em actina, sendo uma proteína chave para a extensão dos microspikes, filopodia e invadopodia, além de apresentar grande importância na funcionalidade dessas protrusões durante a migração celular (Adams, 2015; Tümer et al., 2015). As interações entre fascina e actina podem ser reguladas pela matriz extracelular (MEC) e outras proteínas de ligação (Adams, 2004). A formação de filopodios e lamelopodios (estruturas ricas em fascina) ocorre devido à uma resposta celular distinta à trombospondina-1 (TSP-1), que é um componente da MEC, e à outros sinais extracelulares (Kureishy et al., 2002). A correta organização de fascina e dos feixes de actina é necessária para a adesão e migração induzida por TPS-1 e contribui para a migração celular
na presença de fibronectina (FN) (Adams & Schwartz, 2000). A interação entre TPS-1 e sindecan-1 na superfície celular induz a formação de spikes contendo fascina (Adams et al., 2001). A formação de protrusões contendo fascina nas células aderentes à TPS-1 é também regulada pelas pequenas GTPases Cdc42 e RAC (Kureishy et al., 2002). Em contrapartida, a interação de outras proteínas da MEC, por exemplo fibronectina, com integrinas induz a formação da adesão focal e ativação da proteína quinase C (PKC) (Kureishy et al., 2002). PKC se liga e fosforila fascina na região altamente conservada da serina 39 (Ser-39), localizada dentro do sítio de ligação à actina, regulando negativamente a atividade agregadora de actina da fascina (Yamakita et al., 1996; Anilkumar et al., 2003; Adams, 2004; Ma & Machesky, 2014). A fosforilação de fascina é importante para a organização de filopodes e migração celular (Hashimoto et al., 2007). A interação entre fascina fosforilada e PKC ocorre dinamicamente nas células que estão migrando e tende a estar localizada nas bordas das mesmas, atuando como moduladora do equilíbrio entre as protrusões e adesões focais (actina de dentro do citoesqueleto se conecta com a MEC) (Anilkumar et al., 2003; Parsons & Adams, 2008).
Dado que fascina desempenha um papel fundamental na estrutura e estabilidade dos feixes ricos em actina e nas estruturas celulares protrusivas, uma série de estudos vêm demonstrando uma correlação positiva entre a expressão de fascina e tumores, incluindo câncer de pulmão (Grothey et al., 2000; Yoder et al., 2005), câncer de colón (Hashimoto et al., 2006; Puppa et al., 2007; Vignjevic et al., 2007; Adams, 2015), câncer gástrico (Hashimoto et al., 2004), câncer renal (Tong et al., 2005), câncer esofágico (Xue et al., 2006; Zhang et al., 2006) e câncer oral (Alam et al., 2012). Além disso, a expressão aumentada de fascina está relacionada à progressão (Hashimoto et al. 2007) e maior agressividade da doença (Jayo & Parsons, 2010; Tümer et al., 2015). Adicionalmente, a superexpressão de fascina no carcinoma primário tem sido correlacionada à metástase linfonodal e/ou à distância (Zigeuner et al., 2006; Puppa et al., 2007). Estudos utilizando modelo animal com células de carcinoma de cólon
demonstraram que a neutralização de fascina foi capaz de promover uma diminuição significativa no crescimento, desenvolvimento e invasão tumoral (Hashimoto et al., 2007; Vignjevic et al., 2007). Em contrapartida, a superexpressão de fascina foi capaz de aumentar a migração e invasão nas culturas celulares e em experimentos in vivo foi capaz de promover disseminação celular e metástase (Vignjevic et al., 2007). Em câncer gástrico a alta expressão de fascina foi relacionada a um pior prognóstico quando comparados aos tumores com baixa expressão (Hashimoto et al., 2004; Li et al., 2008; Kim et al., 2012) e resultados semelhantes foram encontrados com câncer intestinal, sendo a expressão de fascina relacionada a uma diminuição na sobrevida, se mostrando como um fator independente de prognóstico (Gu et al., 2014). Em carcinomas pulmonares fascina é preditiva de metástase linfática (Liu et al., 2011).
Bi e coloboradores (2013) demonstraram que em células de câncer de bexiga, o silenciamento de fascina foi relacionado à diminuição na migração e invasão e ao aumento na adesão das células tumorais. Em laringe, a expressão de fascina foi significantemente maior no tumor em relação a margem adjacente e a superexpressão de fascina foi associada ao estágio clínico da doença e ao padrão de diferenciação tumoral, resultando em um pior prognóstico (Gao et al., 2012). A expressão de fascina em carcinomas de mama demonstrou correlação positiva com os marcadores da TEM, como evidenciado pela redução nos níveis de E-caderina e aumento nos níveis de SNAIL2 (Hayashi et al., 2011). Al-alwan et al. (2011) demonstraram que a fascina é um regulador chave na invasão em câncer de mama, atuando por meio da modificação de moléculas associadas à metástase, tais como BRMS1 (supressor de metástase em câncer de mama, tipo 1), NF-KB, uPA, MMP-2 e MMP-9. Xie e colaboradores (2010) demonstraram que a fascina regula a proliferação e a invasão de células de carcinoma escamoso esofágico por meio da modulação da expressão dos genes CTGF (fator de crescimento do tecido conjuntivo) e CYR61 (indutor angiogênico rico em cisteína-61) via TGF-beta. Ainda em carcinoma de esôfago, a expressão de fascina se mostrou aumentada durante os estágios da evolução tumoral, revelando uma
maior expressão no carcinoma invasivo em relação à displasia e tecido normal, porém os autores não encontraram correlação com a sobrevida dos pacientes (Takikita et al., 2011). Em células metastáticas de carcinoma de mama, o complexo STAT3/NF-KB é necessário para a expressão de fascina em resposta a IL-6 e TNF-α (Snyder et al., 2002). Ghebeh et al. (2014) demonstraram que fascina está envolvida na resistência a quimioterápicos em células de carcinoma de pulmão, principalmente pela via de sinalização PI3K/AKT. A migrastatina, uma droga sintética, e seus análogos têm a capacidade de se ligar à fascina e inibir a polimerização dos filamentos de actina e a formação de filopodios, levando uma redução na migração celular e na formação de metástases em modelo xenográfico de cânceres de mama, próstata e cólon (Shan et al., 2005; Chen et al., 2010). Huang e colaboradores (2015) identificaram um inibidor da atividade de agregação de actina pela fascina por meio de um rastreio de alto rendimento. A inibição de fascina resultou em uma diminuição na formação de filopodia, migração e invasão de células tumorais in vitro e na redução de metástase in vivo. Ma & Machesky (2014) demonstraram que a fascina desempenha um importante papel na migração, invasão e metástase em uma série de carcinomas escamosos, incluindo o de mama, cólon, esôfago e os de cabeça e pescoço, incluindo o CEC oral.
Há um número ecasso de trabalhos demonstrando a correlação da expressão de fascina com o CEC oral. A expressão de fascina se correlacionou com o desenvolvimento do CEC oral, visto que a expressão de fascina no CEC oral foi maior em comparação às displasias, que apresentou maior expressão em comparação à mucosa normal (Shimamura et al., 2011). No entanto, esse estudo foi realizado em um número bem reduzido de amostras. Lee e colaboradores (2007) analisaram a expressão de fascina em CEC oral e encontraram uma correlação significativa com metástase nodal, recorrência e diminuição de sobrevida global. Nas células tumorais, a interação entre fascina e E-caderina mostrou relação com uma maior agressividade tumoral. A neutralização de fascina em linhagens celulares de CEC oral foi capaz de diminuir as protrusões celulares, resultando em um declínio na migração e invasão e levou a um aumento na
adesão celular (Chen et al., 2009). Em um estudo recente, Alam e colaboradores (2012) demonstraram que linhagens celulares CEC oral superexpressando fascina apresentaram um aumento na migração, invasão e adesão celular, além de apresentarem um aumento na atividade de MMP-2. Esses autores demonstraram ainda que a marcação imuno-histoquímica de fascina apresentou correlação com o tamanho tumoral, presença de metástase linfonodal, diferenciação tumoral, taxa de recorrência e com uma diminuição na sobrevida dos pacientes, mostrando que fascina desempenha um papel na progressão tumoral. A fascina têm se mostrado como um elemento chave na migração e invasão e por essa razão tem se mostrado como um potencial marcador prognóstico para o câncer (Ma & Machesky, 2014).
2.3 Plectina
A plectina é uma proteína com 500 kDa em forma de haltere pertencente à família das plaquinas (cytolinker), um grupo de proteínas estruturais com função de organizar o citoesqueleto celular, desempenhando um papel crucial na manutenção da estrutura e integridade celular e tecidual (Wiche, 1998; Rezniczek et al., 2010; Winter & Wiche, 2013). Estruturalmente a plectina se apresenta como um dímero consistindo em uma coiled coil central de alfa hélices, conectando dois grandes domínios globulares (um em cada terminal), que são os responsáveis em conectar a plectina com vários alvos do citoesqueleto. O domínio C-terminal contém seis regiões homólogas repetidas e o subdomínio entre as regiões cinco e seis se conecta com os filamentos intermediários (FI) e vimentina e o domínio N-terminal se liga à actina (Winter & Wiche, 2013).
A plectina é expressa em uma grande variedade de células e tecidos e se encontra localizada na superfície intracelular da membrana plasmática, nos sítios de fixação dos filamentos intermediários (FI), microtúbulos e microfilamentos (Wiche, 1998; Wiche & Winter, 2011). Esta proteína é expressa em quase todas as células de mamíferos e tem como principal função a manutenção e estabilização do citoesqueleto e por essa razão é encontrada principalmente em
tecidos expostos à estresse mecânico, como células musculares, de epitélios estratificado e simples, células que formam a barreira hemato-encefálica e em camadas teciduais na interface entre os tecidos e as cavidades preenchidas por fluido incluindo superfícies de glomérulos renais, canalículos biliares, urotélio vesical, vilosidades intestinais, camadas ependimárias que revestem as cavidades do cérebro e da medula espinhal e em células endoteliais dos vasos sanguíneos (Na et al., 2009; Rezniczek et al., 2010; Wiche & Winter., 2011; Castañón et al., 2013; Winter & Wiche, 2013).
A plectina é uma proteina com uma estrutura de multi-domínio e apresenta a propriedade de interagir com um grande número de proteínas de diferentes vias celulares, sendo capaz de se ligar não só a todos os tipos de FI, filamentos de actina e microtúbulos, mas também à receptores transmembrânicos, componentes nucleares e a uma série de quinases que são sabidamente envolvidas nos processos de migração e proliferação (Castañón et al., 2013; Cheng et al., 2015). Além de reforçar o citoesqueleto, a plectina também funciona como arcabouço para as proteínas e as moléculas envolvidas na sinalização celular. Ao se ligarem à plectina, estas proteínas são posicionadas em locais específicos dentro dos compartimentos celulares (Cheng et al., 2015). Dependendo do tipo celular, a plectina é distribuída por todo o citoplasma, interligando os filamentos intermediários com os microtúbulos e aderindo-os às junções celulares em regiões periféricas. Ela também integra e ancora organelas como mitocôndrias e núcleo à rede de FI (Winter & Wiche, 2013). Em células epiteliais, plectina é localizada principalmente nos hemidesmossomos, desmossomos e nas adesões focais (Litjens et al., 2003). Defeitos no gene da plectina têm sido relacionados ao desenvolvimento de múltiplas doenças, como a distrofia muscular e a sinais de neuropatia (Winter & Wiche, 2013). A doença mais comum associada à deficiência de plectina é a epidermólise bolhosa simples, uma desordem bolhosa cutânea rara, autossômica recessiva (Gache et al., 1996; (Winter & Wiche, 2013). As propriedades mecânicas e a dinâmica do citoesqueleto são afetadas pela presença de plectina. A ausência dessa proteína é capaz de
produzir mudanças na rede de FI dos queratinócitos, levando à um aumento na migração (Osmanagic-Myers et al., 2006).
Lee et al. (2004) demonstraram que a superexpressão de plectina nas células de carcinoma colorretal é capaz de afetar a organização do citoesqueleto, podendo ser relacionada com a tumorigênese e a mudanças morfológicas nas células epiteliais. Em um estudo proteômico, a plectina foi identificada como um novo biomarcador para adenocarcinoma ductal pancreático (Kelly et al., 2008). Bausch e colaboradores (2009), em um estudo comparando a expressão de plectina em lesões benignas e malignas de pâncreas, encontraram que a plectina é especificamente expressa pelos tumores primários e metastáticos e no fluido cístico destas lesões, sugerindo que a análise da plectina pode contribuir para o diagnóstico de neoplasia mucinosa papilar intraductal. No câncer de pâncreas, também foi observado um aumento na expressão de plectina durante o processo de carcinogênese, sendo mais expressa no carcinoma invasivo em comparação às lesões precursoras e negativa nos tecidos benignos, sendo a plectina considerada um biomarcador eficiente para identificar câncer pancreático primário e metastático (Bauch et al., 2011). A plectina apresenta especificidade de marcação para lesões pancreáticas precursoras e malignas de alto grau, por essa razão, tem sido sugerida como um biomarcador diagnóstico in vivo para este tipo de câncer (Konkalmatt et al. 2013).
A inibição de plectina em hepatócitos humanos foi acompanhada por uma desorganização do citoesqueleto celular, possivelmente alterando a capacidade de migração e invasão celular (Liu et al., 2011). Cheng e colaboradores (2015) também encontraram uma alteração na migração e invasão causada pela desorganização do citoesqueleto celular, causada pela inibição de plectina associada à ativação de FAK e Rac1-GTPase. Utilizando a espectrometria de massa, Pawar et al. (2011) demonstraram que plectina é superexpressa em tumores esofágicos em comparação ao tecido normal. Katada et al. (2012) demonstraram que plectina é superexpressa em carcinomas de hipofaringe e a inibição de plectina foi acompanhada por uma inibição da via de sinalização
celular regulada por ERK1/2, resultando em redução na proliferação, na migração e na invasão celular. Estes autores também demonstraram que a superexpressão de plectina é um marcador independente de sobrevida global em pacientes com tumores de hipofaringe. Neste mesmo estudo, analisaram ainda 62 amostras de CEC de cabeça e pescoço, entre essas 23 de CEC oral, e demonstraram uma correlação entre a expressão de plectina e a presença de metástase à distância. Yu et al. (2012) demonstraram que o receptor RON (recepteur d'origine nantais) é capaz de regular a migração celular em câncer de pâncreas através da quebra, dependente da fosforilação, de hemidesmossomos.
Podossomos e invadopodia são estruturas celulares formadas pela associação de actina e proteínas do citoesqueleto celular. Essas estruturas apresentam um papel chave na adesão, na migração e na invasão celular (Buccione et al., 2004). Takkunen et al. (2009) demonstraram a associação de plectina com a formação de podossomos, mas essa associação não foi demonstrada na formação de invadopodia em células de CEC oral. Em contrapartida, um outro estudo demonstrou que a interação de vimentina e plectina serve como um estabilizador para invadopodia, facilitando a invasão e metástese tumoral (Sutoh Yoneyama et al., 2014). A superexpressão de plectina tem sido relatada em vários tipos de carcinomas epiteliais (Castañón et al., 2013). No entanto, estudos na literatura demonstrando o papel biológico da expressão de plectina nos CECs orais são extremamente escassos.
Flores (2013), em um estudo prévio realizado pelo nosso grupo, buscando identificar potenciais biomarcadores para o CEC oral, microdissecou à laser 10 pares de mucosa oral normal e CEC oral e os submeteu a espectrometria de massas associada à cromotografia líquida. Esse estudo identificou 2.529 proteínas, dessas 107 se mostraram mais expressas no CEC oral em comparação às amostras de mucosa oral normal. O fator eucariótico de elongação delta 1 (EEF1D) foi a proteína indicada para validação e teve sua expressão aumentada em CEC oral confirmada por western blot e imuno-histoquímica, sendo um potencial biomarcador para o CEC oral. Entre as proteínas que se mostraram
abundantes no CEC oral em comparação à mucosa oral normal se encontram também as proteínas fascina e plectina, sendo necessários estudos que confirmem o potencial destas proteínas como biomarcadores para o CEC oral.
3 PROPOSIÇÃO
Os principais objetivos do presente estudo foram:
1. Validar a superexpressão de fascina e plectina em linhagens celulares e amostras orais de tecidos normais e de CEC oral por qRT-PCR e imuno-histoquímica.
2. Avaliar a expressão de fascina e plectina em amostras orais que caracterizam a evolução histopatológica do CEC oral: mucosa normal, displásica e CEC.
3. Correlacionar a expressão de fascina e plectina com as variáveis clínico-patológicas, de recorrência e de sobrevida de pacientes com CEC oral.
4. Avaliar os efeitos biológicos produzidos pela neutralização dos níveis celulares de fascina nos fenótipos tumorais, incluindo, adesão, migração e invasão nas linhagens celulares de CEC oral HSC-3 e SCC-15.
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4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Aprovação do Comitê de Ética
Todos os experimentos deste estudo foram realizados de acordo com as normas relativas à ética em pesquisa envolvendo seres humanos sob deliberação do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP (protocolo número 090/2011) (Anexo 1).
4.2 Amostras
Para validar a superexpressão das proteínas fascina e plectina em CECs orais, os blocos das amostras de mucosa oral normal (n=10) e CECs orais (n=10) foram recuperados e submetidos à análise imuno-histoquímica com anticorpos específicos (Flores et al., 2013). Este estudo também analisou amostras frescas de mucosa oral normal oriundas de 11 indivíduos saudáveis sem história de tabagismo e etilismo submetidos a tratamento cirúrgico para remoção de leões benignas comuns no Orocentro da FOP-UNICAMP, os fragmentos foram obtidos a margem do leito cirúrgico e 11 amostras de CEC foram coletadas no interior da lesão, evitando áreas de necrose, de pacientes atendidos no Orocentro. Os fragmentos foram armazenados em freezer -80ºC até posterior análise por qRT-PCR (Carrera et al., 2015).
A fim de verificar a expressão de fascina e plectina em amostras orais que caracterizam a evolução histopatológica do CEC oral, 29 casos de hiperplasia fibrosa com epitélio oral normal, 69 displasias sendo 24 classificadas como leve, 26 como moderada e 19 como displasia intensa e 113 casos de CEC oral foram submetidos a reações de imuno-histoquímica. As displasias e os CEC orais foram classificados de acordo com o sistema da OMS. Os 113 casos de CEC oral representam peças cirúrgicas e apresentam todas as informações clínicas, histopatológicas, de recorrência e sobrevida (Tabela 1), a graduação histológica dos tumores foi baseada na classificação da OMS (Barnes et al., 2005). Com exceção das amostras de CEC oral que foram obtidas junto a dois hospitais de
referencia de Cascavel, Paraná (Sawazaki-Calone et al., 2015), todas as outras amostras foram retiradas dos arquivos do Laboratório de Patologia da FOP-UNICAMP.
Tabela 1. Características clínico-histopatológicas dos 113 pacientes com CEC oral. Variáveis N (%) Idade Media: 56,6 ± 11,6 anos Mediana: 56 anos Variação: 31 a 84 anos Gênero Masculino Feminino 93 (83,8) 18 (16,2) Hábito de fumar Não Sim 16 (17,6) 75 (82,4) Hábito de beber Não Sim 21 (26,2) 59 (73,8) Localização do tumor Língua Assoalho Palato Outros 55 (52,9) 31 (29,8) 10 (9,6) 8 (7,7) Estágio T T1/T2 T3/T4 86 (77,5) 25 (22,5) Estágio N N0 N+ 62 (55,9) 49 (44,1) Tratamento Cirurgia Cirurgia + Radioterapia Cirurgia + Radioterapia + Quimioterapia
43 (38,4) 57 (50,9) 12 (10,7) Graduação histopatológica OMS
Bem diferenciado Moderadamente diferenciado Pobremente diferenciado 17 (15,3) 82 (73,9) 12 (10,8) Margem cirúrgica > 5 mm < 5 mm 106 (96,4) 4 (3,6) Recorrência local Não Sim 85 (76,6) 26 (23,4) Recorrência regional Não Sim 99 (89,2) 12 (10,8) Recorrência à distância Não Sim 109 (98,2) 2 (1,8) Segundo tumor primário
Não Sim 86 (77,5) 25 (22,5) Hospital CEONC UPECCAN 45 (40,5) 66 (59,5)
4.3 Reação Imuno-histoquímica
As reações de imuno-histoquímica foram realizadas em secções com 3 um de espessura, utilizando a técnica da estreptavidina-biotina-peroxidade. Os cortes obtidos a partir dos blocos parafinados foram inicialmente desparafinados em xilol, hidratados em soluções de etanol com concentrações decrescentes (100%, 90%, 70% e 50%) e lavados em água. A recuperação antigênica foi realizada utilizando 0,01 M tampão citrato pH 6,0 em panela de pressão elétrica tipo Pascal durante 15 min (contados após o início da pressão). As amostras foram então resfriadas e a peroxidase endógena foi inativada por meio da incubação em uma solução aquosa de peróxido de hidrogênio 3% por 15 min. Em seguida, os cortes foram lavados com PBS, incubados com os anticorpos primários anti-fascina 1:700 (clone IM20, Abcam, EUA) e anti-plectina 1:200 (clone C-20, Santa Cruz, EUA). Após incubação com os anticorpos primários, os cortes foram lavados com PBS e o sistema de detecção LSAB foi utilizado (Dako, EUA). As reações foram então reveladas com solução de 3,3 diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB, Sigma-Aldrich, EUA) contendo 0,01% de peróxido de hidrogênio e contra-coradas com hematoxilina de Mayer.
4.3.1 Análise da Marcação Imuno-histoquímica
As lâminas submetidas as reações de imuno-histoquímica foram escaneadas utilizando o escaneador de lâminas histológicas (Aperio® Scanscope CS, Aperio Technologies, EUA) e a intensidade das marcações imuno-histoquímicas foram analisadas o software ImageScopeTM (Aperio Technologies, EUA). As expressões citoplasmáticas de fascina e plectina nas células epiteliais foram analisadas de forma quantitativa, levando em consideração a porcentagem de células marcadas e a intensidade de marcação. As intensidades de marcação receberam pontuações 3, 2, 1 e 0, correspondendo a forte, moderada, fraca e negativa respectivamente. A porcentagem de células para cada intensidade foi estimada levando-se em conta a quantidade total de pixels para cada marcação. A pontuação para cada amostra foi então calculada realizando-se a somatória das
porcentagens das células marcadas multiplicadas pela pontuação estabelecida para cada intensidade de marcação, resultando em uma pontuação mínima de 100 e máxima de 300. As amostras foram divididas em dois grupos (com baixa e alta expressão) a partir da mediana da pontuação.
4.4 Cultura de Células
Este estudo utilizou 8 linhagens celulares. As células HGK representam uma linhagem derivada de queratinócitos gengivais normais humanos que sofreram imortalização espontânea após longo período de cultivo (Salo et al., 1991). Estas células são cultivadas em meio de cultura livre de soro fetal bovino (FBS), com níveis reduzidos de cálcio e contendo suplementos específicos (Gibco’s Keratinocyte-SFM, Invitrogen, EUA) e antibióticos. As linhagens SCC-4 (CRL-1624), SCC-9 (CRL-1629), SCC-15 (CRL-1623) e SCC-25 (CRL-1628) são provenientes de CECs de língua humanos e foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC, EUA). Estas linhagens são cultivadas em meio de cultura contendo partes iguais de meio de Eagle modificado por Dulbecco’s (DMEM) e meio F-12 (DMEM/F-12; Invitrogen, EUA) suplementado com 10% de FBS, 400 ng/ml de hidrocortisona (Sigma-Aldrich, EUA) e antibióticos. A linhagem celular HSC-3 também é proveniente de CEC de língua (Japan Health Science Research Resources Bank, JRCB 0623) e é cultivada no mesmo meio de cultura que as outras linhagens de câncer, mas acrescido de 50 µg/ml de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, EUA). As linhagens metastáticas SCC-9 ZsGreen LN-1 e SCC-9 ZsGreen LN-2, derivadas das células SCC-9, foram estabelecidas em nosso laboratório a partir de modelo xenográfico em camundongos nude que desenvolveram metástases em linfonodos axilares após injeção ortotópica da linhagem tumoral (Agostini et al., 2014). Estas células são cultivadas como a linhagem parental. Todas as linhagens foram mantidas em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 a 37ºC.
