Equação 5: Coeficiente de variação.
5.14 EFICIÊNCIA in vitro DAS MICROEMULSÕES FRENTE AO FUNGO S brasiliensis
A eficiência in vitro da microemulsão contendo a associação dos fármacos foi avaliada de acordo com o halo de inibição do crescimento do fungo S. brasiliensis, e o resultado foi comparado com as microemulsões contendo os fármacos isoladamente, assim como a microemulsão sem fármacos (branco). Os resultados foram apresentados na Tabela 33.
Tabela 33: Diâmetro do halo de inibição de crescimento (mm) de S. brasiliensis frente à ação de microemulsão
sem fármacos (branco), microemulsão itraconazol + clotrimazol, microemulsão itraconazol e microemulsão clotrimazol. Média dos valores ± desvio padrão.
Microemulsão Halo de inibição de crescimento S. brasiliensis (mm ± DP)
Branco 0
Itraconazol + Clotrimazol 43,67 ± 2,31
Itraconazol 33 ± 1,73
Clotrimazol 41,67 ± 2,88
A Figura 58 apresenta um exemplo das placas experimento evidenciando os halos de inibição das formulações frente ao fungo S. brasiliensis. A microemulsão sem fármacos (branco) não apresentou atividade inibitória. A microemulsão contendo apenas itraconazol apresentou o menor nível de atividade antifúngica e as microemulsões com clotrimazol tanto isoladamente quanto em associação com itraconazol apresentaram os maiores halos de inibição de crescimento, não diferindo entre si.
O número de fármacos disponíveis para o tratamento de infecções fúngicas, principalmente para o tratamento da esporotricose, é limitado. O uso excessivo do itraconazol e a dificuldade de administração em felinos, resultou ao aparecimento de resistência em espécies suscetíveis e, atualmente, não satisfazem a necessidade médica veterinária por completo (OROFINO-COSTA et al., 2017). Ainda assim, o itraconazol é a primeira escolha para esta doença por apresentar melhor resposta terapêutica. Adicionalmente, a esporotricose é um problema de saúde pública devido ao aumento no número de casos em humanos e felinos, tornando o problema cada vez maior. Dessa forma, a associação de fármacos de classes terapêuticas ou químicas iguais ou diferentes é uma terapêutica alternativa para evitar e superar a resistência antifúngica.
A administração de medicamentos por via oral é um grande problema relatado por tutores de gatos e veterinários. O desenvolvimento de um sistema de liberação transdérmico, é uma alternativa para a substituição da via oral, quando essa se torna mais inadequada. Além
disso, o uso desse tipo de sistema evita diversos problemas relacionados à absorção gastrointestinal, interação fármaco e alimento ou outros fármacos administrados oralmente (ALKILANI et al., 2015; ALLEN et al., 2007; AULTON, 2005; BIBI et al., 2017). Todavia, para o uso transdérmico é essencial que o clotrimazol esteja em associação com o itraconazol para a permeação ser sucedida, uma vez que o clotrimazol atua como promotor de permeação, conforme demonstrado anteriormente. Dessa forma, mesmo que a microemulsão com clotrimazol tenha apresentando atividade satisfatória para o fungo S. brasiliensis, não é interessante veicular os fármacos de forma isolada.
Figura 58: Avaliação in vitro das microemulsões frente ao fungo S. brasiliensis. A- Microemulsão branco; B-
Microemulsão itraconazol; C- Microemulsão clotrimazol; D- Microemulsão itraconazol/clotrimazol.
5.15 ESTUDO DE ESTABILIDADE
O estudo de estabilidade é um importante parâmetro para a avaliação da segurança, eficácia e qualidade de um medicamento. A partir dos resultados deste estudo é determinado o prazo de validade, uma importante fonte de informação para possíveis desvios de qualidade.
Além disso, para a concessão e renovação de registro e para possíveis alterações pós-registro, o estudo de estabilidade é exigido pela ANVISA, órgão regulador responsável pelo registro de medicamentos no Brasil (MACEDO, 2010; MAL & CARDOSO, 2013; NISHIOKA, 2006).
A microemulsão foi avaliada quanto ao aspecto visual, índice de refração, condutividade elétrica e teor de substâncias ativas. Não foi possível a análise da distribuição do tamanho de gotícula devido a problemas técnicos. A Tabela 34 apresenta os resultados do estudo de estabilidade em câmara climática (40 ± 2 oC) e refrigeração (-5 ± 2 oC).
No final do estudo de estabilidade, em 90 dias, as amostras da microemulsão mantiveram-se com aspecto límpido, homogêneo e transparente, características essenciais deste sistema. A condutividade elétrica e o índice de refração, análises utilizadas para a verificação da alternância estrutural das microemulsões, também indicaram que o sistema se manteve estruturalmente do tipo O/A, uma vez que a condutividade elétrica se manteve próximo ao valor do componente aquoso da formulação. Este fato foi confirmado pelo índice de refração. O valor de pH se manteve constante nas formulações em refrigeração. Em contraste, foi observado uma alteração dos valores nas formulações em câmara climática. Porém, eles permaneceram dentro da faixa limite do pH da pele de humanos e felinos.
Tabela 34: Resultados do estudo de estabilidade em refrigeração e em câmara climática no tempo zero e em 30, 60 e 90 dias da ME-12 contendo clotrimazol e itraconazol.
Média dos valores ± desvio padrão, n = 3, onde n é o número de repetições.
Refrigeração (-5 ± 2 oC) Câmara climática (40 ± 2 oC) Aspecto visual Índice de Refração Condutividade elétrica (µS/cm) pH Aspecto visual Índice de Refração Condutividade elétrica (µS/cm) pH Tempo zero Límpido, homogêneo e transparente 1,440 ± 0,01 19,8 ± 0,1 6,2 ± 0,3 Límpido, homogêneo e transparente 1,440 ± 0,02 19,8 ± 0,1 6,2 ± 0,3 30 dias Límpido, homogêneo e transparente 1,441 ± 0,02 19,8 ± 0,1 6,2 ± 0,6 Límpido, homogêneo e transparente 1,440 ± 0,01 19,2 ± 0,4 5,4 ± 0,2 60 dias Límpido, homogêneo e transparente 1,440 ± 0,03 19,8 ± 0,1 6,2 ± 0,3 Límpido, homogêneo e transparente 1,442 ± 0,02 19,6 ± 0,1 5,0 ± 0,3 90 dias Límpido, homogêneo e transparente 1,440 ± 0,01 19,8 ± 0,1 5,4 ± 0,1 Límpido, homogêneo e transparente 1,440 ± 0,01 19,6 ± 0,2 4,8 ± 0,5
De acordo com a ANVISA, mudanças significativas que ocorrerem durante o período de 3 a 6 meses do estudo de estabilidade, o prazo de validade provisório (no máximo 24 meses), será baseado no estudo de estabilidade de longa duração. O acompanhamento do teor dos fármacos é uma ferramenta analítica essencial e indicativa da estabilidade química em formulações farmacêuticas. A principal mudança significativa está relacionada ao teor dos fármacos, isto é, perda de 5 % no teor/potência do IFA em relação ao valor inicial (BRASIL, 2005; BRASIL, 2017). A Figura 59 demonstra o teor de itraconazol e clotrimazol nas duas condições forçadas de temperatura.
A concentração inicial dos fármacos na microemulsão foi considerada 100 % e, então, o teor foi monitorado ao longo de 90 dias. Nas amostras mantidas sob refrigeração ambos os fármacos mantiveram o teor (%) dentro do limite estipulado pela ANVISA. Além disso, é importante ressaltar que não houve interação evidente entre clotrimazol e itraconazol a 5 oC,
uma vez que nos cromatogramas obtidos, os picos referentes aos fármacos foram detectados de forma independente, sem o aparecimento de picos adicionais. Em contrapartida, ambos os fármacos tiveram mudanças significativas no teor (%) ao longo do tempo quando as formulações foram submetidas ao aquecimento, especialmente o clotrimazol. Adicionalmente, um novo pico foi observado no cromatograma destas amostras (Figura 60).
Figura 59: Teor de fármaco na microemulsão (clotrimazol e itraconazol) versus tempo de armazenagem nas
condições do estudo de estabilidade acelerada. Média dos valores ± desvio padrão, n = 3, onde n é o número de repetições.
Figura 60: Cromatogramas em CLAE-UV das amostras de microemulsão clotrimazol/itraconazol armazenadas a
em câmara climática (T= 40 °C) durante o estudo de estabilidade após 30, 60 e 90 dias.
A fim de investigar a formação do novo composto detectado nas amostras submetidas a temperatura de 40 °C, que poderia ser resultado da interação entre clotrimazol e itraconazol, foram realizados estudos adicionais. Inicialmente, foi investigado quais produtos de degradação poderiam ser formados a partir da degradação de ambos os fármacos. A literatura relata que o clotrimazol apresenta um produto de degradação quando submetido a condições ácidas levando á formação do produto 3 indicado na Figura 61 (HÁJKOVÁ et al., 2007).
Figura 61: Esquema de reação mostrando a degradação do clotrimazol em meio ácido. Fonte: elaboração
Com esses conceitos, foi conduzida a síntese do composto 3 a partir do clotrimazol, aquecendo-o a 80 oC na presença de acetonitrila e ácido clorídrico concentrado por 2h. O produto teve sua identidade confirmada a partir das técnicas de espectrometria de massas (Figura 62) e RMN de 1H, comparando com os dados obtidos na literatura científica. Posteriormente, foi conduzida a degradação forçada a partir de uma mistura contendo itraconazol e clotrimazol sob aquecimento a 50 °C por 24h em uma solução de acetonitrila, água e álcool benzílico, desta forma simulando a composição da microemulsão. Em seguida, o produto foi isolado usando cromatografia em coluna. O rendimento desta reação foi muito baixo, aproximadamente 6 %, logo não foi possível a análise por RMN de 1H, sendo apenas possível a análise por espectrometria de massas (Figura 63) e por CLAE.
Figura 62: Espectro de massas da síntese do produto B a partir do clotrimazol. O eixo x representa a relação
Figura 63: Espectro de massas do produto de decomposição formado a partir da degradação forçada do
clotrimazol na presença do itraconazol sob aquecimento. O eixo x representa a relação massa/carga (m/z) e o eixo y representa a intensidade relativa.
Os dois compostos obtidos por meio das reações, isto é, o produto 3 e o produto obtido da degradação, foram analisados por CLAE utilizando o método desenvolvido e validado (Figuras 64 e 65). A comparação nos tempos de retenção de ambos os produtos, provou que o produto 3 é formado pela degradação do clotrimazol na presença de meio ácido. Além disso, o tempo de retenção também se equiparou ao produto previamente detectado nos estudos de estabilidade realizados a 40 °C, o que prova que sob condições específicas (aquecimento e pH ácido), o clotrimazol pode sofrer degradação em condições ácidas formando o produto 3. Na Tabela 29, pode-se destacar o acompanhamento do pH no estudo de estabilidade. É importante destacar que as formulações submetidas ao aquecimento tiveram um decaimento do pH a partir de 30 dias, corroborando o decaimento do teor do clotrimazol em meio ácido.
Figura 64: Cromatograma em CLAE-UV do composto 3 obtido a partir do aquecimento do clotrimazol presença
de acetonitrila e ácido clorídrico concentrado.