Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE)

Para a realização da DGGE foram utilizados os fragmentos de DNAr 16S amplificados, de todos os consórcios microbianos (R1, P1, P2, NP1, NP2, NP3, NP4, DCPpir), com iniciadores contendo grampos de GC ligados à terminação 5’ do iniciador da seqüência senso. Para o Domínio Bacteria foram utilizados os iniciadores 968F-GC/1392R e para o Domínio

Archaea os iniciadores 1100F-GC/1400R, nas mesmas condições descritas na Tabela 7. As

seqüências dos grampos de GC para cada iniciador estão apresentadas na Tabela 8.

Tabela 8. Iniciadores e as correspondentes seqüências dos grampos de GC utilizados na DGGE.

Iniciador Seqüência do grampo de GC (5’- 3’)

968F-GC CGC CCG GGG CGC GCC CCG

1100R-GC CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G

Os microrganismos Methanosarcina barkeri (ATCC®) e Escherichia coli (FAT)8 foram

utilizados como controles positivos e negativos para os fragmentos de DNAr 16S amplificados com os iniciadores específicos para os Domínios Archaea e Bacteria, respectivamente.

Na DGGE, foram testados dois gradientes lineares de desnaturação (30% e 70%, 40% e 60%) em géis de acrilamida (16cm x 16cm x 1mm) para analisar a melhor condição de separação dos fragmentos dos genes amplificados pela PCR. Os agentes desnaturantes utilizados foram a uréia (Promega) e a formamida (Mallinckrodit). A montagem dos géis e a separação dos fragmentos de DNA pela técnica de DGGE foram realizadas em um sistema formador de gradiente Modelo 475 (Bio-Rad). Os géis foram fotografados e analisados em fotodocumentador Eagle Eye TMIII (Stratagene) acoplado ao computador equipado com o

Software Eagle Sight. Os procedimentos de todas as etapas realizadas na DGGE, assim como a

operacionalização do aparelho e a preparação das soluções utilizadas foram descritas detalhadamente por Sakamoto (2001) e Brucha (2001). A seguir serão apresentados resumidamente o preparo das amostras e o procedimento para a realização desta importante ferramenta molecular.

4.8.1. Preparação dos produtos da PCR utilizados na técnica de DGGE

1. Adicionar 4µL do corante loading dye (2x) em 20µL do produto de PCR proveniente do DNAr 16S de cada amostra de consórcio.

4.8.2. Procedimento para a realização da técnica de DGGE

1. Preparar as soluções desnaturantes em concentrações de 0%, 30%, 40%, 60% e 70% (Tabela 9);

2. Dissolver a uréia nos reagentes líquidos, completar o volume para 100,0mL com água deionizada e armazenar a solução a 4 °C;

3. Montar o “sanduíche” do gel em gradiente em paralelo com o conjunto de placas de vidro e suporte;

4. Preparar separadamente as soluções para a confecção dos géis de acrilamida em concentrações de 0%, 30%, 40%, 60% e 70% em tubos Falcon (15,0mL) mantidos em gelo, de acordo com a Tabela 10;

5. Transferir as soluções dos tubos nas concentrações desejadas (30%-70% ou 40%-60%) simultaneamente para o “sanduíche” de placas de vidro, com auxílio de duas seringas acopladas ao aparelho de injeção;

6. Aguardar 10 minutos e inserir o “pente” na parte superior do gel para formar as canaletas; 7. Injetar a solução 0% (stacking gel) com micropipeta e deixar o gel polimerizar por 14

horas;

8. Adicionar 140,0mL de TAE 50x (Tris-acetato 0,04M, EDTA 0,5M) em cuba eletroforética, completar o volume para 7,0L com água deionizada e aquecer o tampão de corrida a 60 °C; 9. Transferir o “sanduíche” para a cuba, retirar o pente e lavar as canaletas do gel com o

tampão, com auxílio de micropipeta;

10. Aplicar as amostras com ponteiras de seqüenciamento nas respectivas canaletas; 11. Ligar a bomba de agitação, conectar os eletrodos em 130V;

12. Aguardar o tempo de corrida de 6h;

13. Após a eletroforese, desligar o sistema, retirar o “sanduíche” de placas e deixar secar sobre papel absorvente para retirar o excesso de tampão;

14. Transferir o gel das placas para bandeja contendo solução diluída do corante brometo de etídeo em água (1µL/mL), durante 10 minutos;

15. Secar o excesso da solução com papel absorvente;

16. Deixar o gel durante 5 minutos em água deionizada para retirar o excesso de corante; 17. Colocar o gel no transluminador e analisar as imagens;

18. Recortar as “bandas” de interesse do gel com um bisturi e armazená-las individualmente em tubos de microcentrífuga (1,5mL) contendo 30µL de água deionizada;

19. Armazenar os tubos a 4 °C, durante 24 horas;

20. Centrifugar os tubos a 6.000rpm, por 10 segundos, para que o DNA presente nas “bandas” migre para a água deionizada;

21. Armazenar os tubos em geladeira por no máximo 1 semana.

Tabela 9. Componentes utilizados na preparação das soluções desnaturantes. Concentrações Componentes 0% 30% 40% 60% 70% Acrilamida 40% (mL) 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Solução TAE 50x (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Formamida deionizada (mL) 0 12,0 16,0 24,0 28,0 Uréia (g) 0 12,6 16,8 25,2 29,4

Tabela 10. Volumes das soluções utilizadas para a confecção dos géis de acrilamida com diferentes

gradientes de desnaturação. Concentrações Componentes 0% 30% 40% 60% 70% Solução desnaturante (mL) 3,0 14,0 14,0 14,0 14,0 Persulfato de amônia 10% (µL) 20,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Tetrametiletilenodiamina (TEMED) (µL) 2,0 10,0 10,0 10,0 10,0

4.8.3. Padrões de “bandas” obtidos na DGGE: análise da estrutura das comunidades e estimativa da diversidade microbiana

Os padrões de “bandas” obtidos na DGGE foram utilizados para auxiliar na análise da estrutura das comunidades de bactérias e arquéias, em função da composição e riqueza de espécies, bem como na diversidade entre as comunidades, utilizando o conceito de diversidade beta sugerido por Whittaker9 (1960) apud Odum (1988). A estimativa da diversidade beta foi

9 _{Whittaker, R. H. (1960). Vegetation of the Siskiyou Mountains, Oregon and California. Ecological Monographs, Arizona,}

realizada pela análise de agrupamento do tipo cluster a partir de uma matriz com dados de presença e ausência das “bandas” verificadas em cada amostra. Nesta análise foi utilizada a medida de dissimilaridade de Sorensen (Equação 1), empregada para dados qualitativos, como coeficiente de associação da análise de agrupamento (Magurran, 1989) e o método de ligação baseado na média do grupo (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean - UPGMA), os quais também foram empregados por Nakayama (2005). Toda a análise de agrupamento foi realizada utilizando o programa computacional livre “R” (versão 2.2.1), disponível gratuitamente no sítio eletrônico http://www.r-project.org.

b = Número de espécies da amostra b

j = Número de espécies comuns entre as amostras a e b a = Número de espécies da amostra a

C S = 2 . j . ( a + b ) Onde:

Equação 1:

4.9. Amplificação e purificação do DNAr 16S presente nas “bandas” do gel de