Ensaio de atividade antiproliferativa

Gráfico 3 - Atividade antiproliferativa do óleo de P. cattleyanum sobre células HaCat.

# Sem diferença estatística ao grupo controle não tratado.

O ensaio de atividade antiproliferativa realizado em células HaCat (Gráfico 3) incubadas nas concentrações do óleo essencial de P. cattleyanum (32 mg/ml a 0,5 mg/ml) apresentaram proliferação celular das células HaCat acima de 50% em todas as concentrações testadas (não apresentou IC50), indicando baixa citotoxicidade.

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6 DISCUSSÃO

Devido aos efeitos colaterais dos compostos antimicrobianos sintéticos e o aumento da resistência microbiana frente aos antimicrobianos comerciais atuais, pesquisas com produtos naturais que incentivam a descoberta de compostos ativos com propriedades antimicrobianas têm aumentado nas últimas décadas, haja visto a ausência ou baixos efeitos tóxicos à saúde humana (Bakkali et al.,2008) (Duarte et al., 2005).

O metabolismo secundário das plantas promove a produção de compostos ativos que estão envolvidos em seu sistema defensivo a fim de se obter adaptação a meios inóspitos, conferindo defesa contra insetos nocivos, microrganismos e parasitas ambientais, além da atração de agentes polinizadores para perpetuação das características da espécie. Estes metabólitos são extraídos de diferentes modos e de diferentes partes da planta, mas compõem principalmente os óleos essenciais e extratos produzidos com diferentes veículos.

A cromatografia gasosa do óleo das folhas de P. cattleyanum revelou principalmente, quanto a sua constituição fitoquímica, a presença de três terpernóides: 1,4 Cineol, Tricicleno e Cariofileno. A literatura relata que o 1,4 Cineol e Tricicleno oriundos do óleo de P. cattleyanum apresentam ação antioxidante (Faleiro et al.,2016), 1,4 Cineol e Cariofileno apresentam atividade analgésica (Chavan et al., 2010). O Cariofileno, além de suas propriedades analgésicas apresenta, atividade antitumoral (Park et al., 2011) e atividade antifúngica contra dermatófitos (Yang et al., 2000).

Os demais compostos terpenóides encontrados, β –Pinene, Butirato de Linalol, Ledol, β – Felandreno e α – Terpineol, foram identificados em baixa porcentagem individualmente, totalizando 20,72% da amostra, de maneira que suas atividades medicinais não possam ser consideradas tão efetivas, contudo, de maneira geral, todos os compostos terpenóides são considerados agentes com potencial antimicrobiano, pois apresentam baixo peso molecular e características hidrofóbicas, permitindo assim, a incorporação desses composto à membrana celular e, consequentemente, seu rompimento (Dalleau et al., 2008) (Zore et al., 2011).

Diferentes de nossos resultados onde o 1,4 Cineol e Tricleno foram os mais abundantes compostos identificados, Chalannavar et al. (2012), em estudo que caracterizou a constituição fitoquímica do Psidium cattleyanum var. lucidum por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS), demonstrou que o principal composto terpenóide encontrado na planta cultivada na África do Sul foi o Cariofileno que apresenta efeitos antitumorais e antimicrobianos em potencial. O Cariofileno é presente em outras espécies do gênero Psidium, porém a sua abundância em Psidium cattleyanum var. lucidum torna a espécie um alvo para mais estudos de extração e purificação do Cariofileno, além de aumentar seu interesse comercial.

Essa variação de resultados de constituição fitoquímica no teor e composição do óleo podem ser atribuído a fatores relacionados ao ecotipo, fenófase de coleta e ambiente de cultivo, incluindo temperatura, umidade relativa, irradiância e fotoperíodo. No presente estudo, encontramos diferentes resultados ao apresentados na literatura, podendo ser oriundas de diferentes fatores ambientais e genéticos, diferentes quimiotipos e o estado nutricional das plantas, bem como outros fatores que podem influenciar a composição. Estes resultados mostram que

P. cattleianum var. lucidum é uma espécie com notável variação fitoquímica

(Chalannavar et al., 2012).

Os extratos das folhas de Psidium cattleyanum são relatados na literatura como detentores de ação antibacteriana bem caracterizada (Menezes et al., 2010) (Brighenti et al., 2008), contudo o óleo essencial das folhas de Psidium

cattleyanum, tanto sua variedade de fruto amarelo (P. catteyanum var. lucidum

Hort.) e sua variedade vermelha (P. cattleyanum var. cattleyanum Sabine), encontram seus efeitos antifúngicos relatados de maneira escassa na literatura, sem parâmetros ideais para comparação de resultados, o que indica a necessidade de maiores estudos que venham ampliar os conhecimentos em relação a esses óleos.

A concentração inibitória mínima (CIM) do óleo essencial de P.

cattleyanum sobre as células planctônicas nas cepas padrão de Candida testadas e

nas espécies clínicas de C. albicans, C. krusei e C. tropicalis ocorreu entre 2 mg/ml a 16 mg/ml, com exceção da espécie ambiental C. utilis (0,5 mg/ml). Segundo os

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critérios que avaliam o potencial de aplicação sistêmica de drogas e fitoterápicos descrito por Duarte et al. (2005) e Aligiannis et al. (2001) - que propõem que concentrações inibitórias mínimas de drogas com até 0,5 mg/ml são consideradas com portencial forte, de 0,55 a 1,5 mg/ml são consideradas com potencial moderado e acima de 1,5 mg/ml são consideradas com potencial fraco - nossos resultados demonstram um fraco potencial antifúngico para a aplicação sistêmica do óleo P. cattleyanum sob células planctônicas de Candida spp. padrão, assim como nos espécimes clínicos de C. albicans (16 mg/ml), C. krusei e C. tropicalis (ambas 8mg/ml), com exceção da espécie ambiental C. utilis cujo o CIM de 0,5 mg/ml é considerado moderado. Portanto uma utilização sistêmica do óleo P. cattleyanum nas altas concentrações de CIM apresentadas se demonstra inviável, porém não se pode descartar sua utilização tópica como colutórios e sob o tratamento antimicrobiano de próteses e superfícies.

A concentração fungicida mínima (CFM) do óleo essencial de P.

cattleyanum nas cepas padrão de Candida testadas apresentou-se entre 2 mg/ml a

16 mg/ml, sendo expressa em concentração superior ao CIM, com exceção das cepas de C. albicans 90028 e C. albicans SC5314 cujo a concentração fungicida mínima se iguala à mínima concentração inibitória (16 mg/ml e 8 mg/ml, respectivamente). Nas cepas de origem clínica C. krusei e C. tropicalis apresentaram CFM de 16 mg/ml e apenas C. albicans apresentou o CFM igual ao CIM (16 mg/ml).

Quando comparado ao antifúngico comercial testado, os resultados de CIM do óleo essencial de P. cattleyanum foram menos eficientes aos demonstrados pela Nistatina (0,5 µg/ml a 4 µg/ml) nas Candida spp. testadas, onde o perfil fungicida (CFM) variou de 2 µg/ml a 8 µg/ml entre as cepas de referência e de 4 µg/ml a 8 µg/ml entre as espécies clínicas. O antifúngico Fluconazol apresentou menores CIMs nas cepas padrão (0,0125 µg/ml a 4 µg/ml) e nas cepas clínicas (0,06125 µg/ml e 0,125 µg/m) comparadas às CIMs do óleo de P. cattleyanum e Nistatina nas cepas padrão e cepas clínicas.

Mesmo apresentando valores de CIMs em concentrações acima aos valores de CIMs do antifúngico comercial, o óleo essencial das folhas de P.

cattleyanum não pode ser descartado como fonte de moléculas com atividade

maneira sinérgica e até mesmo antagônicas entre si, diminuindo sua ação antimicrobiana. Em estudos com compostos oriundos de plantas medicinais, outro aspecto a ser levantado é que um composto ou óleo que apresente atividade antimicrobiana fraca sobre células planctônicas possa ser utilizado como componente adjuvante à antimicrobianos comercias (GIbbons, et al, 2005), além também de poder apresentar ação contra fatores de virulência, como por exemplo, combater a capacidade de formar biofilmes em superfícies bióticas e abióticas, ação essa diretamente relacionada à resistência a antifúngicos (Aligiannis et al., 2001).

Biofilmes são um habitat protegido para microrganismos, onde eles estão seguros do tratamento antimicrobiano, criando assim uma fonte de infecção persistente e muitas vezes refratárias ao tratamento. Ramage et al., 2001, em estudo que avaliou a capacidade de formação de biofime de C. albicans, verificou que um biofilme em suas etapas iniciais de estruturação (biofilme em formação) se estabele em 2h de incubação e que em 24h de incubação um biofilme maduro já se encontra estabelecido, porém as propriedades adesivas de C. albicans e, consequentemente sua virulência, se apresentam diferentes entre as cepas (Vargas et al., 1994).

Nos ensaios de viabilidade celular do biofilme em formação e do biofilme maduro de Candida albicans SC5314, mesmo baixas concentrações do óleo testado alteraram a estrutura de ambos os tipos de biofilmes (0,250 mg/ml para o em formação e 1 mg/ml para o maduro) indicando que o óleo das folhas de P.

cattleyanum apresenta atividade antibiofilme de Candida. Esta atividade antibiofime

foi observada por Brighenti et al., 2012, porém em ensaio com o extrato hidroalcoólico de P. catteyanum sob o biofilme de S. mutans - no qual ocorreu a redução da produção de polissacarídeos extracelulares causando assim, a redução da matriz extracelular do biofilme de S. mutans - essa redução, segundo os autores, sugere ser proveniente da inibição da ação de glicosiltransferases.

Ao analisarmos as imagens de MEV que apresentaram modificações da estrutura do biofilme causadas pelo tratamento com o óleo de P. cattleyanum, foram observadas rupturas do envoltório celular, deformidades na superfície das hifas e diminuição da densidade do biofilme (diminuição do hifamento) nas concentrações do óleo em que houve melhor controle da progressão/estruturação do biofilme. Esta

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desestruturação do biofilme apresentada nas imagens de MEV sugerem que o óleo essencial de P. cattleyanum possa atingir estruturas da superfície celular pela inibição da ação de glucosiltransferases e até mesmo pela redução de expressão de genes de fatores de virulência ligados à produção de glucanos e matriz extracelular de leveduras, assim como o extrato hidroalcoólico apresentou atividade antibiofilme de S. mutans (Brighenti et al., 2012).

É sábido pelos conhecimentos já obtidos em relação ao desenvolvimento da estrutura do biofilme, que após a fase de adesão às células do hospedeiro ou superfícies, a Candida albicans prolifera formando microcolônias e começam a produzir a matriz extracelular. Neste momento, a fim de se evitar uma superpopulação e modular a formação do biofilme, surge a ação de mecanismos de comunicação intercelulares (Quorum sensing) que promovem a expressão diferencial de genes. Esses genes são responsáveis na transição de leveduras para hifas, na arquitetura da parede celular e na coesividade do biofilme dada pela matriz, promovendo um crescimento tridimensional da comunidade (Santana et al., 2013).

O biofilme confere à comunidade microbiana maior resistência às drogas, contudo em nosso estudo o óleo essencial das folhas de P. cattleyanum apresentou melhor eficácia contra o biofilme de C. albicans comparado ao seu efeito antimicrobiano considerado fraco sob células planctônicas de C. albicans. A esse fato consideramos que o desempenho antimicrobriano superior do óleo de P.

cattleyanum sobre os tipos de biofilmes testados, sugere que a ação antimicrobiana

conhecida dos terpenos (Zore et al., 2011) presentes no óleo possivelmente foi potencializada por um ação de compostos autoreguladores do biofilme, que passaram a interferir na comunicação intercelular no mesmo, promovendo a diminuição de sua densidade.

Além da ação antimicrobiana e antibiofilme, o óleo de Psidium

cattlleyanum no ensaio de atividade antiproliferativa das células epiteliais humanas

HaCat, em todas as concentrações testadas (32 mg/ml a 0,5 mg/ml), não apresentou IC50, ou seja, foi identificado um aumento na proliferação celular em todas as concentrações acima de 50%, o que sugere que adicionalmente à atividade anticandida o óleo das folhas de P. cattleyanum var. lucidum apresente também uma atividade proliferativa em queratinócitos, caracterizando uma baixa citotoxicidade.

Baghla et al., 2013, estudando o poder de cicatrização e reparação tecidual do extrato aquoso de Psidium quajava, uma outra espécie do gênero

Psidium, verificaram que Psidium quajava apresenta atividade antioxidante potente

por inibir a peroxidação lipídica e aumentar a atividade da Superóxido Dismutase (SOD) e Catalase, além de diminuir o período o de re-epitelização de feridas em ratos ao promover contração da ferida e aumento da resistência à tração. Assim, a atividade de cicatrização de feridas pode ser devido à potente atividade de eliminação de radicais livres causada pelos compostos de Psidium guajava, poder esse que sugere estender-se aos compostos com ação antioxidante de Psidium

cattleyanum, que sobre as células HaCat podem estar atuando como agentes

antioxidantes a ponto de favorecer o aumento de proliferação celular, contudo estudos que verifique o potencial antioxidante do óleo testado ainda são necessários.

Os resultados da presente investigação vão de encontro aos efeitos relatados pela medicina popular descrita para o Araçá-amarelo (Psdium cattleyanum var. lucidum), assim como corroboram com os estudo científicos que comprovam seus efeitos antimicrobianos. Portanto, estudos com óleos essenciais e extratos de plantas medicinais que caracterizem cientificamente seus efeitos medicinais e sua composição fitoquímica devem ser incentivados com o intuito de se propor futuras alternativas clínicas de substâncias/compostos para o combate clínico de infeções, bem como para o controle de crescimento de microrganismos e tratamento de superfície como ação preventiva e profilática ao desenvolvimento de biofilme, com o objetivo de que no futuro, possam ser aplicados na área da saúde de maneira economicamente viável.

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7 CONCLUSÃO

 O OE das folhas de Psidium cattleyanum é biologicamente ativo de maneira dose dependente contra as Candida spp. testadas em estado planctônico.

 O OE das folhas de Psidium cattleyanum é biologicamente ativo nos biofilmes em formação e maduro de C. albicans, controlando a progressão do biofilme e causando a desestruturação do mesmo, respectivamente.

 O OE das folhas de Psidium cattleyanum atua em C. albicans, rompendo a integridade do envoltório celular e modulando a produção de hifas nos biofilmes testados, sugerindo potencial ação regulatória quorum sensing.

 O OE das folhas de Psidium cattleyanum é considerado de baixa citotoxicidade em células HaCat por não ter apresentado IC50.

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