MARCELLE MARIE BUSO RAMOS
ATIVIDADE ANTICANDIDA E CITOTOXICIDADE DO ÓLEO
ESSENCIAL DE PSIDIUM CATTLEYANUM (ARAÇÁ-AMARELO).
Piracicaba
2017
Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Odontologia de Piracicaba
ATIVIDADE ANTICANDIDA E CITOTOXICIDADE DO ÓLEO
ESSENCIAL DE PSIDIUM CATTLEYANUM (ARAÇÁ-AMARELO).
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Biologia Buco-Dental, na Área de Microbiologia e Imunologia.
Orientador: Prof. Dr. José Francisco Höfling ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÂO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA MARCELLE MARIE BUSO RAMOS, ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ FRANCISCO HÖFLING.
Piracicaba
EPÍGRAFE
“Porque Dele, e por meio Dele, e para Ele são todas as coisas. A Ele, pois, a glória eternamente. Amém!” Rom. 11: 36
“Não há acaso, sina, destino, que possa limitar, impedir ou controlar a firme resolução de uma alma determinada” Ella Wheeler Wilcox
À Aquele que está acima de todas as coisas, Deus, que em sua infinita bondade me concedeu o dom da vida, me protegeu e permitiu a superação de desafios,
me indicando sempre um caminho de Paz.
À minha família que amo muito, minha irmã Emmanuelle, meu cunhado André, meu sobrinho João Paulo e meu pai Manoel, que suportam a distância e sem os
quais não poderia eu ter chegado onde estou. Muito obrigada!
Aos que a saudade é eterna e eterno será nosso reencontro: minha mãe Neusa, minha irmã Michelle e meu avô João Buso. Morre a matéria mas o espírito vive.
Obrigada pela proteção e constante exemplo.
Ao companheiro e marido que aceitou o desafio de ser o par de uma
pesquisadora/professora, Marcos Rosse. Obrigada por sempre me apoiar na vida da academia e suportar minha ausência! Obrigada pela paz, pelo seu amor tão
gratuito, pelos “puxões de orelha” que me tiram do computador. Quão bom é compartilhar a vida com você!
Ao orientador e amigo José Francisco Höfling, por ter aceitado o desafio de me orientar em um momento tempestuoso. Admiro sua coragem e conhecimento. Obrigada pela confiança a mim dada, pelo incentivo científico e pelo crescimento
humano proporcionado, os quais me deram suporte para superar os obstáculos. Obrigada por sempre se importar com o futuro de seus orientados!
AGRADECIMENTOS
À Universidade de Campinas- UNICAMP - Faculdade de Odontologia de Piracicaba e ao Programa de Pós-graduação em Biologia Buco-Dental na pessoa de sua
coordenadora, Profa. Dra. Maria Beatriz Duarte Gavião, pela oportunidade de
realização do Curso de Doutorado em Biologia Buco-Dental, área de Microbiologia e Imunologia.
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP - Faculdade de Odontologia de Araçatuba por minha formação e ao Laboratório de Microbiologia, em particular aos exemplares Prof. Elerson Gaetti Jardim Júnior e Profª. Ana Cláudia
Okamoto pela confiança e parceria na doação das cepas clínicas utilizadas neste estudo.
Ao Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas – CPQBA/UNICAMP, na pessoa da Profª. Drª. Mary Ann Foglio, pela análise
cromatográfica do óleo essencial de P. cattleyanum.
Ao Prof. Jacks Jorge Júnior, obrigada pela disponibilidade, paciência e pelas orientações na confecção do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) com a implementação do Biorrepositório, assim como todos da equipe do CEP-FOP.
À equipe da Coordenadoria de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba - UNICAMP, especialmente à coordenadora Profa. Cínthia Pereira
Sant'ana e Janaína de Cassia Orlandi Sardi, e aos membros suplentes Ana Cláudia Okamoto, Natália Leal Vizoto e Karina Cogo Müller. Obrigada pela parceria científica, disponibilidade e pelos preciosos ensinamentos e correções deste
trabalho.
Às amigas e pós-graduandas da área de Microbiologia e Imunologia, Simone Nataly Busato de Feiria, Giovana Cláudia Boni e Thaís Oliveira Rossini, que vivenciaram de perto meus momentos no doutorado, sempre me incentivando e me dando suporte.
Agradeço em especial à Simone, pelo sentimento de irmã de coração construído neste período e que levarei para a vida toda!
Aos pós-graduandos e demais pesquisadores da Área de Microbiologia e Imunologia pela amizade compartilhada durante o período de pós-graduação principalmente ao
Jeferson da Silva Júnior, Janaína Priscila Barbosa, Natália Leal Vizoto, Paula Cristina Anibal, Lívia de Araújo Alves, Felipe Joia, Talita Graziano, Danielle Puppin,
Rodrigo Bassi e Prof. Rafael de Nobrega Stipp.
Aos amigos e técnicos do Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP, Anderson Laerte Teixeira e Valéria Franco, e à secretária da Área de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP, Ivete Ribeiro. Ao amigo e técnico do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Odontologia e Araçatuba - UNESP,
Robson Varlei Ranieri. Obrigada pelo companheirismo e suporte à pesquisa.
Aos tios queridos e participativos em meu crescimento Irani Buzzo e José Carlos Vidotto, obrigada pelo apoio e incentivo de sempre!
Aos parentes amados que se acostumaram com a ausência mas que sempre estão presentes: minha sogra Dirce e meu sogro Aristides, meus cunhados Silvia, Wilson, Marcelo e Tamires, além de meus sobrinhos Lucas, Artur e Pedro.
Obrigada por todo o apoio!
Aos amigos que Deus preparou para convivermos como família em minha nova morada: Adelaide, Paulo e Júlia; Keiti, Karen, Davi e Kléber; Noemia e Leones. Obrigada por todos os momentos de descontração, pelo companheirismo, pelos
desabafos e pela amizade. Somos uma grande família!
À irmã na fé e mãe de coração Teresa Nunes, que juntamente com os demais irmãos da Sã Doutrina Espiritual do Sétimo Dia de Rio Claro - SP e de Piracicaba
- SP, acolheram eu e meu esposo com um amor incondicional.
Ao cãozinho Bob, cuja a inocência e amor são sempre presentes. Até mesmo nos momentos mais difíceis seu companheirismo é balsamo e sândalo para o
espírito.
À Microbiologia e à Imunologia, ciências apaixonantes que completam minha existência e que situam minha função neste mundo.
À Odontologia que me ofereceu a base profissional e realização pessoal, além de me dar oportunidade de exercer o amor ao próximo a cada paciente.
A CAPES e ao CNPq pela concessão de Bolsa de Estudo, suporte à pesquisa e financiamento para participação em congressos.
preliminares.
Aos pacientes envolvidos na pesquisa, mesmo que indiretamente, pela participação e contribuição com o desenvolvimento da ciência.
E aos que de alguma forma contribuíram e me auxiliaram na realização dessa tese de doutorado.
RESUMO
Psidium cattleyanum apresenta efeitos antibacterianos demonstrados na
literatura, porém pouco se sabe sobre sua ação antifúngica e citotóxica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antifúngica do óleo essencial de folhas de Psidium cattleyanum var. lucidum Hort em cepas padrão de Candida spp. e cepas clínicas de C. albicans, C. krusei e C. tropicalis. O óleo essencial estudado foi caracterizado por Cromatografia Gasosa (CG) e sua concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada por microdiluição seriada (CLSI, 2008) nas cepas padrão, espécimes clínicos e grupos controles, dos quais três concentrações acima das CIMs foram plaqueadas para se obter a concentração fungicida mínima (CFM). Os antifúngicos comerciais Nistatina e Fluconazol como parâmetros de susceptibilidade para MIC e MFC. O óleo de P. cattleyanum foi testado nos biofilmes de C. albicans SC5314 em formação e maduro e suas respectivas viabilidades celulares foram obtidas pelo corante XTT e leitura em Espectrofotômetro de Microplaca. Imagens dos biofilmes testados e tratados com o óleo foram capturadas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A atividade antiproliferativa do óleo em células HaCaT foi realizada. Todos os ensaios foram feitos em três experimentos independentes. As análises estatísticas foram feitas pelo teste ANOVA um critério, variação Dunnett. Os compostos mais encontrados pela CG foram 1,4 - cineol (33,19%), tricicleno (27,05%) e o cariophileno (18,94%). P. cattleyanum apresentou CIMs nas cepas padrão de C. albicans 90028 e C. albicans SC5314 de 16 mg/ml e 8 mg/ml, respectivamente, porém em C. albicans 562 apresentou CIM de 8 mg/ml e CFM de 16 mg/ml. Nas demais espécies padrão, com exceção de C. lusitaniae 06 com CIM e CFM de 4 mg/ml, o óleo apresentou as CFMs superiores às CIMs. Nas cepas clínicas P. cattleyanum apresentou em C. albicans CIM e CFM de 16mg/ml, enquanto que em C. krusei e C. tropicalis as CIMs foram de 8 mg/ml e as CFMs de 16 mg/ml. As concentrações de CIMs para o antifúngico Nistatina variaram nas cepas padrão entre 0,5 a 8 µg/ml e apresentou CFMs entre 4 e 8 µg/ml, enquanto que nas cepas clínicas as CIMs foram de 2 a 4 µg/ml e as CFMs de 4 a 8 µg/ml. Nos testes com o Fluconazol as CIMs nas cepas padrão foram 0,03125 a 2 µg/ml, enquanto nos espécimes clínicos as CIMs foram de 0,03125 a 0,5 µg/ml. P. cattleyanum mostrou ação antibiofilme no biofilme em formação de
viabilidade celular de 18,9% (p<0,01). O MEV revelou nos biofilmes testados de C.
albicans desestruturação do biofilme, diminuição da densidade de hifas, morfologia
anormal de hifas e, no biofilme em formação, rupturas do envelope celular. A atividade antiproliferativa de P. cattleyanum não apresentou IC50 nas HaCat em todas concentrações, sugerindo baixa citotoxicidade. P. cattleyanum é biologicamente ativo contra as Candida spp. e apresenta atividade antifúngica, antibiofilme de Candida e baixa citotoxicidade, constituindo assim um potencial agente antimicrobiano de uso clínico.
ABSTRACT
The antibacterial effects of Psidium cattleyanum are widely described; however, few investigations characterize its antifungal and cytotoxic action. The aim of this study was to verify the antifungal activity of the essential oil from leaves of
Psidium cattleyanum var. lucidum Hort against Candida spp. Gas Chromatography (GC) characterized the essential oil and the its minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by serial microdilution (CLSI, 2008) in the standard strains, clinical specimens and control. Oil concentrations above the MICs were plated to obtain minimum fungicidal concentration (MFC). Nystatin and Fluconazole were used to check the fungal susceptibility for MIC and MFC. The essential oil of P. cattleyanum was tested on early and mature C.
albicans SC5314 biofilms stained with XTT; their cellular viability was determined
using Reader Microplate Spectrophotometer. Early and mature biofilms images were captured by Scanning Electron Microscopy (SEM). The anti-proliferative activity of the oil in HaCaT cells was tested. Data were submitted to one-way ANOVA test, Dunnett variation. The most prevalent compounds (GC) were 1,4-cineole (33.19%), tricyclene (27.05%) and cariophilene (18.94%). In the standard strains, P. cattleyanum presented MICs of 16 mg/mL and 8 mg/mL for C. albicans 90028 and C. albicans SC5314, respectively. C. albicans 562 showed a MIC of 8 mg/mL and MFC of 16 mg/mL. The others standard species, except C. lusitaniae 06, showed MFC values above those of MIC. In clinical specimens, P.
cattleyanum presented a MIC and MFC of 16 mg/mL for C. albicans, whereas C. krusei and C. tropicalis showed a MIC of 8 mg/mL and MFC of 16 mg/mL. In the
standard strains, the MIC and MFC for Nystatin varied from 0.5 to 8 μg/mL and 4 to 8 μg/mL, respectively, while in the clinical specimens, the MIC ranged from 2 to 4 μg/mL and the MFC from 4 to 8 μg/mL. In the standard strains, Fluconazole showed MIC values between 0.03125 μg/mL and 2 μg/mL, while the clinical specimens showed MICs between 0.03125 μg/mL and 0.5 μg/mL. P. cattleyanum oil at 0.250 mg/mL showed the best antibiofilm activity for C. albicans with 9.5% cell viability (p <0.01) in the early biofilm. In the mature biofilm, P. cattleyanum oil at 1 mg/mL disrupted the biofilm structure, with cell viability of 18.9% (p <0.01). In early and mature biofilms of C. albicans, SEM revealed biofilm disorganization, reduction in hyphae density, abnormal morphology of the hyphae, and, in early
against Candida spp. and could be used as a potential clinical antimicrobial agent.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIDS - Acquired Immunodeficiency Syndrome ATC – Ácido Triclocoacético
CBS - Centraal Bureau voor Schimmelcutures
CDC - E.U.A - Centers for Disease Control and Prevention – Estados Unidos da
América
CEP – Comitê de Ética em Pesquisa CFM - Concentração Fungicida Mínima
CG/EM - Cromatografia Gasosa com Espectrometria De Massas CiBio – Comitê Interno de Biossegurança
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Clinical Laboratorial Standart Investigation
CPQBA - Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas DMSO - Dimetil sulfóxido
DO - Densidade Óptica ECM – Extracellular Matriz
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay h - horas
HIV - Human Immunodeficiency Virus IZ - Instituto Zimotécnico-ESALQ/USP
KPC – Klebsiella pneumoniae resistente a Carbapenemicos LSD - Dietilamida do Ácido Lisérgico
MEC – Matriz Extracelular
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura mg - miligramas
ml – mililitros
MRSA – Staphilococcus aureus resistente a Meticilina OE – Óleo essencial
OMS – Organização Mundial da Saúde PBS - Phosphate Buffered Saline
PGA – Fosfoglicerato PMA - Polimetilmetacrilato
RMS - Reader Microplate Spectrophotometer
RPMI–1640 - Meio de cultura desenvolvido por Roswell Park Memorial Institute SAP - Secreted Aspartyl Proteinase
SFB - Soro Fetal Bovino
SIDA - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida SRB - Sulforrodamina B
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido µg – microgramas
var. – variedade
VRSA – Staphilococcus aureus resistente a Vancomicina WHO – World Healthy Organization
XTT-2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide YPD - Yeast Peptone Dextrose
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Araçá-amarelo (Psidium cattlyanum var. lucidum). 24
Figura 2 - Esquema de Formação de biofilme por Candida spp. 35
Gráfico 1 - Viabilidade celular do biofilme em formação de C. albicans SC5314
tratados com óleo essencial de P. cattleyanum. 48
Gráfico 2 - Viabilidade celular do biofilme maduro de C. albicans SC5314 tratados com óleo essencial de P. cattleyanum. 49
Figura 3 - Imagens de M.E.V. do biofilme em formação de C. albicans SC5314 tratados com óleo essencial de P. cattleyanum. 50
Figura 4 - Imagens de M.E.V. do biofilme maduro de C. albicans SC5314 tratados com óleo essencial de P. cattleyanum. 51
Gráfico 3 - Atividade antiproliferativa do óleo essencial de P. cattleyanum em
Tabela 1 - Compostos do óleo essencial de Psidium cattleyanum identificados por
CG/EM. 46
Tabela 2 - Concentração mínima inibitória e concentração fungicida mínima do óleo essencial de P. cattleyanum, Nistatina e Fluconazol em Candida spp. 47
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 20 2 REVISÃO DA LITERATURA 23 3 PROPOSIÇÃO 36 4 MATERIAL E MÉTODOS 37 5 RESULTADOS 46 6 DISCUSSÃO 53 7 CONCLUSÃO 59 REFERÊNCIAS 60 ANEXOS 70ANEXO 1 – Comitê de Ética Em Pesquisa – FOP/UNICAMP. 70 ANEXO 2– Declaração de Autorização para Uso de Cepas de Microrganismos – FOA/UNESP. 75
ANEXO 3 - Picos cromatográficos (CG/EM) do óleo essencial de Psidium
cattleyanum var. lucidum. 76 ANEXO 4 - Compostos, Índices de Retenção e suas porcentagens identificados no óleo essencial de Psidium cattleyanum através de Cromatografia Gasosa em aparelho com Espectrometria de Massas (CG/EM). 77
1 INTRODUÇÃO
Os efeitos das plantas medicinais no tratamento de doenças/infeções são culturalmente apreciados e aplicados por diversas civilizações. A vasta biodiversidade de espécies e os diferentes biomas pertencentes ao território brasileiro transforma o Brasil em um verdadeiro celeiro de plantas medicinais que, associadas a uma rica diversidade étnico-cultural, compõem um valioso conhecimento tradicional e popular do uso das plantas medicinais (Bakkali et al., 2008).
A Organização Mundial da Saúde (OMS), desde 1979, incentiva que seus países membros estabeleçam políticas públicas para o desenvolvimento da chamada medicina tradicional incentivando o uso de plantas medicinais localmente e popularmente utilizadas na atenção à saúde primária e preventiva (WHO,1079a). Em 2002, um novo documento da OMS relata que um terço da população mundial não tem acesso periódico a medicamentos essenciais, sendo necessário que se invista na medicina tradicional como forma de ajudar a melhorar o status sanitário, reafirmando a necessidade do emprego das plantas medicinais na atenção básica à saúde (WHO, 2002b).
As plantas medicinais culturalmente associadas à um efeito curativo ou paliativo são estudas pela etnobotânica, que trabalha em estreita cumplicidade com a etnofarmacologia, a qual consiste na exploração científica de compostos e agentes biologicamente ativos, tradicionalmente empregados ou observados pelo homem (Amoroso, 1996). Estudos envolvendo a investigação de princípios oriundos de plantas medicinais popularmente empregadas avançaram nas últimas décadas na tentativa de se caracterizar cientificamente os possíveis efeitos benéficos e efeitos colaterais, bem como a determinação de uma dose de uso segura de produtos derivados das plantas medicinais (Bakkali et al.,2008).
Dentre as famílias de plantas com propriedades medicinais, destaca-se a família Myrtaceae, cujo gênero Psidium agrega espécies frutíferas populares com efeitos medicinais como a Psidium guajava, a popular goiaba. Contudo, a espécie Psidium cattleyanum, conhecido como Araçá-amarelo, vem
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sendo estudada nas últimas décadas por deter efeitos medicinais analgésicos (Alvarenga et al., 2013), antiproliferativos (Medina et al., 2011; Jun et al., 2011; Faleiro et al., 2016), antioxidantes (Medina et al., 2011; Faleiro et al., 2016), anticâncer (Faleiro et al., 2016) e antimicrobianos (Brighenti et al., 2012). Na medicina popular P. cattleyanum é conhecido por sua atuação frente a diabetes, dores de barriga, doenças das vias urinárias e diarréia, onde recomenda -se o uso de brotos, folhas e a casca do tronco (Vendruscolo e Mentz 2006) (Boscolo e Senna Valle, 2008).
O aumento das investigações sobre a ação de plantas medicinais como agente antimicrobianos está altamente relacionado com o surgimento das chamadas superbactérias da família Enterobacteriaceae resistentes a Carbapenemicos (Klebsiella pneumoniae - KPC) e a ocorrência de infecções por Staphylococcus
aureus resistentes a Meticilina/Vancomicina (MRSA/VRSA) (Hiramatsu, 2001) A
multirresistência à drogas apresentadas por essas superbactérias marcam o início da era Pós-antibiótica no mundo, onde a escassez de fármacos eficazes e o aumento da resistência aos antimicrobianos existentes no mercado levou a indústria farmacêutica a pesquisar novas fontes de moléculas antimicrobianas (CARS, et al., 2013). Em microrganismos eucariotos, o surgimento de resistência aos antifúngicos por espécies de Candida é relacionado com a prescrição de altas doses de antifúngicos (Johnson et al., 1995) e pela administração de antifúngicos por longos períodos de internação do paciente (Ruhnke et al., 2000).
Espécies do gênero Candida, principalmente Candida albicans, estão presentes na boca, estômago e intestino de maneira comensal e oportunamente causam a Candidose quando o hospedeiro demostra debilidade imunológica associada ou não ao tratamento de uma doença base. (Nobile & Johnson, 2015). Modificações ambientais na boca podem também favorecer a proliferação e estabelecimento das Candidoses. Pacientes portadores de próteses bucais totais e parciais são propícios a desenvolverem Candidose bucal, pois a idade e baixa imunidade dos pacientes usuários de prótese aliada a uma má higienização da prótese/boca passam a favorecer a proliferação fúngica, tornando as próteses bucais verdadeiros reservatórios de fungos (Barbeau et al., 2003)
Em pacientes portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) não medicados por antirretrovirais é frequente a ocorrência da Candidíase Pseudomembranosa, sendo este um estabelecido sinal clínico indicativo do estágio avançado de imunocomprometimento e alta carga viral do paciente soro positivo (Cavassani et al., 2002). Outra parcela de pacientes imunologicamente debilitados susceptíveis a desenvolveram Candidíase se encontra entre pacientes hospitalizados, os quais recebem a administração de agentes polienos (nistatina e anfotericina B) e de triazóis (fluconazol) na forma tópica, por via oral e até mesmo endovenosa. Contudo, em pacientes hospitalizados já foram relatados o isolamento de cepas do gênero Candida resistentes ao fluconazol (Ruhnke et al., 2000).
Neste cenário, a utilização de plantas medicinais com efeitos popularmente conhecidos para tratamento de infecções passou a ganhar protagonismo em estudos que envolvam extratos e óleos essenciais extraídos de plantas medicinais, na tentativa da descoberta e aplicação de novas moléculas antimicrobianas e/ou moléculas coadjuvantes aos antimicrobianos existentes no mercado (Gibbons, et al, 2005).
Os efeitos antimicrobianos da folha de Araçá-amarelo (Psidium
cattleyanum var. lucindum Hort) recentemente foram avaliados por Gaetti-Jardim
et al (2009) e Brighenti et al (2008 e 2012), os quais demonstraram, em estudos “in vitro”, a ação antibacteriana dos extratos aquoso e hidroalcoólico de folhas de Araçá-amarelo contra microrganismos orais. Entretanto, estudos envolvendo a susceptibilidade de microrganismos orais, principalmente do gênero Candida, ao óleo essencial extraído das folhas de Psidium cattleyanum var. lucindum Hort
(Araçá-amarelo), bem como estudos que contemplem a indicação dos compostos
químicos que possam estar relacionados com a ação antimicrobiana oriundos desse óleo essencial se encontram em escassez na literatura, necessitando de maiores caraterizações da ação antifúngica deste óleo essencial sobre a biologia do gênero Candida e sua possível citotoxicidade celular sobre o indivíduo.
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2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Origem e efeitos medicinais do Psidium cattleyanum (Araçá-amarelo).
O gênero Psidium tem sua distribuição nativa percorrendo o sul do México até a Argentina, incluindo as Ilhas do Caribe e os arquipélagos de Galápagos e Revillagigedo ao longo do Oceano Pacífico. Fruto do sucesso adaptativo do gênero em variados habitats, a diversidade de espécies de
Psidium se apresenta em centros geográficos que se estendem das Ilhas de
Cuba e Hispaniola passando pelo norte da América do Sul (Peru, Venezuela e Guianas) até chegar ao Sul do Brasil e Paraguai, caracterizando assim o gênero como Neotropical (Frazon et al., 2009).
Pertencente à família das Myrtaceae (que inclui Eugenia, Acca e
Myrciaria), o gênero Psidium apresenta espécies frutíferas de importância
comercial como a goiabeira (Psidium guajava) e os araçás ou araçazeiros (Psidium cattleyanum e Psidium guineense). O nome araçá vem do tupi ara’as, ou do guarani ara (céu) e aza (olho), que significa fruta com olhos ou olhos voltados ao céu, característica que remete ao formato do fruto (Foto 1) (Biegelmeyer et al.,2011).
O Psidium cattleyanum apresenta frutos de cor amarela ou vermelha (Correa, 1926), porém alguns autores o descreve como produtora de frutos somente amarelos (Mattos, 1978). Em recente estudo, Rocha et al., 2008, demonstrou diferenças estruturais na organização do caule da planta definindo assim duas variedades botânicas (dois táxons) a serem consideradas: o Psidium
cattleyanum variedade cattleyanum como produtora de frutos vermelhos e Psidium cattleyanum var. lucidum como produtora de frutos amarelos
Figura 1: Araçá-amarelo, P. catteyanum var. lucidum.
Fonte: http://www.floriculturaursula.com.br/
Em ambas as variedades, a floração estende-se de setembro a março, podendo entrar em até três períodos de floração dependendo da região em que se encontra (quanto menos rigoroso o outono, maior possibilidade d a terceira floração e frutificação). As flores hermafroditas apresentam coloração branca e as folhas são simples e opostas, de superfície lisa e brilhosa (Frazon et al., 2009).
Dentre as propriedades medicinais, o Araçá é uma fruta rica em minerais como o cálcio, o ferro e o fósforo. Possui ainda um alto teor de vitaminas A, B, C, antioxidantes, carboidratos e proteínas, sendo indicado para tratamentos contra a gripe e resfriados (Wille et al., 2004). É uma fruta mucilaginosa e adstringente, constituídas por compostos bioativos, como carotenoides e antocianinas (Fetter et al., 2010).
Devido aos seus minerais e propriedades medicinais, plantas de
Psidium spp. são utilizadas pela medicina popular como hemorrágica e
anti-inflamatória na China, para o tratamento de escorbuto na Ásia e África, para tratamento de tosse e doenças pulmonares na Bolívia e Egito, como calmante e antidiarreico no México (Lozoya, et al., 1994) (Jaiarj et al., 1999) e para doenças gastrointestinais no Brasil (Giraldi & a Hanazaki, 2010).
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2.2 Constituição fitoquímica e ação antimicrobiana do Psidium cattleyanum.
As plantas medicinais são consideradas úteis na cura e prevenção de uma grande parcela de doenças, principalmente as infecciosas, por conter uma fonte rica de agentes antimicrobianos em sua composição (Holetz et al., 2002). Devido a um aumento rápido da taxa de infecções, aumento da resistência aos antibióticos por microrganismos antes susceptíveis e os efeitos secundários dos antibióticos sintéticos, as plantas medicinais estão ganhando popularidade como precursoras de compostos bioativos em medicamentos nas diversas áreas da saúde (Smullen, et al., 2007) (Jebashree et al., 2011).
Os recursos vegetais para fins medicinais é usado em todas as civilizações e culturas e, portanto, as plantas têm desempenhado um papel fundamental nos sistemas de saúde em todo o mundo. Na Odontologia, por exemplo, é comum o emprego de compostos bioativos como a Benzoína derivada da planta Estoraque (Styrax tonkinensis) que exibe ação desinfetante em cremes dentais e do Eugenol que é derivado do Cravo-da-india (Syzygium aromaticum) e comumente utilizado no dia a dia na prática clínica juntamente com o Óxido de Zinco no capeamento pulpar, na obturação temporária de cavidades, na cimentação provisória de peças protéticas, como cimento cirúrgico e para aliviar a dor (Kabra et al., 2012).
Os compostos bioativos secundários em plantas são oriundos do metabolismo secundário, o qual não está envolvido nas vias metabólicas essenciais para a vida da planta, porém desempenham o papel de defesa nas plantas, ou seja, são metabólitos secundários que constituem um meio de defesa contra bactérias, fungos, vírus, estresse ambiental e ataque de herbívoros (Müller et al., 2012), além de participarem na atração de agentes polinizadores. Estes compostos bioativos secundários se dividem basicamente em três tipos: terpenos, compostos fenólicos e alcaloides os quais são oriundos do metabolismo do Piruvato 3PGA e da Via do Mevalonato, da Via do Mevalonato e Via do Ácido Chiquímico, e da Via do Ácido Chiquímico, respectivamente (Simões et al, 2004).
Os compostos fenólicos são os maiores responsáveis pela atividade antioxidante em frutos, fazendo destes uma fonte natural de antioxidantes. Estes
compostos são substratos para enzimas responsáveis pelo escurecimento dos vegetais frescos e alimentos processados. Suas moléculas possuem ao menos um grupo hidroxila ligado diretamente a um anel aromático, podendo formar compostos fenólicos simples até estruturas mais complexas. Esse grupo compreende os flavonoides, ácidos fenólicos, estilbenos e polifenóis (Angelo e Jorge, 2007). Em relação a atividade antimicrobiana, os compostos fenólicos atuam na degradação da parede celular bacteriana, danos à membrana citoplasmática, extravasamento de material celular, coagulação do citoplasma e à desregulação do sistema de transporte de íons e elétrons no sistema membranário, sendo que o rompimento da membrana citoplasmática leva a saída de elementos vitais e a entrada de substâncias nocivas a célula bacteriana (Burt, 2004) (Tavares, 1999).
Os compostos secundários alcalóides são compostos orgânicos que apresentam um átomo de Nitrogênio em seu anel e exibem um caráter alcalino, com excessão da colchinina. São famosos pela presença de atividade sobre o Sistema Nervoso Central, sendo utilizados desde a antiguidade como venenos e alucinógenos, e dos dias atuais, de forma benéfica (como a cafeína e morfina) e de forma maléfica (cocaína e base para drogas sintéticas como LSD) (Simões et al., 2004).
Nos óleos essenciais, o grupo de compostos com atividades medicinais encontrados são os terpenóides. Os óleos essenciais, ou essências são princípios aromáticos encontrados em diferentes órgãos vegetais. Por evaporarem quando expostos ao ar em temperatura ambiente, são também chamados óleos voláteis ou óleos etéreos e esta característica é que confere o odor característico dos vegetais, tanto para atração dos polinizadores como repelente de insetos e herbívoros. Quimicamente, são misturas de diversos compostos, os quais podem ser divididos em dois grandes grupos: os derivados terpênicos (mentol e citronelol) e os derivados do fenilpropano (anetol e eugenol). As principais características farmacológicas dos terpenos nos óleos essenciais estão relacionadas ao emprego como antisséptico, anti-inflamatório e antipirético (Simões, et al., 2004).
Os terpenóides mais encontrados em óleos esseciais são os monoterpenos e os sesquiterpenos. Segundo Zore et al, 2011, os mecanismos antimicrobianos apresentados pelos compostos terpenóides envolvem a fluidificação
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da membrana, desestabilização das proteínas de ligação à membrana envolvidas em sinalização e ancoragem, estacionamento do ciclo celular e consequente apoptose, porém estudos mais aprofundados devem ser realizados para se caracterizar detalhadamente esses mecanismos.
Os principais substratos das plantas utilizados para a obtenção do óleo essencial e de extratos alcoólicos e hidroalcoólicos são as folhas, fruto, casca, caules, raízes/tubérculos e flores. Na família das Myrtaceae, o óleo essencial está geralmente concentrado nas folhas, tornando-as alvo principal da técnica de hidrodestilação para obtenção do óleo essencial (Siani et al., 2000).
Em 2007, Paroul et al. identificaram por Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG/EM) como principais componentes do óleo essencial de folhas de Psidium cattleyanum (Araçá-Amarelo) os compostos pertencentes aos grupos funcionais de sesquiterpenos (63%), sesquiterpenos oxigenados (15,1%) e monoterpenos oxigenados (12,5%), sendo que, dentre as 25 substâncias identificadas, as marjoritárias foram o 1,8-cineol e o trans-cariofileno com 11,9% e 20,2%, respectivamente.
No trabalho de Marques et al. (2011), a comparação da composição do óleo essencial de folhas de P. cattleyanum oriundas de Cuba com a variante do Brasil demonstraram diferenças de composição através da análise por CG/EM. Na variante brasileira, foram obtidos 33 componentes que correspondiam a 96,9% do óleo. Os principais constituintes do óleo essencial foram α-thujene (25,2%), seguido pelo 1,8-cineole (16,4%) e β-caryophyllene (10,2%). Em contrapartida, a variante cubana apresentava diferentes compostos, sendo Epi-α-muurolol (21,9%) o mais abundantes, seguido por α-cadinol (20%) e Epi-α-cadinol (16,7%). Portanto, fica evidente que P. cattleyanum produz diferentes metabólitos voláteis em resposta a diferentes caraterísticas físicas e atmosféricas de cada tipo de ecossistema, região de crescimento e período do ano que foram feitas as coletas.
Na literatura, P. cattleyanum teve seu óleo essencial estudado quanto a sua propriedade antimicrobiana não apresentando os efeitos desejados, no entanto, o extrato produzido com acetato de etila apresentou ação moderada contra bactérias Gram positivas com CIM igual a 62,5 μg/ml (Desoti et al., 2011) (Prestes et al.,
2011). Estes resultados opostos podem estar relacionados com o método extrativo e o solvente utilizado no processo, já que os autores utilizaram solventes e métodos extrativos distintos, o que pode ter influenciado no isolamento dos compostos bioativos e na determinação das propriedades dos vegetais (KOBA et al., 2007).
Alterações climáticas, temporais ou ambientais como sazonalidade, desenvolvimento, altitude, ritmo circadiano, temperatura, disponibilidade hídrica, nutrientes, radiação ultravioleta, poluição atmosférica e ataque de patógenos são alguns fatores que podem modificar a produção de compostos bioativos e influenciar na resposta esperada, produzindo assim uma diversidade de resultados observados nos estudos conduzidos por outros pesquisadores (Gobbo-Neto e Lopes, 2007).
2.3 Características do gênero e infecções oportunistas por Candida spp.
As infecções bucais costumam ter caráter multimicrobiano devido a cavidade bucal albergar uma ampla variedade de microrganismos comensais e transitórios em variados habitats ecológicos com diferentes desafios ambientais limitantes (atmosfera, pH, agentes oxidantes, imunoglobulina e saliva), os quais exercem uma pressão seletiva das espécies nos diferentes habitats bucais (Jenkinson & Lamont, 2005). Espécies altamente adaptadas colonizam as superfícies de dentes, mucosas, dorso da língua e sulco gengival causando infecções bacterianas como a Cárie, Doença Periodontal, bem como infecções fúngicas oportunistas causadas principalmente por fungos do gênero Candida (Ghannoum et al., 2010).
As 200 espécies do gênero Candida pertencem ao Reino Fungi, divisão Eumycota, subdivisão Deuteromycotina, classe Blastomycetes e família
Cryptococcaceae, embora algumas espécies estejam agrupadas na subdivisão Ascomycotina. O gênero Candida compreende microrganismos eucarióticos não
produtores de pigmentos fotossintetizantes que possuem envoltório celular rígido formado pela parede celular composta por quitina e membrana plasmática fosfolipídica contendo esteróis, com predomínio do ergosterol (Santana et al., 2013).
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As Candida spp. utilizam como fonte nutricional a degradação de proteínas e carboidratos para a captação de Carbono e Nitrogênio provenientes dos mais variados ecossistemas que o gênero pode habitar, como o solo, alimentos, água, superfícies abióticas, além de fazer parte da microbiota da pele e mucosas de homens e animais. São microrganismos comensais, que habitam primariamente o trato gastrointestinal, fazendo parte também da m icrobiota vaginal, da uretra e dos pulmões (Santana, et al., 2013).
As espécies de Candida fazem parte da microbiota comensal nas superfícies das mucosas e pele de seres humanos e apenas 10% destas leveduras são reconhecidas como agentes etiológicos em infecções humanas (Alonso-Valle et al., 2003). Atualmente estima-se que de 20 a 50% da população alberga microrganismos do gênero Candida na cavidade bucal, sendo C.
albicans identificada entre 60 a 90% dos isolamentos, C. tropicalis cerca de 7%,
outras espécies como C. krusei, C. guillermondii, C. glabrata e C. parapsilosis são evidenciadas em menor frequência (Valle et al., 2010).
Candida spp. colonizam a superfícies de mucosas e pele de maneira
comensal, contudo podem se tornar patogênicas caso ocorra um desequilíbrio em sua relação com o hospedeiro, por isso são consideradas oportunistas sendo responsáveis por 80% dos casos de infecção fúngica sistêmica (Candidemias). Essa modificação do perfil patogênico do gênero Candida ocorre devido ao comprometimento dos mecanismos de defesa do hospedeiro (extremos de idade, doença de base, imunossupressão) ou rompimento das barreiras anatômicas, como queimaduras, cateteres ou cirurgias invasivas (Calderone et al., 2001).
Candida albicans é a espécie de maior relevância em função da sua
prevalência tanto em hospedeiros hígidos como aqueles com algum comprometimento imune (Valle et al., 2010). C. albicans é uma levedura comensal facilmente encontrada na mucosa bucal, trato gastrointestinal, trato urogenital e pele de seres humanos desde o nascimento, mas em circunstâncias excepcionais quando ocorre uma ruptura do equilíbrio biológico devido a fatores predisponentes - patológicos, fisiológicos, imunológicos e mecânicos – pode haver um aumento na multiplicação e invasão dos tecidos por estes
microrganismos, ocasionando infecções denominadas candidoses (Vandeputte et al., 2012).
Em infecções fúngicas provocadas por Candida, a identificação de sua espécie é essencial, uma vez que a patogenicidade e o perfil de sensibilidade a um determinado antifúngico são variáveis entre as diferentes espécies. Apesar de a Candida albicans ser a espécie mais comumente isolada nas infecções superficiais ou invasivas, a incidência de infecções provocadas por Candida
não-albicans é crescente e, em alguns casos, associada a altas taxas de mortalidade
(Urizar et al., 2002). Estudos recentes apontam as espécies de C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. glabrata e C. krusei como as espécies não-albicans mais
frequentes em processos infecciosos (Valle et al., 2010) (Urizar et al., 2002).
Nos últimos 10 anos, alguns estudos relataram uma mudança na etiologia das candidemias. Enquanto C. albicans ainda é considerada a espécie mais comum causando candidemia, taxas crescentes de candidemias causadas por C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. krusei têm sido relatadas em todo o mundo. As razões para o aumento de infeções por espécies não-albicans não são completamente compreendidas, mas algumas condições médicas podem impactar de forma consistente o risco de desenvolver candidemia por espécies não-albicans. A fungemia por C. parapsilosis tem sido associada com cateteres vasculares e nutrição parenteral, a candidemia por C. tropicalis está associada ao câncer e neutropenia, e as fungemias de C. krusei e C. glabrata estão associadas à exposição prévia a azóis (Hinrichsen et al., 2008).
A Vigilância e Controle Brasileiro de Patógenos de Importância Epidemiológica (BrSCOPE) realizou um estudo multicêntrico de vigilância em 16 hospitais distribuídos em cinco regiões do Brasil para avaliar a incidência, distribuição de espécies de Candida, susceptibilidade antifúngica e fatores de risco para infecções de corrente sanguínea. De junho de 2007 a março de 2010, foram um total de 2.563 episódios de infecção nosocomial da corrente sanguínea. Candida spp. foi o sétimo agente mais prevalente na maioria dos pacientes que, marjoritariamente, eram do sexo masculino, com idade média de 56 anos, sendo que um total de 64 pacientes (46,7%) já estavam na UTI quando ocorreu a candidemia. As espécies não-albicans de Candida foram prevalentes em 65,7% dos
31
137 isolados de levedura, sendo Candida parapsilosis (24,1%), Candida tropicalis (15,3%) e Candida glabrata (10,2%) as espécies mais encontradas. Contudo, C.
albicans (34,3%) ainda é a leverua mais prevalente isoladas. Apenas 47 dos 137
isolados de Candida foram enviados ao laboratório de referência para o teste de sensibilidade aos antifúngicos. Todos os isolados de C. albicans, C. tropicalis e C.
parapsilosis foram suscetíveis aos 4 antifungicos testados (anfotericina B,
fluconazol, variconazol e anidulafungina). Entre os 11 isolados de C. glabrata, 36% eram resistentes ao fluconazol e 64% sucesptíveis dose dependente, sendo que todos foram suscetíveis à anidulafungina e à anfotericina B, assim C. glabrata está emergindo como um importante fungo entre as Candida spp não-albicans e é preocupante sua resistência ao fluconazol, assim como apresentada por C. krusei. A resistência de Candida spp. as equinocandinas e anfotericina B ainda permanece rara no Brasil (Doi et al., 2016)
2.4 Patogenicidade e fatores de virulência de Candida albicans.
C. albicans é um dos microrganismos mais frequentemente
identificados em infecções nosocomiais devido sua capacidade de invadir variados locais do hospedeiro humano, desde tecidos e órgãos profundos até locais superficiais (Verstrepen, et al.,2004). Mais significativamente, a C.
albicans é capaz de aderir-se a cateteres, próteses bucais e implantes médicos
internos, sendo atualmente classificada pelo Centers for Disease Control and
Prevention – CDC/E.U.A. como o terceiro patógeno mais comumente isolado em
pacientes hospitalizados com uma taxa de mortalidade de até 50% (Mathé e Van Dijck 2013).
A levedura C. albicans apresenta ótima adaptação ao corpo humano podendo colonizá-lo comensalmente sem produzir sinais de doença. Este equilíbrio entre C. albicans e o hospedeiro é propiciada pela manutenção da integridade das barreiras teciduais, pela relação harmônica com a microbiota autóctone e pelo funcionamento adequado do sistema imunológico humano. Por ser um fungo pleomórfico, a capacidade de transição de C. albicans de comensal para sua forma patogênica é diretamente relacionada à sua aptidão de realizar a
mudança morfológica de levedura para sua forma invasiva com a formação de hifas (Tsui et al., 2016).
As células de Candida albicans possuem a parede celular composta de aproximadamente 80 a 90% de polissacarídios de glicose (Glucanos) com ramificações e ligações β-1,6 e β-1,3. Moléculas de N-acetil-D-glicosamina ligadas a quitina contendo ligações β-1,4 e polímeros de manose ligados covalentemente as manoproteínas, também são encontradas na composição desta estrutura, além de proteínas (6 a 25%) e pequenas quantidades de lipídios. Sabe-se que o arranjo molecular está disposto em camadas, entretanto, ainda não há consenso sobre a quantidade de camadas existentes (Verstrepen et al., 2004).
Os fatores de virulência das Candida spp. propiciam o sucesso no estabelecimento de Candidoses e Candidemias dependendo do estágio e também da natureza da resposta do hospedeiro. Geralmente, estes processos infecciosos são favorecidos pela ruptura do equilíbrio parasita-hospedeiro. Aderência, polimorfismo, variabilidade fenotípica, produção de enzimas extracelulares que degradam os tecidos, toxinas que causam lesão celular, formação de biofilmes sobre células e superfícies inanimadas, produção de tubo germinativo por algumas espécies de Candida, produção de hemolisinas, hidrofobicidade da superfície celular e resistência ao peróxido de hidrogênio constituem os principais fatores descritos deste gênero que lhe conferem a habilidade de colonizar e oportunamente causar infecção (Calderoni e Fonzi, 2001).
A maioria das infecções produzidas por Candida albicans está relacionada pela sua capacidade de diferenciação morfológica (de levedura para hifas) e consequente adesão e desenvolvimento do biofilme em superfícies bióticas ou abióticas. O crescimento das hifas é um mecanismo de virulência importante na invasão de tecidos e na resistência a fagocitose (Jayatilake et al., 2006). Os biofilmes são comunidades biológicas com um alto grau de organização, em que os microrganismos se coagregam de maneira estruturada, coordenada e funcional, os quais se apresentam embebidos por uma matriz extracelular (MEC) (Figura 1) (Chandra et al., 2001).
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O fator primário na colonização fúngica de tecidos e superfícies abióticas é a capacidade de adesão às superfícies, que passa a ser induzida pela percepção da modificação do ambiente (ambiente favorável) o qual ativa várias cascatas de sinalização celular no fungo. O estabelecimento inicial da adesão é preconizada inicialmente pela ligação das células de Candida às superfícies por fatores não-específicos (hidrofobicidade e forças eletrostáticas) formados entre as proteínas do tipo adesinas presentes na superfície das células fúngicas que se ligam a proteínas presentes no ambiente como o fibrinogênio e fibronectina e também em aminoácidos e açúcares de superfície presentes em outras células. (Verstrepen e Klis, 2006).
A invasão e a destruição dos tecidos hospedeiros são promovidas por enzimas hidrolíticas (fosfolipases e proteases - proteínas SAP) que constituem um grupo de isoenzimas de proteinase aspártica (Sap) com massas moleculares entre 35 e 50 kDa e são codificados por um conjunto de genes que vão do SAP1 ao SAP10. O papel de genes SAP1 a SAP6 estão relacionados com a aderência, lesão tecidual e mudanças na resposta imune (Sardi et al., 2013).
Ramage e López-Ribot (2005), relataram que são quase inexistentes infecções causadas por Candida em sua forma planctônica nos tecidos do hospedeiro. Portanto, é o biofilme que constitui o fator de virulência mais importante pois protege a comunidade microbiana de mecanismos imunológicos do hospedeiro, promove a resistência contra o tratamento antifúngico e a resistência à competição com a microbiota autóctone, além de facilitar o desenvolvimento das relações simbióticas e sinalizações entre as células da comunidade do biofilme, conferindo maior proteção contra radiações UV e desidratação, permitindo assim melhora na adaptação e sobrevivência à ambientes hostis.
In vitro, a camada de biofilme basal é composta por células de
leveduras a partir das quais as células filamentosas emanam (hifas), sendo estas células envolvidas por uma densa camada de matriz extracelular (MEC) (Figura 2), a qual é composta por β-glucano que tem a capacidade de se ligarem a antifúgicos como o fluconazol e à anfotericina-B, impedindo a penetração destas drogas no biofilme (Finkel & Mitchell, 2011). Além disso, a MEC contém DNA
extracelular (eDNA), que também contribui para a integridade estrutural dos biofilmes de Candida spp. (Tobudic et al., 2011).
Estudos recentes sugerem que o desenvolvimento primário, a maturação e o envelhecimento de um biofilme são regulados pela expressão de genes ativados pela transmissão de sinais entre as células (Khan et al., 2009) (Albuquerque et al., 2012). Uma das propriedades do biofilme é promover a sinalização celular (quorum sensing - sensor de quorum) que corresponde a um processo de comunicação intra e interespécies microbianas e é fundamental na formação de biofilmes microbianos mono e multiespécies. Esta comunicação através de moléculas sinalizadoras e autoreguladoras tem como principal objetivo impedir a superpopulação desnecessária e controlar a competição por nutrientes, além de exibir implicações importantes no processo infeccioso, particularmente para disseminação e estabelecimento de sítios de infecções (Ramage et al., 2005).
Analisando composto bioativos oriundos de óleos e extratos de plantas medicinais e compostos vindo de produtos naturais, estudos recentes verificaram que esses compostos naturais atuam como moléculas quorum sensing (moléculas autoreguladoras do biofilme) como o farnesol (Jeon et al., 2011) (Albuquerque et al., 2012) e dodecanol (Hall et al., 2011), que exibem a ação de inibir a filamentação (hifamento) no biofilme de C. albicans e que tem sido associado à hidrofobicidade de superfície celular. Em contrapartida, outros compostos bioativos naturais como o tirasol desempenha ação no crescimento e na morfogênese de C. albicans, estimulando a produção de hifas em condições permissivas para a formação do tubo germinativo, apesar do seu papel não estar ainda esclarecido em biofilmes (Ramage et al., 2005).
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Figura 2 – Representação esquemática do crescimento do biofilme de Candida
albicans em uma superfície de tiras de Polimetilmetacrilato (PMA).
Legenda: Early – inicial; Intermediate – intermediário; Mature – Maduro; Irregular PMA surface - Superfície irregular de PMA; ECM – Matriz (polissacarídeo) extracelular;
3 PROPOSIÇÃO
3.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos antimicrobianos em Candida spp e no biofilme de Candida
albicans SC5314 e antiproliferativo em células HaCat do óleo essencial das
folhas de Psidium cattleyanum var. lucidum.
3.2 Objetivos Específicos
1) Avaliar a composição do óleo essencial de folhas de Psidium cattleyanum;
2) Determinar a mínima concentração inibitória do óleo essencial das folhas de Psidium cattleyanum sobre microrganismos do gênero Candida (cepas padrão e espécimes clínicos);
3) Determinar a ação fungicida/fungistática do óleo essencial das folhas de
Psidium cattleyanum sobre sobre microrganismos do gênero Candida (cepas
padrão e espécimes clínicos);
4) Avaliar a atividade antibiofilme de Candida albicans (SC5314) do óleo essencial das folhas de Psidium cattleyanum exposto a diferentes concentrações;
5) Avaliar as modificações morfológicas microscópicas do biofilme de
Candida albicans SC5314 ocasionadas pelo óleo essencial das folhas de Psidium cattleyanum através de Microscopia Eletrônica de Varredura;
6) Avaliar a capacidade antiproliferativa do óleo essencial de folhas de
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4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local de Realização da Pesquisa
Este estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – FOP/UNICAMP (CAAS: 60614316.5.0000.5418) (ANEXO A).
As análises experimentais do presente projeto foram feitas utilizando-se a estrutura do laboratório de cultura, laboratório de biologia molecular e laboratório de cultura de células da Área de Microbiologia e Imunologia – Departamento de Diagnóstico Oral – FOP/UNICAMP. Telefone: (019) 2106-5321 / 2106-5322; Endereço para correspondência: Faculdade de Odontologia de Piracicaba - UNICAMP. Área de Microbiologia e Imunologia. Avenida Limeira, 901. CEP:13414-018, Piracicaba, SP, Brasil.
O Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas – CPQBA/UNICAMP forneceu a estrutura para análises cromatográficas do óleo essencial, como instituição co-participante.
O Laboratório de Microbiologia da Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araçatuba – F.O.A/UNESP, forneceu os espécimes clínicos (ANEXO B), realizando o isolamento e identificação das mesmas, como instituição co-participante.
4.2 Material vegetal
O material vegetal comercial utilizado foi do gênero Psidium e pertence a espécie Psidium cattleyanum var. lucidum Hort (TreeTech® Óleos Essencias), o qual foi extraído o óleo essencial a partir de suas folhas.
4.3 Cromatografia
O óleo essêncial de P. cattleyanum passou por uma análise de qualificação e quantificação dos compostos presentes nas amostras por cromatografia gasosa.
4.3.1 - Cromatografia Gasosa (CG)
Foi utilizado cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 5890 Serie II, equipado com detector seletivo de massas Hewlett40 Packard 5971, injetor split/splitless, utilizando-se uma coluna capilar HP-5 (25m x 0,2mm x 0,33μm). Temperaturas: injetor = 220°C, detector = 280°C, coluna = 60°C, 3°C.min-1, 240°C (7 minutos). A vazão do gás de arraste (He super seco) foi igual a 1,0 ml.min-1.
A análise dos dados da CG foi levada a efeito de acordo com a equação de Van den Dool e Kratz para a obtenção do Índice de Retenção seguida de comparação dos índices de retenção e picos cromatográficos dele obtidos com os encontrados na literatura.
IR= [(Ts-Tcn-1)/Tcn-Tcn-1)x100 + 100cn-1, onde:
IR= índice de retenção;
Ts= tempo de retenção da substância analisada;
Tcn= tempo de retenção do n-alcano que elui após a substância analisada;
Tcn-1= tempo de retenção do alcano que elui antes da substância analisada;
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4.4 Cepas de Candida spp.
Para as análises foram utilizadas cepas de diferentes espécies de
Candida spp. descritas a seguir:
Cepas padrão adquiridas de bancos de microrganismos (CBS-
Centraalbureau voor Schimmelcultures; IZ-Instituto Zimotécnico-ESALQ/USP): Candida albicans (CBS 562), C. albicans (ATCC 90028), C. utilis (CBS 560), C. lusitaniae (IZ 06); C. parapsilosis (CBS 604), C. dubliniensis (CBS 7987), C. guilliermondii (CBS 566), C. krusei (CBS 573), C. tropicalis (CBS 94), C. rugosa (IZ
12), C. glabrata (IZ 07) e a cepa C. albicans SC5314.
Os espécimes clínicos de Candida spp. provenientes de pacientes imunodeprimidos, em estágio avançado da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (HIV), foram coletadas de amostras de aspirados brônquicos e, a partir delas, isoladas 5 espécimes clínicos da espécie Candida albicans, 5 espécimes clínicos de
Candida krusei e 5 espécimes clínicos de Candida tropicalis, as quais estão
depositadas em Biorrepositório no Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - F.O.A, as quais foram gentilmente cedidas pelo Prof. Titular Elerson Gaetti Jardim Júnior. Estes espécimes clínicos foram coletadas de pacientes adultos, capazes, sem distinção de gênero, com faixa etária de 22 a 37 anos, sob tratamento na Santa Casa de Misericórdia de Araçatuba - SP que fizeram parte de uma pesquisa científica sob responsabilidade do Prof. Titular Elerson Gaetti Jardim Júnior e da Profª. Drª. Ana Cláudia Okamoto da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - F.O.A.- UNESP (Projeto Aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana - F.O.A. - UNESP com o título “Microbiota bucal e sua relação com infecções oportunistas em pacientes mantidos em unidades de terapia intensiva”, número CAAES: 14982313.1.0000.5420). Todos os pacientes ou seus responsáveis assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - F.O.A.- UNESP permitindo a coleta de material. A coleta do material foi feita por procedimento de aspiração brônquica, onde parte do material aspirado foi imediatamente colocado em meio de cultura de transporte e, no laboratório, parte do material foi inoculado em meio de cultura seletivos para Candida spp. Quando houve o crescimento de leveduras, as mesmas foram isoladas por meios específicos e
armazenadas em Skim milk em criogenia. Todas os espécimes clínicos foram mantidos em meio líquido à -70ºC no Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - F.O.A.- UNESP.
Microrganismos do gênero Candida são pertencentes microbiota endógena humana de maneira comensal e oportunamente ocasionam doença quando o hospedeiro apresenta imunidade debilitada, sendo então classificadas como tendo baixo risco biológico (Classe 2). Todas as técnicas de cultivo e manutenção destes microrganismos seguiram os padrões de biossegurança requeridos e instituídos na área de Microbiologia e Imunologia da FOP/UNICAMP em conformidade com a CiBio/F.O.P.
4.5 Grupos testes utilizados nos ensaios com P. cattleyanum var. lucidum. Para os ensaios os grupos controles e testes foram os seguintes:
Grupo controle (CG) positivo: para o crescimento dos fungos sem a presença do óleo;
GC negativo: somente meio de cultura sem inóculo;
GC negativo do óleo essencial: verificar contaminação do óleo essencial de P. cattleyanum var. lucidum Hort;
GC negativo do Tween: verificar contaminação do diluente estoque;
Grupo teste: presença da espécie de Candida testada exposta a diferentes concentrações do óleo testado ou antifúngico comercial.
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4.6 Avaliação da atividade antifúngica em células planctônicas (Concentração Inibitória Mínima - CIM).
As amostras de Candida spp. foram testadas quanto a sua susceptibilidade ao óleo essencial de Psidium cattleyanum, e, como padrão comparativo, foram testadas também pela Nistatina e Fluconazol. Foi utilizada a técnica de microdiluição em caldo seguindo a padronização descrita no documento M27-A3 (CLSI, 2008).
Em uma microplaca estéril de 96 poços foram depositados 100µl de meio RPMI-1640 e em seguida, 100 µl do óleo essencial na concentração inicial de 16 mg/ml, diluído em Tween 80 a 0,025% + RPMI. Em seguida, foram feitas diluições seriadas do óleo (16 mg/ml à 0,015625 mg/ml). Posteriormente foram adicionados 100 µl de inóculo da levedura em solução salina ajustando-se a turbidez correspondente a 0,5 na escala McFarland, a uma absorbância de 0,08 a 0,10A em 530nm (5,0 x 106 UFC/ml) no espectrofotômetro. O inóculo ajustado posteriormente foi diluído em RPMI para a fim de se obter 2,5x103 UFC/ml que foi acrescentado à placa com o óleo essencial em diferentes concentrações. As placas foram incubadas em estufa de aerobiose por 48h a 37°C, e após a concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada por leitura visual. Os antifúngicos Nistatina e Fluconazol, foram preparados ressuspendidos com DMSO e as soluções de trabalho foram feitas com RPMI-1640, sendo acrescentados na placa com concentração de 16 µg/ml e diluído seriadamente até 0,015625 µg/ml para Nistatina e para Fluconazol foi acrescentado em concentração de 64 µg/ml e diluído seriadamente até 0,015625 µg/ml.
A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi definida a partir da concentração onde não se observa crescimento das leveduras. Para a identificação da concentração fungicida mínima (CFM), 20 µl da suspensão da CIM, CIM-1 e CIM+1 foram plaqueadas em Ágar Saboraud Dextrose (SDA) e incubadas por 24h em aerobiose. A CFM foi identificada a partir do não crescimento de colônias a partir da CIM. Foram realizados três experimentos independentes de cada teste.
4.7 Análise da viabilidade celular de biofilmes de Candida albicans (SC5314)
4.7.1 Preparo e ajuste do inóculo.
O óleo essencial de Psidium cattleyanum foi testado em biofilme de C.
albicans (SC5314) em formação (biofilme com 2 horas de crescimento) conforme
descrito por Silva et al. (2010) com algumas adaptações e testado em biofilme maduro (biofilme com 24 horas de crescimento) conforme descrito por Pierce et al. (2008).
Para ambos os tipos de biofilmes, a cultura overnight foi preparada em YPD e incubada sob agitação a 30 rpm em 37°C. Uma alíquota de 7 ml do inóculo foi centrifugada e lavada em 14 ml de PBS por 2x, e ao pellet obtido, foram adicionados 7 ml de RPMI-1640. Desta suspensão celular resultante foi preparada a diluição de 1:100 e as células foram contadas em hemocitômetro em microscópio óptico (aumento de 400x), proporcionando a contagem celular, a qual foi utilizada para o cálculo do volume necessário para o ajuste do inóculo de trabalho com uma suspensão final de 1,0 x 106 células/ml, em RPMI- 1640.
4.7.2 Formação e análise do Biofilme em formação (pré-incubação por 2 horas) e Biofilme maduro (pré-incubação de 24 horas).
Para o biofilme em formação, na microplaca estéril de 96 poços tipo PS (fundo U) foram depositados 100 μl de inóculo, o qual que foi incubado por 2h sob agitação (100 rpm a 37°C) em incubador de microplaca. Em seguida, a placa foi lavada 3x com NaCl a 0,9% e foi adicionado 100 μl do óleo essencial diluído em cada concentração testada (32 mg/ml a 0,03125 mg/ml). A placa contendo o inóculo e óleo foi incubada por 24h a 37°C em estufa de aerobiose. Para o biofilme maduro, na microplaca de 96 poços com fundo U foram depositados 100 μl de inóculo o qual foi incubado por 24h. Posteriormente, a placa foi lavada 3x com NaCl a 0,9% e foram adicionados 100 μl do óleo essencial diluído em cada concentração testada (16 mg/ml a 0,0156 mg/ml). A placa foi incubada por 24h a 37°C em estufa de aerobiose.
Para a análise da ação do óleo essencial sobre os tipos de biofilme, as placas de biofilme em formação e de biofilme maduro foram, posteriormente à
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incubação, lavadas 3x com solução salina a 0,9%, a fim de remover as células planctônicas presentes e o óleo essencial. Os biofilmes aderidos às placas foram então corados com 80 μl de XTT (2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) em cada poço para se determinar a viabilidade celular dos biofimes tratados, devido ao XTT modificar sua coloração de amarela para laranja em resposta à uma oxirredução sofrida na respiração celular. Após incubação por 4h a 37ºC sobre abrigo da luz, os poços com atividade celular adquiram coloração mais alaranjada, podendo ser quantificada a viabilidade celular pela mensuração de sua densidade óptica em Espectrofotômetro de Microplaca a 490nm. Os ensaio foram feitos em três experimentos independentes.
4.8 Microscopia Eletrônica de Varredura dos tipos de biofilmes de C. albicans.
4.8.1 Preparo do inóculo
Os microrganismos cultivados em microtubos tipo eppendorf e ajustados a 1x106 céls/ml foram préincubados conforme o biofilme em formação (2h) e o biofilme maduro (24h) juntamente com seus respectivos grupos controles (sem tratamento com o óleo essencial) como descrito anteriormente, sob aerobiose em lâminas de vidro para MEV (BD Culture Slide) em duplicata.
4.8.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Após a incubação prévia, as placas foram lavadas duas vezes com NaCl 0,9% e depois foram adicionados 300 ul de óleo essencial em 3 concentrações distintas foram adicionadas ao biofilme em formação (1 mg/ml, 0,5 mg/ml e 0,250 mg/ml) e ao biofilme maduro (0,5 mg/ml, 1 mg/ml e 2 mg/ml). As lâminas com os grupos testes (concentrações de óleo essencial) e o grupo controle (sem a ação do óleo essencial) foram incubadas por 24h em aerobiose a 37ºC. Após 24h de incubação, os poços das lâminas foram lavados com PBS (2x) e, em seguida, foi adicionado 100 ul de glutaraldeído a 2% (v/v), por 30 minutos. As amostras foram então desidratadas com banhos sequenciais de etanol, nas concentrações de 50%, 70%, 90% e etanol absoluto (2X). Posteriormente, as lâminas passaram pelo processo de metalização com ouro, por 120s, em metalizador BAL-TEC SCD 050
(Balzers Liechtensteis). A análise das imagens das amostras foi feita em Microscópio Eletrônico de Varredura JSM-5600 Lv da JEOL (Tóquio, Japão), com aceleração de 15KV.
4.9 Ensaio de atividade antiproliferativa em células HaCat.
As células epiteliais utilizadas para este estudo são da linhagem celular de queratinócitos normais humanos imortalizada, mas não transformada, denominada HaCat. Estas células foram gentilmente doadas pelo Prof. Dr. Ricardo Della Coletta, da Área de Patologia (FOP/UNICAMP), as quais foram cultivadas na presença do óleo essencial testado para determinar se o mesmo apresenta efeito antiproliferativo e até mesmo tóxico sobre elas.
Após serem reativadas e atingirem a confluência de 90%, as células foram cultivadas com RPMI + 10% de SFB em placas de 96 poços e incubadas a 37ºC em estufa de CO2 (5%) por 24h. Após 24h, 100 ul de óleo essencial de P.
cattleyanum foi adicionado em concentrações de 32 mg/ml a 0,5 mg/ml e incubadas
por 48h a 37°C em estufa de CO2 (5%). Após esse período, as células foram fixadas com 50 ul de Ácido Tricloroacético (TCA) a 50% e incubadas por 1h a 4ºC. Na sequência, as placas foram lavadas com PBS (3x) e secas em temperatura ambiente, para serem coradas com 50 ul da solução de Sulforrodamina B (SRB) 0,4% com ácido acético 1% por 60min a 4ºC, onde as proteínas da superfície celular de células HaCat aderidas e biologicamente ativas se ligam à solução que passa a corar as células.
Após a incubação as placas foram lavadas com Ácido Acético 1% para retirada de ligações inespecíficas do corante e celular não aderidas e foi adicionado 100 ul de Trizma Base para a ressuspensão do corante anteriormente ligado às proteínas de superfície celular. A leitura das placas foi feita em Espectrofotômetro de Microplaca (530nm) para medir a densidade óptica. Foi utilizado como parâmetro Dose Letal 50, como descrito previamente por Endo et al. (2010). Os ensaio foram feitos em três experimentos independentes.
