Ensaio contínuo C-4

A fim de ampliar a faixa de vazões específicas de alimentação estudadas, foi realizado o ensaio C-4. Na primeira etapa contínua deste ensaio foi estudada uma vazão bastante baixa (D = 0,03 h-1) e na segunda etapa, foi utilizada uma vazão D = 0,30 h-1, bem próxima da condição de lavagem do reator. A condição de lavagem é aquela na qual D ≥ µxmax. Nessa condição, o único estado estacionário

possível é obtido quando a concentração celular no reator decai até zero (estado estacionário de lavagem). Assim, quando D se aproxima do valor de µxmax, a

concentração celular no estado estacionário decai.

A figura 4.157 apresenta a concentração celular (X) e a concentração de substrato (S) durante o ensaio C-4. Em relação à concentração celular pode-se observar que, de forma semelhante aos demais ensaios contínuos, ocorreu uma rápida estabilização, após o início do processo contínuo. Na primeira fase, compreendida entre 16 e 168 horas de cultivo (instantes representados pelas linhas verticais na figura), a concentração celular atingiu um valor de cerca de 4,6 g/L no estado estacionário, ligeiramente inferior à obtida no ensaio C-3. Com a mudança da vazão específica de alimentação (a partir das 168 horas de cultivo) para 0,30 h-1, ocorreu uma queda considerável na concentração celular em estado estacionário (cerca de 2,4 g/L), indicando a proximidade da condição de lavagem do reator. Em relação ao

substrato, a concentração de glicose manteve níveis muito baixos durante o primeiro estado estacionário (cerca de 0,1 g/L), aumentando no segundo estado estacionário para cerca de 6,9 g/L, indicando que para altas vazões específicas de alimentação ocorre uma sobra de substrato não consumido, devido ao baixo tempo de residência no reator, de forma semelhante ao que foi observado no ensaio C-3.

Em relação à produção do antibiótico, a figura 4.158 apresenta os perfis de concentração de retamicina extracelular, intracelular e total durante o ensaio C-4. Após o estabelecimento do primeiro estado estacionário, a concentração de retamicina total foi de cerca de 3,10 g/L, inferior à obtida no ensaio C-3 (primeira etapa). Com o aumento da vazão, no segundo estado estacionário, a produção do antibiótico foi nula, mostrando que altas vazões específicas de alimentação e, conseqüentemente, altas velocidades específicas de crescimento, prejudicam a síntese de retamicina.

As figuras 4.159 a 4.162 apresentam o biorreator, no ensaio C-4, no término da primeira etapa (figura 4.159), quando a produção do antibiótico era alta, e no início da segunda etapa (figuras 4.160 a 4.162). Pode-se observar a gradual perda na produção de retamicina, quando a vazão de alimentação foi aumentada.

A figura 4.163 mostra as velocidades específicas de crescimento, de consumo de substrato e de produção de retamicina, durante o ensaio C-4. O valor máximo da velocidade específica de crescimento foi de cerca de 0,35 h-1, em torno das 8 horas de cultivo. Durante a primeira etapa do processo contínuo, a velocidade específica de crescimento foi controlada em 0,03 h-1. Na segunda etapa, a velocidade específica de crescimento foi controlada em 0,30 h-1. Como o valor máximo de µx foi

de cerca de 0,35 h-1, maior do que D, não ocorreu lavagem no reator. Em relação à velocidade específica de produção de retamicina total, no primeiro estado estacionário o valor ficou em 0,020 g/(g.h). No segundo estado estacionário, como já destacado anteriormente, não foi detectada a produção do antibiótico.

A figura 4.164 apresenta a concentração de íons amônio no ensaio C-3. Da mesma forma que o ensaio C-3, pode-se observar que a produção do antibiótico iniciou-se entre 18 e 20 horas, instante em que a concentração de amônio apresentava níveis baixos (menor do que 2 mM). Durante todo o primeiro estado estacionário, a concentração de amônio foi muito baixa; na segunda condição, manteve-se em torno de 8,0 mM, concentração mais alta do que a obtida na segunda etapa do ensaio C-3,

reforçando a hipótese de que a limitação pela fonte de nitrogênio desempenha um papel importante na síntese de metabólitos secundários, conforme destacado por Demain; Fang (1995).

O índice de consístência (K) e o índice de comportamento (n) no ensaio C-4 são mostrados na figura 4.165. No primeiro estado estacionário, o valor de K manteve-se em torno de 3,0 dina.sn/cm2. No segundo estado estacionário, devido à diminuição na concentração celular, o valor de K decaiu para cerca de 1,0 dina.sn/cm2. Já o valor de n não variou muito de um estado estacionário para outro (0,36 no primeiro e 0,42 no segundo estado estacionário).

Em relação à respiração celular, a figura 4.166 mostra a velocidade global de consumo de oxigênio (QO2X) e a velocidade específica de consumo de oxigênio

(QO2), durante o ensaio C-4. No primeiro estado estacionário, o valor de QO2X foi

de cerca de 3,9 mmol/(L.h) e o valor de QO2 foi de 0,9 mmol/(g.h). Com o aumento

da vazão (D), no segundo estado estacionário ocorreu um aumento no consumo de oxigênio, com QO2X atingindo cerca de 16,7 mmol/(L.h) e QO2 atingindo cerca de

7,0 mmol/(g.h).

A figura 4.167 apresenta a porcentagem de cada classe morfológica, em termos de área. Pode-se observar que, no primeiro estado estacionário, houve um crescimento predominantemente na forma de clumps (entre 85 % e 90 %), com a presença também de hifas ramificadas (cerca de 12 %). Com o aumento da vazão específica de alimentação e, conseqüentemente com a diminuição do tempo de residência no reator, ocorreu a formação de pellets, semelhantemente ao observado no ensaio C-3. No segundo estado estacionário havia cerca de 90 % de pellets e 9 % de clumps.

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Tempo (h) X e S (g /L ) X S

Figura 4.157 Concentração celular (X)

e concentração de glicose (S), no ensaio C-4.

Figura 4.159 Biorreator, no ensaio C-4,

com 168 horas de cultivo (término da primeira etapa contínua).

Figura 4.161 Biorreator, no ensaio C-4,

com 176 horas de cultivo (segunda etapa contínua). 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Tempo (h) Re , Ri , Rt ( g/ L ) Re Ri Rt

Figura 4.158 Concentração de retamici-

na extracelular (Re), concentração de retamicina intracelular (Ri) e concen- tração de retamicina total (Rt), no ensaio C-4.

Figura 4.160 Biorreator, no ensaio C-4,

com 172 horas de cultivo (segunda etapa contínua).

Figura 4.162 Biorreator, no ensaio C-4,

com 180 horas de cultivo (segunda etapa contínua).

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 0 40 80 120 160 200 Tempo (h) µ x (h -1) e µ s (g / (g .h )) 0,000 0,020 0,040 0,060 µ Re , µ Ri , µ Rt (g / (g .h )) µX µS µRe µRi µRt

Figura 4.163 Velocidade específica de

crescimento (µx), velocidade específica

de consumo de substrato (µs), velocidade

específica de produção de retamicina extracelular (µRe), velocidade específica

de produção de retamicina intracelular (µRi), velocidade específica de produção

de retamicina total (µRt), no ensaio C-4.

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Tempo (h) K ( d in a. s n/c m 2) 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 n K n

Figura 4.165 Índice de consistência do

caldo (K) e índice de comportamento do escoamento (n), no ensaio C-4. 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Tempo (h) FA cl , F A p , F A hnr e F A hr (% )

FAcl FAp FAhnr FAhr

Figura 4.167 Porcentagem de clumps

(FAcl), de pellets (FAp), de hifas

ramificadas (FAhr) e de hifas não

ramificadas (FAhnr), em termos de área,

no ensaio C-4. 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Tempo (h) C NH 4 + (m M)

Figura 4.164 Concentração de íons

amônio (CNH4+), no ensaio C-4. 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Tempo (h) QO 2 X (m m ol/ (L .h ) 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 QO 2 (mmo l/ (g .h ) QO2 X QO2

Figura 4.166 Velocidade de consumo de

oxigênio (QO2X) e velocidade específica

de consumo de oxigênio (QO2), no

Em relação às dimensões dos objetos, os clumps apresentaram uma dimensão média em torno de 100 µm nos dois estados estacionários, sem diferenças significativas, considerando-se os intervalos de confiança adotados. Os pellets apresentaram uma dimensão média em torno de 500 µm, no segundo estado estacionário, não estando presentes no primeiro estado estacionário, de forma semelhante ao ocorrido no ensaio C-3. As hifas ramificadas apresentaram um comprimento total entre 80 µm e 100 µm, sem diferenças significativas entre os dois estados estacionários. Em relação ao comprimento das hifas não ramificadas, as diferenças obtidas entre os dois estados estacionários também foi muito pequena, o mesmo ocorrendo com o número de extremidades e com a unidade de crescimento hifal das hifas ramificadas.