Ensaio contínuo C-3

No ensaio contínuo C-3, foram estudados dois estados estacionários. A primeira etapa contínua do ensaio (entre 16 e 96 horas de cultivo) foi realizada com uma vazão específica de alimentação D = 0,05 h-1, a fim de se controlar a velocidade específica de crescimento neste valor (µx baixo). A segunda etapa (entre 96 e 120

horas de cultivo) foi realizada com uma vazão específica D = 0,25 h-1, com o objetivo de se verificar a influência de um alto valor de µx sobre a produção de

retamicina.

A figura 4.150 apresenta a concentração celular, a concentração de substrato e de oxigênio dissolvido durante o ensaio C-3. Em relação à concentração celular pode-se observar que, após o início do processo contínuo (D = 0,05 h-1), ocorreu uma rápida estabilização, com o estabelecimento do estado estacionário. A concentração celular no estado estacionário foi de cerca de 5,30 g/L. Essa primeira etapa, compreendida entre 16 e 96 horas de cultivo, é representada pelas linhas verticais na figura. A partir das 96 horas de cultivo, a vazão específica de alimentação foi aumentada para 0,25 h-1. Com o aumento da vazão, ocorreu uma perturbação no sistema, com uma queda na concentração celular até cerca de 4,0 g/L. Após essa queda, a concentração celular voltou a aumentar, atingindo novamente o mesmo patamar anterior (cerca de 5,40 g/L). Em relação ao substrato, na primeira etapa do ensaio, a concentração de glicose atingiu um baixo valor de cerca de 0,95 g/L, no estado estacionário. Com o aumento de D, ocorreu um aumento na concentração de glicose, no estado estacionário para cerca de 5,6 g/L. A porcentagem de oxigênio

dissolvido manteve-se em torno de 95 % no primeiro estado estacionário, caindo para cerca de 62 % no segundo estado estacionário.

A figura 4.151 apresenta os perfis de concentração do antibiótico retamicina, no ensaio C-3. Após o início da primeira fase do processo contínuo, a concentração de retamicina total estabilizou-se em torno de 3,85 g/L. Com o aumento da vazão específica de alimentação, a partir das 96 horas de cultivo, ocorreu uma diminuição na produção do antibiótico. A retamicina total, no segundo estado estacionário, ficou em torno de 0,30 g/L. Esses resultados mostram que altas vazões específicas, que conduzem a altas velocidades específicas de crescimento (µx = D, no

estado estacionário), prejudicam a síntese de retamicina, por ser esta um metabólito secundário (não associado ao crescimento). Dessa forma, a produção de retamicina é favorecida por baixas vazões específicas de alimentação (D), que conduzem a baixas velocidades específicas de crescimento (µx), conforme observado anteriormente nos

ensaios descontínuos alimentados.

A figura 4.152 mostra as velocidades específicas de crescimento, de consumo de substrato e de produção de retamicina, durante o ensaio C-3. O valor máximo da velocidade específica de crescimento foi de cerca de 0,30 h-1, em torno das 9 horas de cultivo. Após o estabelecimento do primeiro estado estacionário, o valor de µx foi controlado em torno de 0,05 h-1, o que levou a uma velocidade

específica de produção de retamicina total de cerca de 0,036 g/(g.h) neste primeiro estado estacionário. Com a mudança da vazão, a velocidade específica de crescimento aumentou, estabilizando-se em 0,25 h-1, o que provocou uma queda na velocidade específica de produção de retamicina total, que atingiu apenas 0,014 g/(g.h), no segundo estado estacionário.

A figura 4.153 apresenta a concentração de íons amônio no ensaio C-3. De forma semelhante aos ensaios C-1 e C-2, pode-se observar que a produção do antibiótico iniciou-se entre 18 e 20 horas, instante em que a concentração de amônio apresentava níveis baixos (menor do que 2 mM). Durante todo o primeiro estado estacionário, a concentração de amônio foi muito baixa; na segunda condição, aumentou para cerca de 1,30 mM.

O índice de consístência (K) e o índice de comportamento (n) no ensaio C-3 são mostrados na figura 4.154. Em relação ao índice de consistência (K), o valor atingido na primeira etapa do ensaio, após o estabelecimento do estado estacionário,

foi de cerca de 4,0 dina.sn/cm2. No segundo estado estacionário, o valor de K atingiu cerca de 7,2 dina.sn/cm2. O índice de comportamento (n) atingiu um valor de 0,35 no primeiro estado estacionário, decaindo para cerca de 0,20 no segundo estado estacionário.

Em relação à respiração celular, a figura 4.155 apresenta a velocidade global de consumo de oxigênio (QO2X) e a velocidade específica de consumo de oxigênio

(QO2), durante o ensaio C-3. No primeiro estado estacionário, o valor de QO2X foi

de cerca de 13,0 mmol/(L.h) e o valor de QO2 foi de 2,5 mmol/(g.h). Com o aumento

da vazão (D), no segundo estado estacionário ocorreu um aumento no consumo de oxigênio, com QO2X atingindo cerca de 21,5 mmol/(L.h) e QO2 atingindo cerca de

4,0 mmol/(g.h). Esse maior consumo de oxigênio no segundo estado estacionário também é refletido pela menor concentração de oxigênio dissolvido, como mostrado na figura 4.150.

A figura 4.156 apresenta a porcentagem de cada classe morfológica, em termos de área. Pode-se observar um predomínio de clumps durante a primeira fase do ensaio contínuo, com cerca de 90 % do total. Na segunda etapa, com o surgimento de pellets, estes passaram a representar a classe morfológica predominante, com cerca de 80 % do total, contra cerca de 16 % de clumps. O aumento da porcentagem de pellets e diminuição da porcentagem de clumps na segunda etapa do processo contínuo provavelmente é devido ao menor tempo de residência nessa segunda etapa, o que leva os pellets a serem submetidos a um menor tempo de cisalhamento, diminuindo o rompimento dos mesmos.

Em relação às dimensões dos objetos, os clumps apresentaram uma dimensão média em torno de 100 µm no primeiro estado estacionário e cerca de 130 µm no segundo estado estacionário, diferenças pouco significativas, considerando-se os intervalos de confiança adotados. Os pellets apresentaram uma dimensão média em torno de 450 µm, no segundo estado estacionário, não estando presentes no primeiro estado estacionário. As hifas ramificadas apresentaram um comprimento total de cerca de 130 µm na primeira condição, atingindo um valor ligeiramente inferior (de cerca de 80 µm) na segunda condição. Em relação ao comprimento das hifas não ramificadas, as diferenças obtidas entre os dois estados estacionários foi muito pequena, o mesmo ocorrendo com o número de extremidades e com a unidade de crescimento hifal das hifas ramificadas.

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 0 20 40 60 80 100 120 Tempo (h) X e S (g /L ) 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 OD (% ) X S OD

Figura 4.150 Concentração celular (X),

concentração de glicose (S) e oxigênio dissolvido (OD), no ensaio C-3.

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0 20 40 60 80 100 120 Tempo (h) µ x (h -1) e µ s (g / (g .h )) 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 µ Re , µ Ri , µ Rt (g / (g .h )) µX µS µRe µRi µRt

Figura 4.152 Velocidade específica de

crescimento (µx), velocidade específica

de consumo de substrato (µs), velocidade

específica de produção de retamicina extracelular (µRe), velocidade específica

de produção de retamicina intracelular (µRi), velocidade específica de produção

de retamicina total (µRt), no ensaio C-3.

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 0 20 40 60 80 100 120 Tempo (h) K ( d in a. s n/c m 2) 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 n K n

Figura 4.154 Índice de consistência do

caldo (K) e índice de comportamento do escoamento (n), no ensaio C-3. 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 0 20 40 60 80 100 120 Tempo (h) Re , Ri , Rt ( g/ L ) Re Ri Rt

Figura 4.151 Concentração de retamici-

na extracelular (Re), concentração de retamicina intracelular (Ri) e concentra- ção de retamicina total (Rt), no ensaio C-3. 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 0 20 40 60 80 100 120 140 Tempo (h) CNH 4 + (m M )

Figura 4.153 Concentração de íons

amônio (CNH4+), no ensaio C-3. 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 0 20 40 60 80 100 120 Tempo (h) QO 2 X (m m ol/ (L .h ) 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 QO 2 (mmo l/ (g .h ) QO2 X QO2

Figura 4.155 Velocidade de consumo de

oxigênio (QO2X) e velocidade específica

de consumo de oxigênio (QO2), no

0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 0 20 40 60 80 100 120 140 Tempo (h) FA cl, FA p, FA hnr e F A hr (% )

FAcl FAp FAhnr FAhr

Figura 4.156 Porcentagem de clumps

(FAcl), de pellets (FAp), de hifas

ramificadas (FAhr) e de hifas não

ramificadas (FAhnr), em termos de área,

no ensaio C-3.

A comparação entre todos os ensaios contínuos será apresentada no item 4.6.5.