Ensaio de Corrosão

Para estudar o efeito da adição de oxigênio no potencial e corrente de corrosão, foram realizadas medidas da variação do potencial eletroquímico, no Laboratório de Eletroquímica do Departamento de Química da UNESP/Bauru, coordenado pelo Prof. Dr. Antonio Carlos Dias Ângelo, com a colaboração do químico Leandro Moreira de Campos Pinto.

As medidas foram efetuadas em um Potenciostato/Galvanostato EGG&PAR modelo 283 por meio de software M270, associado a um microcomputador para aquisição e tratamentos dos dados.

Para realizar os testes foi utilizada uma solução de PBS (136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 6,5 mM Na2HPO4; 1,5 mM KH2PO4 [pH = 7.2]) [51] que simula o fluído do corpo

humano. As amostras foram lixadas e polidas para que não tivesse ranhuras e que se encostasse uniformemente à solução. Os testes foram realizados em temperatura ambiente (~ 25ºC).

A Figura 16 mostra uma representação do circuito utilizado para medir o potencial de corrosão da liga. O contra-eletrodo (1) utilizado foi um fio de platina, o eletrodo de referência, R, um fio de prata, e o eletrodo de trabalho (2) é a própria amostra a ser estudada, no caso, a liga Ti-10Mo.

Para fazer o levantamento dos dados da curva de polarização é necessário um monitoramento periódico do potencial de equilíbrio durante 24 horas. Este monitoramento foi realizado com o auxílio de um voltímetro. Após esse período de 24 horas a célula eletroquímica foi conectada ao potenciostato e obtida a curva de polarização. As medidas foram realizadas entre -500 e +500 mV, a partir do potencial de equilíbrio da liga.

Figura 16 - Representação do circuito eletroquímico experimental empregado para medir o potencial de corrosão. R é o eletrodo de referência [52].

5.7 Biocompatibilidade

Os ensaios de citotoxicidade foram realizados no Laboratório de Biologia dos Tecidos Mineralizados, no Instituto de Ciências Biomédicas da USP, pela bióloga Tatiani Ayako Goto Donato.

5.7.1 Citotoxicidade Indireta

A linhagem MC3T3-E1 foi gentilmente cedida pela Profa. Dra. Cecília Helena de Azevedo Gouveia, do Instituto de Ciências Biomédicas III, Departamento de Anatomia da USP. Colaboraram ainda nesta fase do trabalho, a Profa. Dra. Suzana Orsini M. de Souza, do Laboratório de Cultura Celular da Faculdade de Odontologia da USP, onde foram realizados os cultivos celulares e o Prof. Dr. Victor Elias Arana-Chavez, do Laboratório de Biologia dos Tecidos Mineralizados da USP, na realização das microscopias eletrônicas.

As amostras foram pesadas para que fossem calculadas as quantidades de meio de cultura α-MEM (Invitrogen, Louis, MO, EUA), necessárias para o teste de citotoxicidade indireta, para cada 1 g usou-se 10 mL de meio. Os materiais foram incubados a 37ºC, por 48 horas e esterilizados em autoclave por 20 minutos, temperatura de 121ºC, em seguida, foram colocados em frascos estéreis para evitar a contaminação das amostras.

Foram utilizadas células MC3T3-E1 p5 a p15, uma linhagem celular pré- osteoblástica, proveniente da calvária de camundongos Mus musculum recém nascidos. Essas

células ficam aderidas a uma superfície sólida, multiplicando-se. As células foram mantidas no meio de cultura, MEM-α, enriquecido com 10% de soro fetal bovino (SFB), que contém fatores que vão estimular a multiplicação celular. Foram condicionadas a uma temperatura de 37ºC, com atmosfera úmida de 5% de CO2. O meio foi trocado a cada 2-3 dias.

A confluência celular, número celular grande o suficiente para atingir toda a superfície da garrafa, foi verificada em microscópio invertido de contraste de fase, e assim que foi atingida, tripsinizada. As células foram contadas, em câmara de Newbauer, para que fosse calculada a densidade celular nos experimentos, aproximadamente 110 células/mm2 ~ 20000 células/poço. Os experimentos foram realizados em quintuplicata e repetidos 3 vezes.

Os testes de citotoxicidade in vitro têm caráter quantitativo; podem ser analisados

tanto da forma direta, como indireta, o que é feito por leitura de absorbância. Foram utilizados somente testes de citotoxicidade indireta, realizadas nos seguintes tempos experimentais: 3, 24 e 48 horas.

Foi utilizado como controle negativo de citotoxicidade, o próprio meio de cultura, e como positivo, a solução fenol 1%. As células foram colocadas em placas de 96 poços, em estufa por 48 horas. Passadas estas 48 horas, o meio foi substituído pelos extratos dos materiais, o controle positivo de citotoxicidade pelo fenol e o controle negativo foi mantido no meio de cultura. As placas foram colocadas em estufa e a análise foi efetuada com 3, 24 e 48 horas após a troca do meio pelos extratos. Em seguida, a placa foi preparada para a leitura de absorbância.

O meio de cultura foi retirado e os poços foram lavados com PBS estéril. Em seguida, foram colocados 90 µL de meio de cultura com 10% SFB, mais 10 µL de MTT a 5 mg/mL de tampão PBS estéril em cada poço e incubados a 37ºC por 1 hora. Transcorrido esse período, essa solução foi retirada e os poços lavados com tampão PBS. Em seguida, se adicionou 100 µL de DMSO (dimetilsulfóxido), em temperatura ambiente, para solubilizar os cristais de coloração azul/violeta, formados pela clivagem dos anéis de tetrazolium pela enzima SDH das mitocôndrias ativas. Após a solubilização, as soluções foram transferidas para uma nova placa de 96 poços e foi efetuada a leitura.

A citotoxicidade dos materiais foi avaliada por espectrofotometria no aparelho Leitor de Elisa (ELX 800 – Universal Microplate Reader – Bio-Tek Instruments, ICC, USA), em um comprimento de onda de 562 nm.

5.7.2 Teste Citoquímico Indireto

As células foram inoculadas sobre lamínulas de vidro de 13 mm de diâmetro, em placa de 24 poços e mantidas a 37ºC durante 24 horas. Após esse período, o meio foi trocado pelos extratos das ligas. Foi usado como controle positivo de citotoxicidade o fenol 1% + MEM-α, e como controle negativo uma lamínula de vidro, onde foi mantido o meio de cultura. Após o período de incubação, o meio foi retirado e as amostras foram lavadas com tampão PBS. Em seguida, as células foram fixas em formaldeído 4% em PBS, lavadas com o mesmo tampão e coradas com azul de toluidina. As análises foram realizadas e fotografadas em um microscópio invertido (modelo Axiovert 25, Carl Zeiss, Espanha).

5.7.3 Microscopia Eletrônica de Varredura

Sendo um teste qualitativo, por meio da microscopia eletrônica de varredura (MEV) pode-se observar a morfologia das células quando colocadas em contato direto com o material.

A análise foi efetuada após 24 horas do plaqueamento das células sobre as ligas. Usou-se como controle uma lamínula de vidro.

O meio de cultura foi retirado e os poços lavados com solução tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,4. As amostras foram fixadas na própria placa de cultivo com solução 0,1% de glutaraldeido + 4% de formaldeído em tampão cacodilato de sódio, por uma hora em temperatura ambiente. Transcorrido esse período, as amostras foram lavadas com o mesmo

tampão e pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 1%, por meia hora em temperatura ambiente. A seguir, as amostras foram desidratadas em crescente de etanóis e, logo após, dessecadas com hexametildisizilano (HMDS) a 100% e fixadas em stubs de alumínio. Finalmente, as

amostras foram metalizadas no aparelho Bal-Tec SCD 050, com uma camada de aproximadamente 25 mm de ouro, e examinadas em microscópio eletrônico de varredura JEOL 6100, operado com 15 kV.