Ensaio do crescimento e viabilidade das CTMH na presença de micropartículas de titânio

Durante o acompanhamento ao microscópio invertido das CTMH tratadas com titânio foi observado que as células continuavam a se dividir mesmo na presença de altas concentrações de cpTi (500 partículas/ célula).

O ensaio de MTT foi utilizado para medir diferenças nas taxas de proliferação das CTMH em diferentes condições experimentais. As CTMH caracterizam-se pela formação de uma população celular bastante heterogênea, portanto foram observadas diferenças na proliferação dentro das triplicatas do mesmo grupo experimental. A análise do MTT foi repetida várias vezes com as CTMH CUP004 e CTMH CUP010 tratadas com titânio, sendo que apesar das dificuldades inerentes à heterogeneidade encontrada dentro das CTMH, foi possível concluir que as partículas de titânio (até mesmo na dose mais alta 500 partículas/célula) não impedem a proliferação das CTMH (Figura 11).

Os resultados obtidos neste trabalho são diferentes daqueles descritos por Haleem-Smith e colaboradores (2011). Eles descreveram diminuição na viabilidade e proliferação celular de CTMH expostas a partículas de titânio numa maneira dose dependente, principalmente entre as doses 250 a 1000 partículas/ célula. Na concentração mais baixa (10 partículas/ célula) não foi observada diminuição na viabilidade. Na exposição 100 a 150 partículas/ célula houve redução da viabilidade, mas permaneceram CTMH suficientes em cultivo, de maneira que foi possível os autores analisarem outras respostas ao tratamento com titânio, como liberação de citocinas, diferenciação osteogênica e crescimento celular.

As diferenças observadas podem ter ocorrido por dois motivos principais: a fonte de CTMH e o tamanho das partículas de titânio utilizadas. Haleem-Smith e colaboradores (2011) testaram as partículas em CTMH isoladas da MO da cabeça femoral de pacientes com osteoartrite primária, tais CTMH já foram retiradas de um ambiente inflamatório dentro de um organismo idoso, por isso podem ser mais sensíveis ao titânio do que as CTMH aqui estudadas, que foram retiradas de cordões umbilicais de doadores jovens e saudáveis. Haleem-Smith e colaboradores (2011) utilizaram nanopartículas de titânio comercialmente puras (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), cuja distribuição de

67 tamanho ficou entre 0,2-0,8µm, ou seja, elas são muito menores do que aquelas utilizadas no presente trabalho que têm sua maior distribuição em 3,6 µm de tamanho, portanto trabalhamos com micropartículas. As partículas de menor tamanho provavelmente produzem maior citotoxicidade nas CTMH. Papageorgiou e colaboradores (2007) compararam os efeitos biológicos da exposição às micro e nanopartículas de cobalto-cromo e afirmaram que um fator essencial é a maneira pela qual o metal é apresentado à célula. Segundo os autores, as nanopartículas são dissolvidas ou corroídas rapidamente dentro de vacúolos espalhados no citoplasma, as micropartículas não se dissolvem tão rapidamente, elas persistiram por pelo menos 5 dias após a exposição e ficaram situadas ao redor do núcleo. Este padrão sugere que depois da ingestão, as nanopartículas produzem um aumento rápido na concentração de metal por todo o citoplasma, enquanto que as micropartículas são responsáveis por uma liberação mais lenta de metal e somente ao redor do núcleo. A liberação de metal mais lenta pelas micropartículas seria a responsável pelo dano menor nas mitocôndrias, membranas, proteínas e lipídios, resultando em menor citotoxicidade (Papageorgious et al., 2007).

Outra questão que poderia surgir é que a redução da viabilidade nas CTMH da MO foi causada pela presença de endotoxinas aderentes ao titânio, considerando-se que o grupo do Dr Edward Greenfield defende a tese de que são as endotoxinas que disparam as respostas inflamatórias (Greenfield et al., 2005; Nalepka et al., 2006; Tatro et al., 2007; Greenfield et al., 2008; Greenfield

et al., 2010; Bonsignore et al.,2011). Entretanto, Haleem-Smith e colaboradores

(2011) utilizaram o método completo de remoção de endotoxinas (Ragab et al., 1999) utilizado pelo grupo do Dr Greenfield, entretanto, eles não dosaram os níveis de endotoxinas após o tratamento de remoção das mesmas. O ideal é que os pesquisadores utilizassem o teste espectrofotométrico Limulus amoebocyte lysate assay – teste LAL (detection limit = 0.01 endotoxin units/ mL; Biowhittaker, Walkersville, MI, U.S.A.) para ter a certeza da remoção total das endotoxinas.

Recentemente foi estabelecido que é necessário realizar uma limpeza rigorosa das próteses a fim de reduzir a resposta inflamatória mediada por macrófagos induzida por micropartículas (Schwab et al., 2011). As partículas limpas induzem nenhuma ou pouca secreção de TNFα pelos macrófagos in

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vitro quando comparado ao aumento na secreção após a exposição à LPS

ligada às partículas ou expostos às partículas “sujas” (como recebidas do fabricante). Entretanto, os autores enfatizam que o LAL não deve ser o único teste de escolha para verificar a remoção de contaminantes, pois ele é o teste de escolha para contaminação por LPS, a presença de outros patógenos, ou até mesmo de resíduos derivados do próprio procedimento de lavagem não deve ser ignorada. Além disso, eles afirmaram que nem o conteúdo de endotoxinas nas partículas e nem o tratamento de limpeza das mesmas afetaram a resposta mediada por macrófagos e a citotoxicidade das partículas quando os experimentos foram realizados com um altíssimo número de cpTi. Schwab e colaboradores (2011) concluíram seu estudo dizendo que são necessárias mais pesquisas para melhor compreensão da citotoxicidade associada com altos números de debris de titânio no contexto da osteólise.

69 Figura 11. Viabilidade das CTMH medida pelo teste MTT. A) Crescimento celular no controle negativo; B) Crescimento celular com 200 partículas/células; C) Crescimento celular com 300 partículas/células; D) Crescimento celular com 400 partículas/células; E) Crescimento celular com 500 partículas/células. As partículas de titânio não impediram a proliferação das CTMH.

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9. Análises de imagens – Microscopia Eletrônica de Varredura e