Isolamento das CTMH do cordão umbilical

Foram realizados experimentos de isolamento de células do sangue, veia e geleia (Can e Karasenoiglu, 2007) com o objetivo de identificar a melhor fonte de CTMH do cordão umbilical.

A tabela 2 demonstra os resultados obtidos na tentativa de se isolar as CTMH de diferentes fontes do mesmo cordão e as análises que foram realizadas em cada um deles.

Foi possível iniciar o cultivo de células aderentes, expandi-las por várias passagens, fazer os procedimentos de diferenciação e a análise por citometria de fluxo (atingindo todos os critérios exigidos por Dominici et al., 2006) em 50% dos cordões doados (CUP001, CUP003, CUP004, CUP009, CUP010 e CUP012).

Foi possível iniciar o cultivo, as células aderiram ao frasco, foi realizada a análise citogenética, porém não houve expansão celular suficiente para a realização de todos os experimentos, pois as células morreram em passagens iniciais, em duas amostras (CUP005, CUP006); ou houve expansão celular de boa qualidade, o material está criopreservado, mas ainda não foram realizados todos os testes em uma amostra (CUG010).

Houve contaminação bacteriana logo nas primeiras horas de cultivo das células isoladas de três cordões (CUP002, CUP008, CUP011). Em outra amostra, as células aderiram ao frasco, mas apresentaram baixa proliferação celular (CUP007), e na tentativa de expansão das células do último cordão (CUP013) houve contaminação durante o cultivo, não sendo possível realizar a análise citogenética.

41 Tabela 2 - Fontes de CTMH de diferentes cordões e as análises realizadas nas células isoladas de cada cordão doado.

Cordão umbilical Sangue (CUS) Parede da veia (CUP) Geleia de Wharton (CUG) Análises 001 - ++ - DIF; CF; AC

002 - - - Contaminação bacteriana inicial

003 NR ++ NR DIF; CF; AC

004 NR ++ NR Todos os ensaios

005 NR + NR Expansão até a P6, AC

006 NR + NR Expansão até a P4, AC

007 NR - NR Expansão até a P3

008 NR - NR Contaminação bacteriana inicial

009 NR ++ NR DIF; CF; AC

010 NR ++ + Todos os ensaios

011 NR - NR Contaminação bacteriana inicial

012 NR ++ NR DIF; AC; CBMN; CAT/SOD

013 NR + NR Contaminação bacteriana no

cultivo

CUS = sangue do cordão umbilical; CUP = parede da veia do cordão umbilical; CUG = geleia do cordão umbilical; NR = o procedimento não foi realizado; - = o procedimento foi realizado, mas não foram obtidos resultados; + = foi possível iniciar o cultivo de células aderentes, mas o cultivo deteriorou; ++ = foi possível isolar e caracterizar as células-tronco mesenquimais; DIF = ensaios de diferenciação; CF = ensaio de citometria de fluxo; AC = análise citogenética; CBMN = ensaio para análise de micronúcleo e outras alterações nucleares; CAT/SOD = ensaio para análise de expressão da catalase e da super-óxido- desmutase.

42 Os pontos fundamentais para o sucesso no isolamento e expansão foram: a) o cordão deve ser coletado de um “parto limpo”, dois cordões (CUP002, CUP011) vieram de partos normais feitos na cama sem assepsia prévia, o trabalho de parto já estava muito avançado quando as parturientes chegaram ao hospital; b) o cordão deve ser transportado em PBS com antibióticos/ antimicótico o mais rápido possível ao laboratório, sempre processado em condições extremamente estéreis; c) o cordão deve ser lavado várias vezes com PBS com antibióticos/ antimicótico, retirando todo resíduo de contaminação e de sangue; d) depois do estabelecimento de células aderentes, ao decorrer do cultivo in vitro, é necessário controle rígido na manipulação de CTMH para evitar a contaminação de bactérias/fungos e não haver contaminação cruzada entre as linhagens celulares obtidas de diferentes cordões.

Neste trabalho, a melhor fonte para o isolamento das CTMH foi a parede da veia do cordão, esse dados estão de acordo com estudos publicados por outros grupos (Panepucci et al., 2004; Kadivar et al. 2005, 2006; Romanov et

al., 2003; Koh et al., 2008; Ishige et al., 2009; Li et al.,2010), e com a hipótese

discutida por Meirelles e Nardi (2009) de que a localização in vivo das CTMH pode ser na parede dos vasos sanguíneos. Com a prática, a técnica de manipulação da veia tornou-se fácil e rápida, propiciando um cultivo inicial com poucas células sanguíneas contaminantes.

O investimento de tempo e material para o isolamento das CTMH do sangue do cordão não foi vantajoso, poucas células mononucleadas foram isoladas e aderiram ao frasco, entretanto em poucas horas elas se tornaram células gigantes e muito vacuolizadas, havendo a perda do cultivo em 48 horas (CUS001, CUS002). Estes dados estão de acordo com aqueles descritos por Rebelatto e colaboradores (2008) e por Secco e colaboradores (2008) que também compararam diferentes fontes de obtenção de CTMH e obtiveram o menor índice de sucesso com o procedimento no sangue do cordão umbilical. Secco e colaboradores (2008) afirmaram que o procedimento de estocar o sangue do cordão criopreservado em bancos públicos e/ou privado não é o mais adequado. Entretanto, o protocolo proposto por Hussain e colaboradores (2012) não foi testado no presente trabalho. Eles desenvolveram um novo método para isolar grandes quantidades de CTMH do sangue do cordão

43 umbilical, conseguiram que as células mostrassem diferenciação neurogênica (expressão de SOX2 e Olig4) e adipogênica (expressão de FABP-4), e concluíram que o sangue umbilical é uma boa fonte de CTMH se for utilizado o método descrito por eles.

Tem se demonstrado que a geleia de Wharton é uma boa fonte para o isolamento das CTMH (Can e Karahuseinoglu, 2007; Fu et al., 2006; Secco et

al., 2008). No presente estudo foi realizada esta tentativa em três cordões

(CUG001, CUG002, CUG010), nas duas primeiras não foi obtido sucesso. Isto ocorreu porque não foi possível retirar as células do excesso de material gelatinoso, poucas células aderiram ao frasco e logo se tornaram grandes, vacuolizadas e morreram. Na terceira tentativa, foram realizadas adaptações na metodologia, a tripsina passou a ser utilizada em conjunto com a colagenase para desagregação enzimática (como descrito em material e métodos), toda a suspensão gelatinosa foi descartada após as centrifugações e assim foi possível separar as células do excesso de muco. Portanto, foi possível isolar e expandir células retiradas da geleia (CUG010). Tais células não passaram pelos procedimentos exigidos para que sejam consideradas CTMH, entretanto seu aspecto morfológico e sua cinética de divisão celular foram muito semelhantes às CTMH retiradas da veia do mesmo cordão (CUP010). Apesar de ser uma técnica mais demorada do que a de isolamento da veia, conclui-se que a geleia é uma boa fonte de CTMH, considerando-se principalmente as pesquisas que apontam esta fonte como a mais adequada para experimentos que desejem realizar a diferenciação neural e em cardiomiócitos das CTMH (Fu et al., 2004, 2006; Baksh et al., 2007; Karahuseyinoglu et al., 2007; Ishige et al., 2009; Fan et al., 2011; Chen et al., 2012; Lee et al., 2012).

2. Manutenção do cultivo das CTMH/ Recuperação pós-