ENSAIO DE SOLUBILIDADE

O ensaio de solubilidade do IBF em diferentes óleos e tensoativos foi realizado como um estudo de pré-formulação para seleção dos componentes da formulação autoemulsificante a ser desenvolvida. Os resultados obtidos estão representados na Tabela 8.

Tabela 8: Solubilidade do Ibuprofeno em diferentes matérias primas. Óleo / TA Solubilidade média (mg/ml)

Óleos

MOD® 35,13 ±1,89

Cetiol V® 32,48 ± 1,80

Óleo de amêndoas 30,09 ± 7,10

Óleo de semente de uva 29,52 ±8,19

Tensoativos

Glicerox® 510,32 ±38,48

Transcutol® CG 414,90 ± 22,97

Tween® 80 >333,33

Cocoate BG® 215,92 ± 17,31

* Média ± desvio padrão (n = 3)

O MOD®,Cetiol V®, óleo de amêndoas e óleo de semente de uva foram os candidatos a compor a fase oleosa do sistema autoemulsificante a ser desenvolvido. Dentre estes, o MOD® foi o óleo no qual o IBF apresentou maior solubilidade. Este óleo é formado por longa cadeia carbônica e por isso pode ser capaz de formar emulsões que permitam o transporte do IBF diretamente para a circulação linfática, evitando seu metabolismo hepático (SHARMA et al, 2012). Considerando ainda o fato de que este óleo havia sido amplamente estudado e caracterizado em trabalho prévio publicado por nosso grupo de pesquisa (FERNANDES et al, 2014), optou-se por selecioná-lo como componente da fase oleosa do sistema autoemulsificante a ser desenvolvido

O Transcutol® CG, Cocoate BG®, o Glicerox® e o Tween® 80 são tensoativos, e o IBF mostrou-se altamente solúvel nestas matérias primas. O Glicerox® foi o que apresentou maior solubilidade, seguido do Transcutol® CG, Tween® 80 e Cocoate BG®. O fármaco foi adicionado em cada uma das matérias-primas avaliadas em quantidades diferentes, de acordo com capacidade aparente de cada meio solubilizar o ativo. Esta quantidade de fármaco adicionada foi anotada, para o caso de, eventualmente, ser útil nos cálculos da solubilidade. No caso do Tween® 80, mesmo com a adição de um aparente excesso de fármaco, após as 48 horas o fármaco adicionado encontrava-se completamente solubilizado. Sendo assim, não foi possível determinar a solubilidade exata do IBF no Tween® 80. No entanto, de acordo com a

quantidade de IBF adicionado (1g) e com o volume de meio utilizado no teste (3ml) , pode-se sugerir que a solubilidade do IBF no Tween® 80 seja superior a 333,33mg/ml. Resultado semelhante foi descrito por Saritha e colaboradores (2014), que encontraram a solubilidade no Tween® 80como sendo igual a 314.89±2.1 mg/ml.

A avaliação da solubilidade do IBF no Span 80® foi realizada. Entretanto, após as 48 horas o sistema estava completamente endurecido, o que impossibilitou a coleta do sobrenadante para análise. A informação da solubilidade do IBF no Span®80 foi descrita por Saritha e colaboradores (2014) como sendo igual a 134,8±0,4mg/ml.

Os tensoativos não iônicos, como por exemplo, Tween® 80 e Span® 80, são frequentemente utilizados em sistemas autoemulsificantes, visto que são menos tóxicos e menos afetados pelo pH do meio (SARITHA et al, 2014). O equilíbrio hidófilo-lipófilo (EHL) é uma medida do grau de hidrofilicidade e lipofilicidade de uma substância. A escala de EHL varia de 0 a 20, na qual o valor 20 equivale a uma molécula completamente hidrofílica, e o valor zero, a uma substância totalmente lipofílica. A estabilidade de emulsões depende também do balanço entre valores alto e baixo de EHL dos tensoativos que compõem a formulação (ZHAO et al, 2015).

Os tensoativos Tween® 80 e Span® 80 possuem valor de EHL iguais a 15 e 4,3, respectivamente (FERNANDES et al, 2014). Por apresentarem valores distantes na escala de EHL, esta dupla de tensoativos torna-se uma mistura potencialmente promissora para a preparação de sistemas autoemulsificantes (KOMMURU et al, 2001). Fernandes e colaboradores (2014) utilizaram o Tween® 80 como tensoativo e o Span® 80 como cotensoativo, corroborando com a escolha desta dupla para continuidade do estudo.

Como mencionado, o IBF mostrou-se altamente solúvel no tensoativo Glicerox®, que apresenta valor de EHL igual a 14,1, semelhante ao Tween® 80. Sendo assim, para desenvolvimento do sistema autoemulsificante testaram-se as duplas de tensoativo/cotensoativo Tween® 80/Span® 80 e Glicerox®/Span® 80.

5.3 DESENVOLVIMENTO DOS SISTEMAS AUTOEMULSIFICANTES

O diagrama de fases foi obtido com o objetivo de identificar os melhores componentes e as melhores combinações entre estes, de modo a apontar as potenciais formulações candidatas à incorporação do IBF. A composição das formulações e as variações consideradas para obtenção do diagrama foram previamente especificadas na Tabela 3 e na Figura 6.

As formulações dos sistemas autoemulsificantes foram preparadas como previamente descrito e analisadas após três dias. A tendência do sistema à emulsificação espontânea foi julgada como boa ou ruim, conforme previamente mencionado. Esta avaliação possui caráter qualitativo, trata-se de um indicativo das características das emulsões formadas a partir dos sistemas autoemulsificantes desenvolvidos quanto à sua facilidade de emulsificação. Este teste é útil, no sentido de que ajuda a estabelecer as proporções mais promissoras entre componentes da formulação, as quais darão continuidade ao estudo. Os resultados verificados encontram-se sumarizados na Tabela 9 e Figura 13. As regiões destacadas no diagrama pseudoternário indicam as proporções entre fase oleosa e TA/CoTA que originaram formulações autoemulsificantes, de acordo com a observação visual da tendência a emulsificação.

Tabela 9: Valores de tamanho médio das partículas, índice de polidispersão (IP) e tendência à emulsificação das formulações autoemulsificantes obtidas para construção do diagrama de fases. Formulação % Fase oleosa % Tensoativos Tamanho médio das partículas (nm)* IP* Tendência a emulsificação 1A 70% 30% 94,76 ± 10,81 0,41 ± 0,04 Ruim 1B 60% 40% 92,82 ± 0,02 0,22 ± 0,01 Boa 1C 50% 50% 65,62 ± 12,92 0,25 ± 0,04 Boa 1D 40% 60% 166,55 ± 14,21 0,51 ± 0,04 Ruim 1E 30% 70% 282,18 ± 16,09 0,52 ± 0,07 Ruim 2A 70% 30% 1940,50 ± 822,37 0,66 ± 0,08 Ruim 2B 60% 40% 1661,85 ± 773,79 0,51 ± 0,09 Ruim 2C 50% 50% 1599,83 ± 202,48 0,35 ± 0,13 Ruim 2D 40% 60% 794,43 ± 250,70 0,38 ± 0,20 Ruim 2E 30% 70% 151,97 ± 5.08 0,50 ± 0,09 Boa 3A 70% 30% 520,8 ± 243,10 0,50 ± 0,10 Ruim 3B 60% 40% 181,52 ± 58,10 0,53 ± 0,12 Ruim 3C 50% 50% 51,60 ± 8,19 0,36 ± 0,10 Boa 3D 40% 60% 104,02 ± 90,12 0,35 ± 0,13 Boa 3E 30% 70% 161,11 ± 117,02 0,46 ± 0,02 Ruim 4A 70% 30% 1068,20 ± 1207,46 0,51 ± 0,48 Ruim 4B 60% 40% 957,60 ± 1030,82 0,55 ± 0,41 Ruim 4C 50% 50% 930,10 ± 1035,06 0,35 ± 0,11 Ruim 4D 40% 60% 638,93 ± 623,56 0,19 ± 0,12 Ruim 4E 30% 70% 256,08 ± 78,59 0,42 ± 0,22 Ruim * Média ± desvio padrão (n = 3)

Figura 13: Diagrama pseudoternário de sistemas tensoativo-cotensoativo-óleo. Evidenciadas em amarelo (1B), vermelho (1C), verde (2E), azul (3C) e roxo (3D) as áreas de autoemulsificação das respectivas formulações.

O tamanho de partícula é um parâmetro que apresenta relação direta com a estabilidade, biodistribuição e liberação do ativo. Partículas com tamanho médio inferior a 200nm foram obtidas nas formulações 1A, 1B, 1C, 1D, 2E, 3B, 3C ,3D e 3E. De acordo com esse parâmetro, tais sistemas podem ser classificados como sistemas autonanoemulsificantes (SNEDDS) (CERPNJAK et al, 2013). Dentre estas formulações apenas a 1B, 1C, 2E, 3C e 3D demonstraram uma tendência à emulsificação espontânea considerada satisfatória (“boa”), pois, ao ser adicionada água ao sistema (proporção 1:100), a emulsão formada mostrou-se fina, homogênea, transparente ou azulada, características compatíveis com um sistema nanoestruturado. As demais apresentaram pouca ou nenhuma emulsificação, com imediata separação das fases, principalmente após a interrupção da agitação, e por esse motivo tiveram sua tendência à emulsificação espontânea considerada “ruim” (ZAGHLOUL et al, 2011; KANG et al, 2012).

Existe uma relação direta, comumente observada, entre o tamanho das gotículas formadas na emulsão e a concentração empregada de tensoativo. O aumento da concentração de tensoativos leva à formação de micelas menores, o que pode ser explicado pela estabilização das gotículas promovida pela presença do tensoativo na interface óleo-água

(WADHWA et al, 2011). Esta tendência é claramente observada nas formulações 2 e 4, compostas pela dupla Glicerox® e Span® 80. As subformulações 2E e 4E, que apresentam 70% de tensoativos em sua composição, geraram emulsões com tamanho médio de partícula bastante reduzido, quando comparadas às demais subformulações, com menores proporções de tensoativos. No entanto, para as formulações 1 e 3, compostas pela dupla Tween®80 e Span®80 esta observação não se repete do mesmo modo. Observa-se que o aumento da concentração de tensoativos, em ambas as formulações, gera emulsões com menor tamanho de partícula até a proporção máxima de 50% (subformulações 1C e 3C). A partir desta concentração, a presença dos tensoativos na formulação faz com que as emulsões formadas apresentem maior tamanho de partícula. Esse fenômeno pode ser atribuído à ruptura da camada interfacial provocado pelo aumento exacerbado da penetração de água nas gotículas de óleo, desencadeado pela elevada concentração de tensoativo no sistema, levando à ejeção das gotículas de óleo para a fase aquosa (WADHWA et al, 2011; KOMMURU et al., 2001; CRAIG et al, 1995). Possivelmente, esta observação se deve também à interação específica da dupla de tensoativos com o óleo selecionado (MOD®). Por apresentar cadeia carbônica longa, pode haver certa influência na curvatura do filme interfacial formado (KOMMURU et al., 2001).

Craig e colaboradores (1995) desenvolveram sistemas autoemulsificantes e verificaram que, ao empregar maiores proporções de Tween® 80 não houve tendência à emulsificação espontânea. Devido à elevada solubilidade aquosa apresentada pelo Tween® 80 é provável que grande parte de sua molécula fique dissolvida no meio aquoso. Semelhante observação foi feita por Zhao e colaboradores (2015), que verificaram que, ao utilizar mais de 50% de tensoativos em uma formulação, o fenômeno da autoemulsificação não ocorreu, confirmando que a eficiência de emulsificação não está relacionada unicamente à concentração de tensoativos, mas sim ao sinergismo entre os componentes da formulação.

A partir das 20 formulações inicialmente testadas, chegou-se a cinco formulações que apresentaram características de autoemulsificação e tamanho de partícula satisfatórios. Dentre estas, quatro foram selecionadas para serem continuadas nas etapas subsequentes do trabalho, sendo elas a 1C, 2E, 3C e 3D.

A formulação 1B, apesar da emulsificação espontânea, não foi selecionada, pois, dentre as 5 formulações candidatas é a única que possui baixa concentração de tensoativos, o que poderia impactar diretamente na solubilidade do IBF, parâmetro muito importante nos ensaios seguintes.

5.4 TESTES DE INCORPORAÇÃO DO ATIVO

A partir dos resultados de distribuição de tamanho de partícula observados no estudo do diagrama de fases, as formulações selecionadas foram submetidas ao teste de incorporação do IBF, com a adição do fármaco em concentrações crescentes (100, 200, 300 e 400mg). Os dados estão representados na Figura 14.

Para análise estatística dos dados obtidos aplicou-se em todos os casos o teste one-way ANOVA seguido pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni, para avaliar as diferenças entre os grupos estudados, e o teste t-Student para cada uma das triplicadas.

Não foram identificadas diferenças significativas entre as formulações 1C branco (sem IBF) e 1C contendo IBF quanto à distribuição de tamanho de partícula (p>0.05, ANOVA).

Para as formulações do grupo 2E verificou-se que há diferenças significativas entre as formulações 2E branco, comparadas às formulações contendo o ativo (p< 0,05, ANOVA). Porém, não houve diferença estatística entre as formulações contendo as crescentes concentrações de IBF (p>0.05, ANOVA).

Não há diferenças estatisticamente significativas entres a formulação 3C branco e as formulações contendo o ativo (p< 0,05, ANOVA), bem como entre as formulações contendo as crescentes concentrações de IBF.

A formulação 3D apresentou diferenças significativas entres a formulação 3D branco, comparada às formulações 3D contendo IBF (p< 0,05, ANOVA). Na comparação entre as formulações contendo as crescentes concentrações de IBF observa-se que não há diferença estatística significativa entre as formulações, exceto entre as formulações 3D-100mg e 3D 400mg, e 3D200mg-3D-400mg.

Sumarizando, para as formulações 1C e 3C não houve diferença estatisticamente significativa entre os brancos e as formulações contendo IBF, e nem entre as formulações com diferentes concentrações de IBF. Esta mesma observação não se repete com as formulações 2E e 3D. Tal resultado indica que a presença do IBF na formulação não altera de maneira significativa o tamanho médio das partículas obtida na emulsão oriunda das formulações autoemulsificantes em questão (1C e 3C).

O aumento do tamanho de partícula observado com a inclusão do IBF na formulação autoemulsificante, ainda que estatisticamente não significativo, como nos casos das formulações 1C e 3C, pode ser atribuído à solubilização preferencial do fármaco no filme interfacial (formado pela dupla de tensoativo e cotensoativo), aumentando assim a tensão

interfacial e reduzindo a flexibilidade da camada tensoativa. Além disso, a inclusão do fármaco pode induzir uma agregação dos tensoativos, reduzindo sua eficiência. A inclusão do ativo pode ainda, em alguns casos, prejudicar a capacidade de autoemulsificação do sistema (ZHAO et al, 2015; WANG et al, 2015).

Zhao e colaboradores (2015) e Wang e colaboradores (2009), que desenvolveram e compararam, em seus respectivos estudos, sistemas autoemulsificantes com e sem IBF, também observaram este aumento do tamanho de partícula ao comparar as mesmas formulações, com e sem a inclusão de IBF.

Figura 14: Teste de incorporação de concentrações crescentes do Ibuprofeno. * Sub formulações dentro dos grupos são estatisticamente iguais.

O potencial Zeta reflete a carga superficial das partículas, o qual é influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão da dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de espécies iônicas presentes no meio aquoso de dispersão. A importância da avaliação do potencial Zeta é devido à sua relação com a estabilidade de dispersões coloidais, como as emulsões. Quando este valor, em módulo, é pequeno, a atração entre as gotículas excede a repulsão, levando à quebra e floculação da dispersão. Valores menores que -20 mV são comumente associados à boa estabilidade física e química (PUND, SHETE, JAGADALE, 2014; OHA et al, 2011) Geralmente, em sistemas autoemulsificantes esse parâmetro apresenta valores negativos devido à presença de ácidos graxos livres na superfície das gotículas, e também por originarem emulsões do tipo óleo em água (SINGH et al, 2011; NAWALE; SALUNKE; JADHAV, 2015; OBITTE et al, 2013)

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1.000 1C* 2E 3C* 3D T am an h o d e p ar tícul a (n m ) Formulações Branco 100mg 200mg 300mg 400mg

Após a aplicação do teste one-way ANOVA seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni para avaliar as diferenças entre os valores de potencial Zeta não foram identificadas diferenças significativas entres as formulações contendo concentrações crescentes de IBF (p > 0.05). Todos os valores apresentaram-se entre -35,8 e -15mV. Resultados semelhantes foram encontrados por Saritha e colaboradores (2015), cujas formulações autoemulsificantes apresentaram potencial Zeta entre -27,7 e -39,54mV. Estas observações indicam que a concentração do IBF nas formulações não altera sua carga superficial, sugerindo que, possivelmente, não haja ativo adsorvido à superfície da partícula.

5.5 DESENVOLVIMENTO DE SISTEMA AUTOEMULSIFICANTE CONTENDO