Ensaio de Inibição da migração de neutrófilos induzida pela CvL através do uso de antiinflamatórios

Uma hora antes da indução da migração de neutrófilos por CvL, os camundongos foram tratados com Celecoxibe, um anti inflamatório não esteróide seletivo, com diclofenaco, um antiinflamatório não esteróidal não seletivo e a dexametasona, um antiinflamatório com efeito antagonista de citocinas. Os antiinflamatórios não esteroidais, Diclofenaco e a dexametasona, ambos inibidores inibiram a migração induzida por CvL e o efeito de dexametasona foi 66% mais efetivo, indicando uma inibição da liberação de citocinas. Também foi observada uma diminuição da migração devido ao efeito do Diclofenaco, um inibidor não seletivo de ciclooxigenases. O inibidor específico para ciclooxigenases, Celecoxib não afetou a indução de migração de neutrófilo por Cvl. Os dados obtidos são indicativos da participação de macrófagos na indução de migração de neutrófilo para a cavidade peritoneal de camundongos, uma vez que citocinas liberadas por macrófagos, especialmente IL8, são potentes quimioatractantes de neutrófilos (figura 8).

Figura 8. Efeito da dexametasona (antagonista de citocinas), diclofenaco (anti-inflamatório não

esteróide não seletivo) e celecoxibe (anti-inflamatório não esteróide seletivo) na migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de camundongos induzida por CvL. Os animais foram tratados com salina, ou com uma das drogas refereidas antes de serem injetados com CvL (50 µg/cavidade). Os neutrófilos foram contados 24h após a injeção de CvL. Os resultados referem-se às médias mais desvio padrão dos resultados obtidos a partir de 6 camundongos. Letras iguais indicam que não há diferença estatisticamente significante. (p<0,01). (ANOVA Bonferroni).

5.

DISCUSSÃO

Diversas proteínas bioativas como as lectinas têm sido isoladas de invertebrados marinhos incluindo os do filo Porifera. A lectina purificada da esponja marinha Cliona varians, denominada de CvL (6), é uma glicoproteína de ~114 kDa, que hemaglutinou preferencialmente eritrócitos humanos do tipo A papainizados. Essa lectina tem a atividade dependente de íons cálcio e é formada por 4 sub-unidades de aproximadamente 28 kDa cada, unidas por pontes dissulfetos. Na caracterização de CvL foi confirmado que a galactose era o mais potente inibidor mostrando que CvL se comportou como uma lectina galactose específica semelhante as de C. alloclada (90), P. semitubulosa (89), Axinella polypoides (92) e Haliclona cratera (88). Quatro lectinas purificadas da Axinella polypoides (92) e a lectina da esponja Haliclona cratera também apresentaram especificidade para D- galactose, atividade independente de cátions divalentes e efeito citotóxico contras células HeLa (88). A dependência por íons cálcio permitiu confirmar a inclusão dessa lectina no grupo das lectinas do tipo C. Da mesma forma, outras lectinas de esponjas marinhas também foram incluídas no Tipo C, como a lectina da Cinachyrella alloclada que também apresentou especificidade para D-galactose e efeito mitogênico em linfócitos do sangue periférico de humanos (90). A lectina da Pellina semitubulosa que mostrou forte efeito mitogênico em linfócitos do baço de camundongos, sendo capaz de se ligar na superfície de linfócitos B e T, de ser endocitada por macrófagos e de aumentar a liberação de interleucina 1 dos macrófagos do peritônio de camundongos (89). Além de que um considerável número de lectinas de invertebrados marinhos, incluindo aquelas isoladas das esponjas, foram relatadas como tendo especificidade em se ligar a D-galactose (102, 103). Esta característica de ter a galactose como monossacarídeo específico, geralmente, aparecem envolvidas de forma importante na modulação da resposta imune em animais marinhos (104-106).

Várias lectinas, especialmente as de origem vegetal demonstraram habilidade em ativar células do sistema imune de mamíferos, especialmente aquelas com especificidade para monossacarídeos como a D-galactose e a D-manose (7-9). No presente trabalho, nós investigamos o efeito da CvL, lectina D-galactose específica, sobre a migração de leucócitos in vivo, um importante evento celular que ocorre no processo inflamatório em mamíferos. De acordo com os resultados obtidos, a CvL causou edema nas patas dos camundongos tratados com CvL em todas as concentrações testadas de uma forma dose-dependente. Sendo que na dose de 50 µg/pata a CvL foi significativamente superior a solução de carragenana a 1%. Respostas semelhantes foram relatadas para lectinas de origem vegetal como as lectinas da Artocarpus integrifólia (14), da Erythrina veluntina (107) e da Talisia esculenta (11) que induziram edemas de patas em animais tratados com estas lectinas.

A CvL também foi avaliada quanto a sua capacidade de induzir in vivo a migração de leucócitos e foi observado que após 4 horas (fase aguda da inflamação) da injeção intraperitoneal de CvL (50 µg/cavidade peritonial) em camundongos ocorreu uma significativa migração de leucócitos, quando comparado com o grupo que recebeu apenas solução salina e foi semelhante ao grupo tratado com fMLP (formyl-Met-Leu-Phe) (0,05 µg/cavidade), um tripeptídeo sintético de ação quimiotáctica que mimetiza a ação de peptídeos bacterianos, sendo um potente indutor da migração leucocitária. A migração leucocitária máxima foi observada após 24 horas do contato com CvL. A migração foi significantemente reduzida quando a CvL foi previamente incubada com D-galatose e injetada na cavidade peritoneal, indicando que a atividade indutora da migração leucocitária causada pela CvL foi decorrente da sua habilidade em se ligar a sítios contendo D-galactose e que estes sítios podem mediar essa atividade pró-inflamatória. Resultados semelhantes foram obtidos para a lectina de Artocarpus integrifolia (14), e para a lectina purificada de Erythrina veluntina (107), em modelos de peritonite em ratos.

O tioglicolato, (ácido tioglicólico), rotineiramente utilizado como recrutador de macrófagos (108-110) foi usado nos modelos de peritonite em camundongos como indicativo

da participação destas células ou de compostos liberados pelos macrófagos na indução da migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal. O tratamento com tioglicolato elevou a população de macrófagos em 2,3 vezes, o que acarretou o aumento da migração de neutrófilos induzida por CvL em 77%. Estes resultados mostraram que os invertebrados marinhos também possuem lectinas com a habilidade de modular o recrutamento de neutrófilos por um mecanismo indireto, como ocorre em outras lectinas de origem vegetal, especialmente aquelas purificadas das sementes de E. veluntina (107), de Glycine max (8), da T. esculenta (11), de Vatarea macrocarpa (7), de Lonchocarpus sericeus (111), e de Pisum arvense (112). Para corroborar este resultado, os animais tratados com tioglicolato e posteriormente injetados com fMLP, um típico quimioatractante de neutrófilo, não tiveram aumento significativo da migração de neutrófilos quando comparados com os grupos controles.

Nos estágios precoces do processo inflamatório, os macrófagos, mastócitos e linfócitos participam no controle da migração neutrofílica. Esse controle é mediado via liberação de fatores quimiotácticos como leucotrienos (113), componentes do sistema complemento (114), citocinas, principalmente interleucina -1 (IL-1), interleucina -8 (IL-8) e fator de necrose tumoral (TNF-α) (115, 116). Considerando que a migração de neutrófilos induzida pela CvL seguiu uma via indireta, ou seja, mediada por macrófagos, o que ficou evidenciado através do ensaio com o tioglicolato, resolvemos investigar os possíveis mediadores químicos envolvidos neste evento. Para isso utilizamos as seguintes drogas: o celecoxibe um antiinflamatório não esteróide seletivo para a ciclooxigenase II, o diclofenaco um antiinflamatório não esteróide e não seletivo para a ciclooxigenase II e a dexametasona um antiinflamatório esteróide que também é antagonista de citocinas. Entre esses inibidores da inflamação, a dexametasona reduziu de forma significativa a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal após a estimulação pela CvL. Este efeito inibitório da dexametasona poderia ser explicado através do bloqueio causado por essa droga na liberação dos fatores quimiotácticos pelos macrófagos estimulados pela lectina (117), especialmente IL-8. (101).

Conseqüentemente, podemos postular que esses resultados favorecem a hipótese de que a migração de neutrófilos induzida pela CvL poderia, possivelmente, ser mediada através da liberação de citocinas pelos macrófagos residentes na cavidade peritoneal, uma vez que estas células representam uma importante fonte de citocinas. Os resultados relatados neste trabalho demonstram que a lectina galactose específica obtida da esponja marinha Cliona varians possui atividade pró-inflamatória, que induz a migração neutrofílica provavelmente via liberação de citocinas a partir de macrófagos. Estas descobertas indicam que estas lectinas podem ser utilizadas como ferramentas para melhor compreender os mecanismos envolvidos nas respostas inflamatórias e nos eventos celulares da inflamação.

Este trabalho mostra que o isolamento e a caracterização de proteínas de invertebrados marinhos tem se tornado um vasto campo de pesquisa na área das ciências da vida. Muitas moléculas bioativas de origem marinha têm atraído mais e mais atenção dos cientistas graças as suas extensivas aplicações fisiológicas, biológicas e farmacológicas. A importância biotecnológica dessas moléculas de origem marinha tem crescido imensamente graças a descoberta desses novos produtos.

6. CONCLUSÕES

• A lectina, denominada de CvL, purificada da esponja Cliona varians apresentou atividade pró-inflamatória, sendo capaz de induzir a formação de edema de pata dose dependente em camundongos.

• CvL aumentou em 400% a migração leucocitária no modelo experimental de peritonite na fase aguda (4h) quando comparado com o controle mantendo-se estável até 72h;

• A habilidade da CvL em induzir a migração leucocitária foi inibida significantemente com a adição de D-galactose, indicando ser a ligação dessa proteína com carboidratos o agente pró-inflamatório;

• Tioglicolato potencializou a migração de leucócitos induzida por CvL através da estimulação dos macrófagos.

• A dexametasona, reduziu significativamente migração leucocitária induzida por CvL.

• CvL induz a migração de neutrófilos por via indireta, ou seja, através da estimulação de macrófagos a liberarem fatores quimiotácticos como citocinas, componentes do sistema complemento e leucotrienos.