4.6.1. Preparação extensor digitorum longus de camundongo (EDL)
Os camundongos foram eutanasiados em atmosfera saturada de isoflurano e seguido da exsanguinação. Para a dissecção do músculo extensor digitorum longus (EDL), foi feita uma incisão na face ântero-lateral de uma das patas posteriores, expondo os tendões do EDL e o músculo tibial. Seccionou- se o tendão do músculo tibial e este foi retirado, permitindo a visualização do músculo EDL. Amarrou-se o segmento da parte superior do músculo EDL e a extremidade inferior (tendões ligados aos dedos), isolando-o do animal.
As preparações foram fixadas em cuba contendo 5 mL da solução nutritiva de Tyrode, com a seguinte composição em mM: NaCl 137; KCl 2,7; CaCl2 1,8; MgCl2 0,49; NaH2PO4 0,42; NaHCO3 11,9 e C6H12O6 11,1. A solução foi aerada constantemente com carbogênio (mistura de 95 % O2 e 5 % CO2) e mantida a 37 °C. A extremidade inferior do músculo foi unida a um gancho fixado no fundo da cuba e o segmento superior passou por duas argolas do eletrodo, fixando-se em um transdutor de força isomérica (Load Cell BG-25 g), sendo submetido a uma tensão constante de 1 g. A preparação foi exposta à estimulação elétrica de campo por um estimulador Grass S88 (Grass Instrument Co., Quincy, MA, USA), com pulsos supramaximais de 0,2 ms de duração e 0,1 Hz de frequência. As contrações musculares foram registradas por um fisiógrafo Gould RS 3400 (Gould Inc., Cleveland, OH, USA).
As preparações EDL foram submetidas a um período de estabilização minima de 20 minutos e posterior incubação por 120 minutos com veneno de B. fonsecai (100 μg/ml), fração PLA2 isolada (10, 30 e 100 μg/ml) ou
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solucao nutritiva de Tyrode (controle). Após a incubação, a resposta contrátil a cada 10 minutos foi comparada com o valor basal.
O ensaio também foi executado em condições de inibição da atividade PLA2: diminuição da temperatura de incubação para 24 °C e substituição do CaCl2 por SrCl2 (4 mM) da solução Tyrode.
4.6.2. Preparação nervo frênico-diafrágma de camundongo (NFD)
Os camundongos foram eutanasiados em atmosfera saturada de isoflurano e posterior exsanguinação. Após a dissecação, para a retirada dos hemidiafragmas e isolamento dos nervos frênicos correspondentes 154, as preparações foram fixadas em cuba contendo 5 mL da solução nutritiva de Tyrode, com a seguinte composição em mM: NaCl 137; KCl 2,7; CaCl2 1,8; MgCl2 0,49; NaH2PO4 0,42; NaHCO3 11,9 e C6H12O6 11,1. A solução foi aerada constantemente com carbogênio (mistura de 95 % O2 e 5 % CO2) e mantida a 37 °C. O músculo diafragma foi mantido por sua porção tendinosa sob tensão constante de 5 g. A preparação foi exposta à estimulação elétrica indireta por um estimulador Grass S88 (Grass Instrument Co., Quincy, MA, USA), com pulsos supramaximais de 0,2 ms de duração e 0,1 Hz de frequência. As contrações musculares foram registradas por um fisiógrafo Gould RS 3400 (Gould Inc., Cleveland, OH, USA) 154.
As preparações NFD foram submetidas a um período de estabilização mínima de 20 minutos e posterior incubação por 120 minutos com fração PLA2 isolada (10, 30 e 100 μg/ml) ou solução nutritiva de Tyrode (controle). Após a incubação, a resposta contrátil a cada 10 minutos foi comparada com o valor basal.
O ensaio também foi executado em condições de inibição da atividade PLA2: diminuição da temperatura de incubação para 24 °C e substituição do CaCl2 por SrCl2 (4 mM) da solução Tyrode. Em outro ensaio, a preparação NFD foi estimulada diretamente (0,1 Hz de frequência, 0,2 ms de duração), com prévia adição de d-tubocurarina (11,7 mM), levando ao bloqueio nicotínico e prevenindo a estimulação indireta.
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4.6.3. Preparação biventer cervicis de pintaínho (BCp)
Os pintaínhos foram eutanasiados em atmosfera saturada de isoflurano e posterior exsanguinação. Após a dissecação, para o isolamento do músculo biventer cervicis (BCp) 155, as preparações foram fixadas em cuba contendo 5 mL da solução nutritiva de Krebs, com a seguinte composição em mM: NaCl 118,7; KCl 4,7; CaCl2 1,8; MgSO4 1,17; KH2PO4 1,17; NaHCO3 25 e C6H12O6 11,65. A solução foi aerada constantemente com carbogênio (mistura de 95 % O2 e 5 % CO2) e mantida a 37 °C. A extremidade inferior do músculo foi unida a um gancho fixado no fundo da cuba e o segmento superior passou por duas argolas do eletrodo, fixando-se em um transdutor de força isomérica (Load Cell BG-25 g), sendo submetido a uma tensão constante de 1 g. A preparação foi exposta à estimulação elétrica de campo por um estimulador Grass S88 (Grass Instrument Co., Quincy, MA, USA), com pulsos supramaximais de 0,2 ms de duração e 0,1 Hz de frequência. As contrações musculares foram registradas por um fisiógrafo Gould RS 3400 (Gould Inc., Cleveland, OH, USA) 155.
As preparações BCp foram submetidas a um período de estabilização mínima de 20 minutos e posterior incubação por 120 minutos com fração PLA2 isolada (10, 30 e 100 μg/ml) ou controle Tyrode. Antes e após a incubação, foi avaliada a resposta contraturante à adição de acetilcolina (ACh; 55 μM) e cloreto de potássio (KCl; 40 mM) exógenos, sem estimulação elétrica. Após a incubação, a resposta contrátil a cada 10 minutos foi comparada com o valor basal. As respostas contraturantes após a incubação foram comparadas com a resposta contraturante basal 155.
4.6.4. Análise histológica
Após o ensaio miográfico (ver 3.6.1, 3.6.2. e 3.6.3.), as preparações foram fixadas overnight em formaldeído 10 % e, então, armazenadas em etanol 70 %. Em seguida, foram processadas da seguinte forma: desidratação por gradiente crescente de etanol (80 %, 90 % e 100%), diafanização com xilol (1 : 1 de etanol : xilol, 1 : 1 de xilol : parafina a 40 °C) e por fim infiltradas em parafina (40 °C). Os músculos processados foram emblocados em parafina e cortado utilizando um micrótomo Leica RM2245. Foram feitos 3 séries de 3
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cortes seriados (espessura de 5 mm) por grupo, sendo cada série separada por 100 mm. Os cortes foram montados em lâminas silanizadas de vidro e coradas por eosina-hematoxilina (HE). As lâminas foram analisadas em um microscópio óptico Leica DM 5000 B e as imagens foram capturadas utilizando um software Leica QWin Plus V3 (Leica, Germany).
A análise quantitativa foi feita através da contagem de células de três campos por corte (campos de 100 células), identificando, qualificando e quantificando os estados patológicos. Foram consideradas células lesadas as que apresentavam alterações, como: vacúolos, “delta lesions”, edema, mionecrose ou “ghost cells”. Células normais foram as que apresentavam células íntegras, perfil poligonal celular, núcleo periférico e nenhum comprometimento no mecanismo contrátil.