UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
RAPHAEL SCHEZARO RAMOS
ENVOLVIMENTO DE FOSFOLIPASES A2 NAS ATIVIDADES
NEUROMUSCULARES E MIOTÓXICAS in vitro DO VENENO DE Bothrops fonsecai
CAMPINAS 2016
RAPHAEL SCHEZARO RAMOS
ENVOLVIMENTO DE FOSFOLIPASES A2 NAS ATIVIDADES
NEUROMUSCULARES E MIOTÓXICAS in vitro DO VENENO DE Bothrops fonsecai
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
ORIENTADORA: LÉA RODRIGUES SIMIONI
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO
ALUNO RAPHAEL SCHEZARO RAMOS, ORIENTADO PELA PROFA. DRA. LÉA RODRIGUES SIMIONI.
CAMPINAS 2016
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
RAPHAEL SCHEZARO RAMOS
ORIENTADORA: PROFA. DRA. LÉA RODRIGUES SIMIONI
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. LÉA RODRIGUES SIMIONI
2. PROFA. DRA. MARIA ALICE CRUZ-HÖFLING
3. PROFA. DRA. STELLA REGINA ZAMUNER
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Maria Aparecida e Paulino. Se não fosse o suporte e amor durante esses anos, não estaria aqui.
A minhas irmãs Patrícia, Paula e Juliana por sempre me motivarem a fazer o meu melhor.
Aos meus amigos Cecília, Everton, Lenna, Marina, Murilo, Priscila, Renan, Tatiênia e Valesca. Obrigado por todas as vezes que me consolaram, aconselharam e me fizeram rir. A amizade de vocês é um dos tesouros mais preciosos que poderia conquistar na vida.
À minha amiga Beatriz, por acompanhar de perto e entender como ninguém os momentos estressantes. Contar com você sempre ao meu lado me deu força para tentar fazer o melhor. Ao meu amigo Fernando, por todas as vezes que acreditou em mim quando eu mesmo não conseguia. Você me ajudou a crescer e ter orgulho de quem sou. Nunca conseguirei expressar quão importante você é.
À Laila por todos os momentos que sua companhia foi mais importante que palavras.
Por fim, dedico este trabalho a todos os obstáculos que surgiram na minha vida. Se não fosse pela sede de superá-los, não teria me tornado quem eu sou hoje.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Léa Rodrigues Simioni, por ter me aberto as portas de seu laboratório. Além de toda a orientação durante este trabalho, você me ensinou a não ser apenas um aluno, mas sim um pesquisador. Me motivou a ter pensamento independente, iniciativa e buscar a resposta para minhas próprias perguntas. Sua postura sempre será exemplo. Espero retornar à pesquisa o quanto a senhora investiu em minha formação
À Profa. Dra. Priscila Randazzo de Moura, minha eterna mãe científica. Você despertou a paixão pela pesquisa em mim e me guiou para chegar onde estou. Não consigo colocar valor em tudo que você me ensinou nesses anos trabalhando juntos. Desde a iniciação científica você tem me estimulado e confiado em meu potencial. Sempre me espelharei na sua incansável dedicação. Obrigado pela atenção e paciência com correções com prazos apertados.
Ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, por fornecer as condições para a realização deste trabalho.
Ao CNPq, pelo apoio financeiro que possibilitou minha dedicação exclusiva para desenvolver este trabalho.
Aos colaboradores Frank e Mariana, pela indispensável contribuição.
Ao Prof. Dr. José Carlos Cogo, por fornecer o veneno à dissertação.
Ao Prof. Dr. Stephen Hyslop por abrir seu laboratório para realização de alguns protocolos deste trabalho e pela valiosa contribuição na interpretação dos resultados.
Aos colegas Beatriz, Bruna, Delkia, Lourdes, Norma, Rafael e Rita por serem tão solícitos quando precisei de ajuda em diferentes etapas destetrabalho e pelos momentos de descontração.
Aos técnicos Gildo Leite, Patrícia Costa Panunto e José Ilton dos Santos pela amizade e grandiosa ajuda em diferentes experimentos.
Aos secretários Cidinha, Maísa e Gustavo por toda o auxílio e disposição sempre que precisei.
Aos funcionários do biotério do Departamento de Farmacologia, Miguel, Antonio, Aguinaldo e Ivani, pelo cuidado e dedicação dispensado aos animais.
Aos alunos da iniciação científica que tive o prazer de colaborar, Camila, Felipe, Kristian e Lígia, pela confiança e permitirem que eu desse os primeiros passos para a docência.
Aos colegas de programa de pós-graduação, pela amizade e pelos momentos de descontração.
Aos animais que deram suas vidas em benefício da pesquisa científica. Meus mais sincero respeito e agradecimento.
“I want people to realize that it’s OK to make mistakes. It’s OK to fall down. Get up, look sick’ning and make them eat it!”
RESUMO
Neste trabalho, investigou-se a participação da atividade PLA2 nas ações do veneno de B. fonsecai sobre preparações neuromusculares in vitro: extensor digitorum longus de camundongo (EDL), nervo frênico-diafragma de camundongo (NFD) e biventer cervicis de pintainho (BCp). A atividade PLA2 do veneno total foi inibida usando-se diferentes métodos como: diminuição da temperatura, substituição de cálcio por estrôncio da solução nutritiva e modificação química das PLA2 com bromofenacil brometo (p-BPB). A partir do veneno total, uma fração PLA2 foi isolada e suas atividades neuromusculares e miotóxica caracterizadas.
Observou-se que o veneno de B. fonsecai (100 μ/ml) é provido de ações miotóxica (24,5 ± 1,86 % de lesão celular) e bloqueadora da junção neuromuscular de preparações EDL (bloqueio total em 100 minutos de incubação). A medida da atividade fosfolipásica mostrou diferentes graus de inibição (5,26 ± 0,08 nmol HCl, 1,27 ± 0,36 nmol HCl e inibição total para diminuição da temperatura, substituição de cálcio por estrôncio e modificação química, respectivamente) quando comparada à atividade do veneno total em condições normais (8,50 ± 0,51 nmol HCl). O veneno apresentou ainda atividades proteolítica (109,71 ± 5,87 UP/μg) e amidolítica (4238,00 ± 137,48 nmol/min), que foram reduzidas pela diminuição da temperatura (46,69 ± 1,51 UP/μg e 3112,26 ± 31,04 nmol/min), mas não sofreram inibição após a substituição de cálcio por estrôncio (214,61 ± 1,44 UP/μg e 3927,73 ± 31,04 nmol/min). A modificação química inibiu significativamente as atividades proteolítica (6,90 ± 7,01 UP/μg) e amidolítica (381,33 ± 49,78 nmol/min). Observou-se uma correlação positiva entre a inibição da atividade PLA2 e o grau de lesão celular (20,59 ± 1,61, 9,86 ± 0,76 e 3,75 ± 0,54 % de células lesadas após a diminuição da temperatura, a substituição de cálcio por estrôncio e modificação química, respectivamente), porém houve menor redução no bloqueio neuromuscular (46,43 ± 6,98, 68,33 ± 7,40 e 11,32 ± 5,67 % em 100 minutos de incubação após a diminuição da temperatura, substituição de cálcio por estrôncio e a modificação química, respectivamente). A fração PLA2 isolada apresentou características típicas das PLA2 Asp49, ou seja, cataliticamente ativas. Em preparações EDL (30 μg/ml) causou bloqueio neuromuscular (33,4± 4,1 % após 120 minutos de incubação) e miotoxicidade (27,6 ± 1,6 % de células lesadas). O bloqueio neuromuscular foi
menor em preparações BCp (8,2 ± 1,7 %), mas maior em NFD (55,8 ± 5,6 %), sem apresentar variação significativa na resposta miotóxica (20,16 ± 2,69 e 20,33 ± 2,37 % em NFD e BCp, respectivamente). Em preparações NFD sob estimulação direta, o bloqueio neuromuscular foi praticamente ausente (14,8 ± 3,5). A diminuição da temperatura e a substituição de cálcio por estrôncio reduziram a miotoxicidade (11,00 ± 0,90 e 1,33 ± 0,88 %, respectivamente) e aboliu o bloqueio neuromuscular nesta preparação.
Concluiu-se que a miotoxicidade não está diretamente relacionada ao bloqueio neuromuscular do veneno de B. fonsecai. A atividade PLA2 parece desempenhar importante papel na lesão tecidual, mas pouco comprometimento na transmissão neuromuscular. Outras classes de proteínas ou PLA2 Lys49 parecem responsáveis pelo bloqueio neuromuscular produzido pelo veneno.
ABSTRACT
In this work, we investigated the involvement of PLA2 activity to in vitro neuromuscular actions of B. fonsecai venom on mouse extensor digitorum longus (EDL), mouse phrenic nerve-diaphragm (PND) and chick biventer cervicis (BC). The venom PLA2 activity was inhibited using different methods, such as reduction of temperature, substitution of calcium by strontium in the nutritive solution and chemical modification of PLA2 with bromophenacyl bromide (p-BPB). A PLA2 fraction was isolated and its neuromuscular and myotoxic activities were characterized.
It was observed that the venom of B. fonsecai (100 μg/ml) is provided of myotoxic (24.5 ± 1.86% of cell damage) and neuromuscular blocking actions in EDL (total block after 100 minutes of incubation). The measurement of phospholipase activity showed varying degrees of inhibition (5.26 ± 0.08 nmol HCl, 1.27 ± 0.36 nmol HCl and complete inhibition in lower temperature, calcium substitution and chemical modification, respectively) when compared to the venom under normal conditions (8.50 ± 0.51 nmol HCl). The venom still showed proteolytic activity (109.71 ± 5.87 PU/ug) and amidolytic (4238.00 ± 137.48 nmol/min), which were reduced by the decrease of temperature (46.69 ± 1.51 PU/ug and 3112.26 ± 31.04 nmol/min), but suffered no inhibition after calcium replacement by strontium (214.61 ± 1.44 PU/ug and 3927.73 ± 31.04 nmol/min). The chemical modification significantly inhibited the proteolytic (6.90 ± 7.01 PU/ug) and amidolytic activity (381.33 ± 49.78 nmol/min). There was a positive correlation between inhibition of PLA2 activity and the degree of cell damage (20.59 ± 1.61, 9.86 ± 0.76 and 3.75 ± 0.54% of injured cells after lowering the temperature, replacement of calcium and strontium chemical modification, respectively), but there was less reduction in neuromuscular blockade (46.43 ± 6.98, 68.33 ± 7.40 and 11.32 ± 5.67% in 100 minutes of incubation after lowering the temperature, calcium substitution and chemical modification, respectively). The isolated PLA2 fraction had typical characteristics of PLA2 Asp49 (catalytically active). In EDL preparations (30 μg/ml) caused neuromuscular blockade (33.4 ± 4.1% after 120 minutes of incubation) and myotoxicity (27.6 ± 1.6% of injured cells). Neuromuscular blockade was lower in BC preparations (8.2 ± 1.7%), but higher in NFD (55.8 ± 5.6%). No significant change in myotoxicity was observed between the two preparations (20.16 ± 2.69 and 20.33 ± 2.37% in PND and BC,
respectively). In PND under direct stimulation the neuromuscular blockade was virtually absent (14.8 ± 3.5%). Both decrease of the temperature and calcium substitution reduced the myotoxicity (11.00 ± 0.90 and 1.33 ± 0.88%, respectively), with abolition of neuromuscular blockade.
It was concluded that the myotoxicity is not directly related to the neuromuscular blockade produced by B. fonsecai venom. The PLA2 activity seems to play an important role in tissue damage, but little impairment in neuromuscular transmission. Other classes of proteins or even Lys49 PLA2 seems to be responsible for the neuromuscular blockade.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Tipos de dentição encontrados em serpentes colubróides ... 23
Figura 2. Porcentagem dos acidentes ofídicos no Brasil, por região, no ano de 2012 . ... 27
Figura 3. Bothrops fonsecai ... 30
Figura 4. Distribuição geográfica das serpentes B. fonsecai e B. cotiara ... 31
Figura 5. Composição proteica dos venenos de B. cotiara e B. fonsecai ... 32
Figura 6. Sítio de hidrólise das diferentes classes de fosfolipases ... 34
Figura 7. Mecanismo catalítico das PLA2 ... 37
Figura 8. Sequência hipotética dos eventos da degeneração celular do músculo esquelético causada pela ação de PLA2 miotóxicas derivadas de venenos ... 40
Figura 9. Atividade neuromuscular do veneno de B. fonsecai sobre preparação EDL.. ... 54
Figura 10. Atividade miotóxica do veneno de B. fonsecai sobre preparação EDL ... 55
Figura 11. Atividades enzimáticas do veneno de B. fonsecai sob diferentes protocolos de inibição da atividade PLA2 ... 57
Figura 12. Resposta contrátil da preparação EDL incubada com o veneno de B. fonsecai a 24 °C ... 58
Figura 13. Resposta contrátil da preparação EDL incubada com o veneno de B. fonsecai na presença de estrôncio ... 59
Figura 14. Resposta contrátil da preparação EDL incubada com o veneno de B. fonsecai após alquilação por p-BPB ... 60
Figura 15. Registro miográfico da incubação de preparação EDL com veneno de B. fonsecai sob diferentes condições de inibição da atividade PLA2 ... 61
Figura 16. Atividade miotóxica do veneno de B. fonsecai sobre preparação EDL submetido a diferentes protocolos de inibição da atividade PLA2... 62
Figura 17. Cromatografia CLAE-FR do veneno liofilizado e clarificado de B. fonsecai ... 64
Figura 18. Primeira etapa cromatográfica de isolamento de uma nova fração PLA2 ... . ... 65
Figura 19. Segunda etapa cromatográfica de isolamento de uma nova fração PLA2 ... 66
Figura 20. Determinação da pureza da fração PLA2 por CLAE-FR e eletroforese SDS-PAGE ... 67 Figura 21. Determinação da massa da fração PLA2 por espectrometria de massa MALDI-ToF ... 68 Figura 22. Atividade PLA2 da fração isolada do veneno de B. fonsecai ... 69 Figura 23. Resposta contrátil da preparação EDL incubada com a fração PLA2 ... 70 Figura 24. Registro miográfico da incubação de preparação EDL com a fração PLA2 ... 71 Figura 25. Atividade miotóxica da fração PLA2 sobre preparação EDL ... 72 Figura 26. Resposta contrátil de preparações EDL, NFD e BCp incubada com a fração PLA2 ... 73 Figura 27. Resposta contraturante de preparações BCp ao KCl e ACh após incubação com a fração PLA2 ... 74 Figura 28. Atividade miotóxica em preparações EDL, NFD e BCp pela fração PLA2 ... 75 Figura 29. Resposta contrátil da preparação NFD incubada com a fração PLA2 ... 76 Figura 30. Registro miográfico da incubação de preparação NFD com a fração PLA2 ... 77 Figura 31. Atividade miotóxica da fração PLA2 sobre preparação NFD ... 78 Figura 32. Resposta contrátil da preparação NFD estimulada diretamente sob incubação com a fração PLA2 ... 79 Figura 33. Resposta contrátil da preparação NFD com a fração PLA2 a 24 °C ... 80 Figura 34. Atividade miotóxica da fração PLA2 sobre preparação NFD a 24 °C ... 81 Figura 35. Resposta contrátil da preparação NFD com a fração PLA2 sob substituição de cálcio por estrôncio ... 82 Figura 36. Atividade miotóxica da fração PLA2 sobre preparação NFD sob substituição de cálcio por estrôncio ... 83
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Análise quantitativa do dano celular em músculo EDL incubado com veneno de B. Fonsecai submetido a diferentes protocolos de inibição da atividade PLA2 ... 63
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
SIGLA/ABREVIATURA DEFINIÇÃO
Abs Absorbância
Ach Acetilcolina (Acetylcholine)
ANOVA Análise de variância (Analysis of variance)
Asp49 Resíduo de ácido aspártico na posição 49 da molécula BApNA N-benzoil-L-arginina p-nitroanilida
BCp Biventer cervicis de pintainho
p-BPB p-Bromofenacil brometo
CK Creatinoquinase (Creatine kinase) CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CRISP Proteína secretora rica em cisteína (cysteine-rich secretory protein)
DP Desvio padrão
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (ethylenediamine tetraacetic acid)
ELISA Ensaio Imunosorbente Ligado a Enzima (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
EPM Erro padrão da média
FR Fase reversa
G6D49 Resíduos de glicina e ácido aspártico nas posições 6 e 49 Gly30 Resíduo de glicina na posição 30 da molécula
Gly32 Resíduo de glicina na posição 32 da molécula
HE Hematoxilina-eosina
HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanesulfônico His48 Resíduo de histidina na posição 48 da molécula
KCl Cloreto de potássio
LAAO L-aminoácido oxidase
Lys49 Resíduo de lisina na posição 49 da molécula
MALDI-ToF Ionização e dessorção a laser assistida por matriz - Tempo de vôo (Matrix-assisted laser desorption/ionization - Time of
Flying)
SIGLA/ABREVIATURA DEFINIÇÃO
NFD Preparação nervo frênico-diafrágma de camundongo PLA2 Fosfolipase A2 (Phospholipase A2)
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida em dodecil e sulfato de sódio (Polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate)
Ser49 Resíduo de serina na posição 49 da molécula
SVMP Metaloprotease proveniente de venenos ofídicos (Snake venom metalloproteinase)
TEMED N-N-N-N-tetrametilediamina (Tetramethylethylenediamine) TFA Ácido trifluoro acético (Trifluoroacetic acid)
Triton X-100 Eter polietileno glicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil Tyr28 Resíduo de tirosina na posição 28 da molécula
UP Unidade proteolítica
VEGF Fator de crescimento do endotélio vascular (Vascular endothelial growth factor)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 19 2. OBJETIVOS ... 21 2.1. Geral... 21 2.2. Específicos ... 21 3. REVISÃO DA LITERATURA ... 22 3.1. Serpentes venenosas ... 22 3.2. Venenos ofídicos ... 24 3.3. Acidentes ofídicos ... 25 3.4. Gênero Bothrops ... 27 3.5. Bothrops fonsecai ... 29 3.6. Fosfolipases A2 ... 34 3.7. Miotoxicidade ... 38 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 42 4.1. Reagentes ... 42 4.2. Animais ... 424.3. Veneno bruto de B. fonsecai ... 42
4.4. Ensaios bioquímicos ... 43
4.4.1. Atividade PLA2 ... 43
4.4.2. Atividade proteolítica ... 44
4.4.3. Atividade amidolítica ... 44
4.4.4. Dosagem proteica ... 45
4.5. Modificação química de PLA2 ... 45
4.6. Ensaios biológicos ... 46
4.6.1. Preparação extensor digitorum longus de camundongo (EDL) ... 46
4.6.2. Preparação nervo frênico-diafrágma de camundongo (NFD) ... 47
4.6.3. Preparação biventer cervicis de pintaínho (BCp) ... 48
4.6.4. Análise histológica ... 48
4.7. Etapas cromatográficas ... 49
4.7.1. Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) ... 49
4.7.2. Cromatografia líquida por exclusão molecular ... 50
4.7.3. Cromatografia líquida por troca-iônica ... 50
4.7.4. Determinação de pureza ... 51
4.8. Determinação de massa... 51
4.8.1. Eletroforese SDS-PAGE ... 51
4.9. Análise estatística ... 52
5. RESULTADOS ... 53
5.1. Caracterização do veneno total de B. fonsecai ... 53
5.1.1. Atividade neuromuscular em preparação EDL ... 53
5.1.2. Atividade miotóxica em preparação EDL ... 54
5.2. Inibição da atividade PLA2 do veneno de B. fonsecai ... 55
5.2.1. Atividades enzimáticas ... 55
5.2.2. Atividade neuromuscular em preparação EDL ... 57
5.2.3. Atividade miotóxica em preparação EDL ... 61
5.3. Perfil cromatográfico do veneno total ... 63
5.4. Purificação de uma nova fração PLA2 ... 64
5.4.1. Primeira etapa: cromatografia líquida por exclusão molecular ... 64
5.4.2. Segunda etapa: cromatografia líquida por troca iônica ... 65
5.4.3. Determinação da pureza ... 67
5.4.4. Determinação da massa ... 67
5.4.5. Determinação da atividade PLA2 ... 68
5.5. Caracterização farmacológica nova fração PLA2 ... 69
5.5.1. Atividade neuromuscular em preparações EDL ... 69
5.5.2. Atividade miotóxica em preparações EDL ... 71
5.5.3. Comparação da atividade entre preparações EDL, NFD e BCp ... 73
5.5.4. Atividade neuromuscular em preparações NFD ... 75
5.5.5. Atividade miotóxica em preparações NFD ... 77
5.5.6. Comparação das atividades pré- e pós-sinápticas em preparação NFD . 78 5.5.7. Inibição enzimática por diminuição da temperatura de incubação ... 79
5.5.8. Inibição da atividade PLA2 por substituição de Ca2+ ... 81
6. DISCUSSÃO ... 84
7. CONCLUSÃO ... 91
8. REFERÊNCIAS ... 92
19
1. INTRODUÇÃO
_______________________________
A OMS (Organização Mundial da Saúde) classifica os acidentes ofídicos como um dos principais problemas de saúde-pública, especialmente negligenciados nas áreas rurais dos países tropicais e subtropicais 1, 2. Avalia-se que todo ano ocorram 2,5 milhões de acidentes ofídicos, causando 125 mil mortes e 100 mil sobreviventes com sequelas severas, a maioria acontecendo no sul e sudoeste asiático, África sub-Arábica, América Central e América do Sul 3, 4, 5. As deficiências do sistema de saúde e falta de disponibilidade de soros antiofídicos contribuem para a alta mortalidade e sequelas físicas e psicológicas nas vítimas 6, 7.
No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops (família Viperidae) são responsáveis por 90% destes envenenamentos, levando a quadros clínicos caracterizados por dano tecidual local (edema, bolha, hemorragia e mionecrose) e efeitos sistêmicos de risco iminente à vida, como neurotoxicidade, hemorragias espontâneas e insuficiência renal aguda. Os efeitos locais são causados principalmente por duas enzimas presentes no veneno: fosfolipases A2 (PLA2) e metaloproteases zinco-dependentes 7, 8, 9, 10.
A serpente Bothrops fonsecai (B. fonsecai) é endêmica no sudoeste brasileiro, especialmente nordeste de São Paulo, sul do Rio de Janeiro e extremo sul de Minas Gerais. Em razão do desflorestamento de seu habitat (pinhais de Araucaria augustifolia em planaltos) e mudanças microclimáticas, passou a ser catalogada como “quase ameaçada de extinção”. Há poucos relatos clínicos de acidentes envolvendo esta espécie, uma vez que este habitat muito específico encontra-se ecologicamente afastada da população 11, 12, 13, 14.
Estudos demonstraram que o veneno de B. fonsecai possui PLA2 (~30% das proteínas do veneno), serinoproteases (~4,1%), lectina tipoC (~9%) e metaloproteases (~42%) 15. As PLA2, segunda família de proteínas mais abundante no veneno, caracterizam pelos efeitos hemolítico, cardiotóxico, miotóxico, anticoagulante, convulsivante, hipotensor, edematogênico e necrótico local 16, 17.
20
Há grande similaridade entre a sequência de aminoácidos de uma fração isolada do veneno de B. fonsecai e diversas outras PLA2 G6D49 botrópicas, como as presentes nos veneno de B. jararaca e B. insularis. Sabendo-se que as PLA2 G6D49 possuem potente ação miotóxica, é possível que este efeito se reproduza na fração isolada do veneno de B. fonsecai 9, 15, 18. Além disso, já foi verificado que a atividade fosfolipásica do veneno de B. fonsecai não é neutralizada pelo antiveneno botrópico comercial, no entanto há perda de suas ações bloqueadoras na junção neuromuscular 19, 20. Por outro lado, é frequente a associação do bloqueio neuromuscular causado por venenos botrópicos com a ação miotóxica de suas PLA2 9. Desta forma, a importância das PLA2 para a atividades bloqueadora da junção neuromuscular e miotóxica do veneno de B. fonsecai ainda não são claras.
Além de importância taxonômica, biológica e ecológica do estudo dos venenos ofídicos, este ainda pode ser usado como ferramenta para o avanço da ciência em diversas outras áreas. Atualmente, a principal ferramenta para combater os efeitos dos venenos ofídicos é a imunoterapia. No entanto, esta nem sempre apresenta resultados satisfatórios, falhando em combater alguns dos efeitos biológicos causados pelos venenos. Desta forma, fica evidente que tais estudos possuem impacto não só sobre o tratamento do envenenamento humano, mas também sobre a fisiopatologia e diagnóstico clínico 21, 22, 23.
Até o momento, não se têm estudos bioquímico e farmacológico de uma miotoxina isolada do veneno ofídico de B. fonsecai, o que justifica a originalidade deste projeto.
21
2. OBJETIVOS
_______________________________
2.1. Geral
Avaliar a participação de PLA2 nos efeitos do veneno total de B. fonsecai em preparações neuromuscular in vitro.
2.2. Específicos
Caracterizar as atividades bloqueadora da junção neuromuscular e miotóxica do veneno bruto.
Caracterizar as atividades miotóxica e bloqueadora da junção neuromuscular do veneno de B. fonsecai;
Determinar a importância da atividade fosfolipásica para o bloqueio neuromuscular e miotoxicidade in vitro através de protocolos de inibição do veneno total de B. fonsecai;
Isolar uma fração fosfolipásica do veneno total de B. fonsecai;
Caracterizar as atividades biológicas in vitro da fração isolada (bloqueadora da junção neuromuscular e miotóxica).
22
3. REVISÃO DA LITERATURA
_______________________________
3.1. Serpentes venenosas
A subordem Serpentes encontra-se entre os répteis escamados (classe Reptilia, ordem Squamata), abrangendo mais de 3000 espécies 24. As serpentes, por sua vez, podem ser divididas em duas infraordens: Scolecophidia e Alethinophidia 25. Scolecophidia é composta por serpentes pequenas, com cavidade oral de tamanho limitado e, desta forma, dieta restrita a presas pequenas, como formigas e cupins 26. Por outro lado, as serpentes da infraordem Alethinophidia são caracterizadas por mandíbula independente, permitindo a ingestão de presas maiores 27.
Na infraordem Alethinophidia podemos encontrar as Caenophidia, também chamadas de serpentes avançadas, em razão de seu alto grau de derivação, abrangendo a maior parte das espécies de serpentes do Novo Mundo 25. Inseridas em Caenophidia, temos a superfamília Colubroidea (serpentes colubróides), onde todas as espécies venenosas podem ser encontradas, dividindo-se em quatro famílias: Atractaspididae, Elapidae, Viperidae e Colubridae 24, 28.
Os desenvolvimentos de células secretoras de veneno e dentições diferenciadas para sua inoculação marcaram um avanço crítico na evolução ofídica, diferenciando as colubróides das demais serpentes. O veneno possibilitou que as colubróides não mais dependessem apenas de mecanismos mecânicos (constrição) para matar suas presas, desvinculando o sistema locomotor do processo de alimentação. Além disso, esta evolução permitiu também que algumas serpentes atingissem presas maiores. Desta forma, foi possível o surgimento de novas dietas, nichos ecológicos e modelos de locomoção 29.
Quatro tipos diferentes de dentição são vistos nas serpentes colubróides: áglifa, opistóglifa, proteróglifa e solenóglifa (Figura 1). A dentição áglifa é característica das serpentes não venenosas, com dentes pequenos e ausência de aparelho inoculador de veneno. Já as serpentes opistóglifas possuem dentes inoculadores posicionados na região posterior do maxilar,
23
apresentando risco reduzido ao homem, uma vez que há dificuldade mecânica de inocularem o veneno em regiões de maior circunferência do corpo humano, como tronco e membros. Por fim, as dentições com presas inoculadoras na região anterior do maxilar podem ser divididas em: proteróglifa, quando são ocos, pequenos e fixos no maxilar; e solenóglifa, quando são ocos, longos e retráteis 28, 30.
Figura 1. Tipos de dentição encontrados em serpentes colubróides: a) Áglifa (característica das serpentes não venenosas, com dentes pequenos e ausência de aparelho inoculador de veneno); b) Opistóglifas (aparelho inoculador posicionado na região posterior do maxilar); c) Proteróglifa (dentes inoculadores ocos, pequenos e fixos no maxilar); d) Solenóglifa (dentes inoculadores ocos, longos e retráteis) 31.
Glândulas especializadas são responsáveis pela produção dos venenos ofídicos. Serpentes de dentições proteróglifa e solenóglifa apresentam glândulas de veneno homólogas entre suas espécies, apesar da alta diversidade estrutural 32. Já algumas serpentes integrantes das famílias Colubridae e Atractaspididae possuem as chamadas glândulas de Duvenoy, glândulas salivares supralabiais de secreção serosa, homólogas às glândulas de veneno 33, 34. As glândulas de veneno e glândulas de Duvenoy apresentam
24
componentes comuns em suas secreções, tais como fosfolipases e proteases, o que sugere que as enzimas digestivas (provavelmente pancreática) sejam sua origem evolutiva 35, 36.
3.2. Venenos ofídicos
Os venenos ofídicos são compostos por partes proteica e não proteica. A parte proteica é a mais importante em termos biológicos, constituindo aproximadamente 90% do veneno seco 37. Já a porção não proteica abrange íons e substâncias orgânicas simples. Os íons possuem papel importante como cofatores para a atividade de algumas enzimas do veneno, como é o caso do cálcio para as fosfolipases A2 (PLA2) ou o magnésio e o zinco para metaloproteases (SVMP) 38, 39. Entre os compostos orgânicos simples podemos encontrar aminoácidos livres, nucleotídeos, carboidratos, lipídios e aminas biogênicas (bradicinina, histamina, seronotina, 4-hidroxitriptamina, N-metil-5-hidroxitriptamina e N’-N’-dimetil-5-hidroxitriptamina). As aminas biogênicas podem atuar como mediadores da dor causada pelos demais componentes do veneno 40.
De forma geral, as proteínas presentes nos venenos ofídicos podem ser divididas em providas ou não de atividade enzimáticas. Dentre as enzimas, encontramos serinoproteases, L-aminoácido oxidases (LAAO), SVMP e PLA2. Já as proteínas não enzimáticas são constituídas principalmente por desintegrinas, lectinas tipo-C, peptídeos natriuréticos, miotoxinas, neurotoxinas, proteínas secretoras ricas em cisteína (CRISP), fatores de crescimento nervoso, fatores de crescimento do endotélio vascular (VEGF), cistatinas e inibidores de proteases 41.
A extensa gama de proteínas encontrada nos venenos ofídicos varia em composição e concentração de acordo com as espécies, subespécies ou até mesmo entre as serpentes de uma mesma população 35. Além do mais, como os constituintes do veneno participam da imobilização e digestão da presa, estão diretamente suscetíveis a variações de acordo com a dieta, assim como com o tamanho e idade da serpente 42. Uma vez que as serpentes precisam se adaptar à dieta do local, a distribuição geográfica acarreta em grande variabilidade na composição dos venenos. Consequentemente, há
25
diferenças na sintomatologia dos envenenamentos e, assim, na melhor terapêutica a ser utilizada 43.
Além das importâncias taxonômica, biológica e ecológica do estudo dos venenos ofídicos, este ainda pode ser usado como ferramenta para o avanço da ciência em diversas outras áreas. Atualmente, a principal ferramenta para combater os efeitos dos venenos ofídicos é a imunoterapia. No entanto, esta nem sempre apresenta resultados satisfatórios, falhando em combater alguns dos efeitos biológicos causados pelos venenos. Desta forma, fica evidente que tais estudos possuem impacto não só sobre o tratamento do envenenamento humano, mas também sobre a fisiopatologia e diagnóstico clínico 21, 22, 23.
Afora o conhecimento das ações dos venenos sobre os referenciais biológicos, eles também são usados para o estudo de sistemas fisiológicos complexos, como o sistema nervoso central, sistema nervoso periférico, sistema cardiovascular, coagulação sanguínea e sistema imune 21. Um dos mais significativos méritos do estudo dos peptídeos e proteínas que compõem um veneno corresponde ao potencial de descoberta de novos fármacos. Uma vez que estas toxinas são substâncias extremamente ativas, possuem alta especificidade e, desta forma, poucos efeitos colaterais. Somando-se ao fato geralmente serem degradas em aminoácidos, e assim não gerarem metabólitos tóxicos 21, 44, as toxinas proteicas são promissoras para o desenvolvimento de ferramentas farmacológicas. Através de modificações em suas estruturas químicas, podemos otimizar os efeitos terapêuticos de uma toxina, e minimizando sua toxicidade 44, 45. Atualmente, são inúmeros os medicamentos disponíveis no mercado ou em fase de testes provenientes de venenos ofídicos, como o captopril 44, 46.
3.3. Acidentes ofídicos
A OMS (Organização Mundial da Saúde) classifica os acidentes ofídicos como um dos principais problemas de saúde-pública, especialmente negligenciados nas áreas rurais dos países tropicais e subtropicais 1, 2. Avalia-se que todo ano ocorram 2,5 milhões de acidentes ofídicos, causando 125 mil mortes e 100 mil sobreviventes com sequelas severas. A maioria destes
26
acidentes acontece no sul e sudoeste asiático, África sub-Arábica, América Central e América do Sul 3, 4, 5. As deficiências do sistema de saúde e a falta de disponibilidade de soros antiofídicos contribuem para a alta mortalidade e sequelas físicas e psicológicas nas vítimas 6, 7.
As principais serpentes responsáveis por acidentes ofídicos encontram-se nas famílias Elapidae e Viperidae, levando a quadros clínicos caracterizados por dano tecidual local (edema, bolha, hemorragia e mionecrose) e efeitos sistêmicos de risco iminente à vida. Os efeitos locais são causados principalmente por duas enzimas: PLA2 e SVMP, encontradas nos venenos das espécies de ambas as famílias 8, 9. Já os efeitos sistêmicos incluem neurotoxicidade, hemorragias espontâneas e insuficiência renal aguda, dependendo da espécie da serpente responsável pelo envenenamento 7, 10.
A América latina é a terceira área geográfica mais afetada por acidentes ofídicos, atrás apenas da África e Ásia 3, 47. Quatro gêneros são clinicamente relevantes na América Latina: Bothrops, Crotalus, Lachesis (as três pertencentes à família Viperidae) e Micrurus (família Elapidae) 5. Em 2012, 29.322 acidentes ofídicos foram registrados no Brasil, com incidência de 15,1 acidentes a cada 100 mil habitantes, dentre os quais 129 levaram suas vítimas a óbito 2. As principais regiões afetadas pelos acidentes foram Norte, Sudeste e Nordeste (Figura 2). O padrão destes acidentes parece permanecer imutável nos últimos anos: os indivíduos mais afetados são homens, entre 15 e 49 anos, trabalhadores rurais, com os acidentes ocorrendo durante o dia e afetando principalmente membros inferiores 48.
27
Figura 2. Porcentagem dos acidentes ofídicos no Brasil, por região, no ano de 2012 2.
As serpentes do gênero Bothrops (família Viperidae) são responsáveis pelos acidentes ofídicos brasileiros de maior importância epidemiológica, representando 90% destes envenenamentos 7, 10, 49. Este fato é atribuído à ampla distribuição geográfica, assim como comportamento agressivo quando estas serpentes se sentem ameaçadas 50.
3.4. Gênero Bothrops
A família Viperidae inclui serpentes solenóglifas e são divididas em 4 subfamílias: Azemiopinae, Causinae, Crotalinae e Viperinae 51, sendo que apenas a Crotalinae é encontrada no Brasil. Esta subfamília inclui serpentes dos gêneros Bothrops, Bothriopsis, Bothrocophias, Crotalus e Lachesis 52. O gênero Bothrops, por sua vez, compreende cerca de 30 espécies distribuídas por todo o território nacional, tais como B. jararaca (regiões Sul e Sudeste do Brasil), B. jararacussu (Centro-Oeste e Sudeste), B. alternatus (Sul), B. fonsecai (Sudeste), B. atrox (Norte), B. erythromelas (Nordeste) B. brazili (Norte) e B. neuwiedi (exceto Norte do país) 10, 15.
31,16% 24,12% 25,24% 8,50% 10,98%
Norte
Nordeste
Sudeste
Sul
Centro-Oeste
28
As serpentes do gênero Bothrops, ou serpentes botrópicas, são popularmente conhecidas como ‘jararacas’, ‘surucucurana’, ‘jararacuçu’, ‘urutu-cruzeiro’, ‘cotiara’, ‘jararaca-do-rabo-branco’, ‘malha-de-sapo’, ‘patrona’, ‘comboia’, ‘caiçara’, entre outras denominações 53. Apresentam características variáveis de acordo com suas espécies, mas, de forma geral, possuem médio a grande porte (algumas espécies chegam a atingir mais de um metro e meio de comprimento), cauda lisa, ausência de chocalho e predomínio de hábitos noturnos ou crepusculares 10, 31. Apresentam predileção por ambientes úmidos e locais com alta proliferação de roedores. Desta forma, costumam habitar zonas rurais, matas, áreas cultivadas, paióis, celeiros e periferias de grandes cidades 7, 10.
As serpentes botrópicas se alimentam de ratos, aves, lagartos e rãs, variando entre espécie e idade do animal. Elas não depositam ovos, parindo até 40 filhotes (como é o caso da B. atrox). Uma vez que os filhotes botrópicos precisam matar suas para se alimentar, já nascem com capacidade de produzir e inocular o veneno. Este veneno apresenta certa variação em relação ao da serpente adulta, já que os filhotes possuem dieta diferenciada 31.
Os venenos botrópicos são constituídos por enzimas que visam imobilização, morte e digestão da presa. Desta forma, podemos encontrar em sua composição: proteases, fosfolipases e hialuronidases que promovem inflamação, necrose e digestão da presa 54; hemorraginas capazes de lesar o endotélio, levando a hemorragia e morte 55; ativadores do fator X e II (protrombina) causam distúrbios de coagulação 56; e neurotoxinas que levam a imobilização da presa por bloqueio da junção neuromuscular, através de ação pré- (β-neurotoxinas) ou pós-sinápticas (α-neurotoxinas) 55.
Apesar das neurotoxicidade não ter aspecto tão marcante nos venenos botrópicos, como tem nos crotalídicos e elapídicos, estudos anteriores revelaram sua presença nos venenos de B. jararacussu 57, 58, B. moojeni 59, B. leucurus 60, B. pirajai 61, B. erythromelas 62, B. jararaca 62, B. lanceolatus 63, B. neuwiedi 64 e B. insularis 65, 66.
Em humanos, o envenenamento botrópico é marcado por efeitos locais (dor intensa, edema, eritema, equimose, bolha e necrose) e manifestações sistêmicas (alterações da coagulação sanguínea e sangramento). Além disso, podem ocorrer sangramentos em ferimentos
29
cutâneos preexistentes, náuseas, vômitos, sudorese, hipotensão arterial e choque 10, 67, 68. Bactérias presentes na boca da serpente podem levar a complicações da necrose local e formação de abcessos 69. O óbito geralmente ocorre por choque e insuficiência renal característicos dos envenenamentos mais graves, mas também pode ser proveniente de hemorragias de locais nobres, como o cérebro 70, 71, 72, 73.
Apesar do curso clínico do envenenamento botrópico, o tratamento dos casos leva a uma letalidade consideravelmente baixa (0,3%). O óbito aparenta estar relacionado com a idade do paciente, onde pacientes com 50 anos ou mais apresentaram maior frequência de evolução fatal, talvez em razão do estado de saúde pré-existente destes pacientes e menor capacidade de regeneração dos tecidos 71, 74, 75. No entanto, o número de pacientes tratados com sequelas é maior, tais como perda do membro afetado ou de segmento deste (0,7%) 10, 72, 76.
3.5. Bothrops fonsecai
As serpentes B. fonsecai, B. cotiara, B. itapetiningae e B. alternatus encontram-se no grupo alternatus, uma linhagem de Bothrops spp., caracterizada por serpentes terrestres que atingem 90 cm de comprimento ou mais (sendo as fêmeas maiores que os machos), circunferência moderada a robusta, presença de fosseta loreal (órgão sensorial termorreceptor), 9 a 14 escamas intersupraoculares, cauda não preênsil e predileção por presas mamíferas. Seus ventres são predominantemente pretos, enquanto a região dorsal é de coloração escura (do marrom ao preto), com manchas em forma de espada, além de uma mancha prostoorbital com distintivo preto 11, 12, 13, 15, 14, 77, 78.
A serpente B. fonsecai (Figura 3) recebeu seu nome em homenagem a Flávio da Fonseca, antigo Diretor do Laboratório de Parasitologia do Instituto Butantã. Em razão do desflorestamento de seu habitat (pinhais de Araucaria augustifolia em planaltos) e mudanças microclimáticas, passou a ser catalogada como “quase ameaçada de extinção”. Há poucos relatos clínicos de acidentes envolvendo esta espécie, uma vez que se encontra ecologicamente afastada da população 11, 12, 13, 14.
30 Figura 3. Bothrops fonsecai 79.
A serpente B. fonsecai é comumente confundida com B. cotiara, em razão de suas semelhanças morfológicas. No entanto, B. cotiara possui mais pigmento escuro nas escamas intracefálicas e faixa pós-orbital semelhante a um anzol. Além do mais, possuem distribuições geográficas semelhantes, o que facilita a confusão das espécies. Apesar disso, não coabitarem as mesmas regiões, sendo que B. fonsecai é endêmica no sudoeste brasileiro, especialmente nordeste de São Paulo, sul do Rio de Janeiro e extremo sul de Minas Gerais (Figura 3) 11, 12, 13, 14, 15, 80.
31
Figura 4. Distribuição geográfica das serpentes B. fonsecai e B. cotiara 15. Tashima et al. notou que a composição do veneno de B. fonsecai e B. cotiara são distintas. PLA2 são abundantes no veneno de B. fonsecai, enquanto que ausentes nos de B. cotiara, podendo, desta fora, ser usadas como marcador taxonômico (Figura 5) 15. A seguinte constituição proteica foi encontrada no veneno de B. fonsecai: 42,5% de SVMP (3,4% tipo I e 39,1% tipo III); 30,1% de PLA2; 9,8% de lectina tipo-C; 4,4% de desintegrinas de tamanho médio; 4,1% de serinoprotease; 3,9% de VEGF; 2,4% de CRISP; 1,9% de LAAO; e 0,7% de fragmentos de desintegrinas ricos em cistina.
32
Figura 5. Composição proteica dos venenos de B. cotiara (A) e B. fonsecai (B). Note: metaloproteases (SVMPs) tipo I (PI) e III (PIII); desintegrinas (desintegrin), fragmentos de desintegrinas ricos em cisteínas (DC-fragments), fator de crescimento do endotélio vascular (svVEGF), proteína secretora rica em cisteína (CRISP), serinoproteases (serine proteinases), lectina tipo-C (C-lectin), L-aminoácido oxidases (LAO) e fosfolipases A2 (PLA2) 15.
Quanto às atividades biológicas, Queiroz et al. verificaram que a letalidade do veneno de B. fonsecai (LD50 de 56,8 mg/kg, pela via intraperitoneal) é similar à de B. cotiara e ligeiramente maior que às de B. alternatus e B. itapetiningae 19. Rosenfeld et al. encontraram alta atividade coagulante in vitro no veneno de B. fonsecai, aproximadamente 5 vezes maior do que B. cotiara, B. alternatus e B. itapetiningae, e aproximadamente 60% maior que a de B. jararaca 81. Posteriormente Nahas et al. observou que o veneno de B. fonsecai possui atividades trombina-like e ativadora do fator X e protrombina, sendo capaz de ativar diretamente o fibrinogênio, sem necessitar dos fatores VII, VIII, IX, XII e XIII para sua atividade coagulante 56.
Queiroz et al. notaram a presença de atividades fosfolipásica, proteolítica e hialuronidásica no veneno de B. fonsecai. Observaram tembém que as atividades foram neutralizadas pelo antiveneno botrópico equino comercial no seguinte grau: 15 a 20% de neutralização proteolítica e 70% de neutralização hialuronidásica. Destaca-se a completa ausência de neutralização da atividade fosfolipásica de B. fonsecai, possível indicativo de singularidade destas enzimas em relação às presentes nos venenos de demais Bothrops spp 19.
33
O veneno de B. fonsecai causa bloqueio neuromuscular, assim como é comum a outras serpentes botrópicas 20. Apesar de sua dieta exclusiva de mamíferos, Fernandes et al. observaram que B. fonsecai é mais ativo em preparações neuromusculares de ave (biventer cervicis de pintainho; BCp) que de mamíferos (nervo frênico-diafrágma; NFD). O mecanismo mais provável para este bloqueio é pela miotoxicidade, hipótese reforçada pelos seguintes resultados: diminuição na resposta a acetilcolina (ACh) e cloreto de potássio (KCl), agentes que necessitam da integridade muscular para causar contratura; bloqueio neuromuscular similar quando o músculo é estimulado indiretamente (estimulação de nervo) ou diretamente (estimulação de músculo), apontando que não há atividade pré-sináptica; alta atividade extracelular de creatinoquinase (CK), enzima intracelular do tecido muscular, extravasada quando há lesão de membrana; e grande quantidade de lesão celular de músculo esquelético, através de análise histológica 20.
Apesar de Queiroz et al. terem observado que a atividade fosfolipásica do veneno de B. fonsecai não é inibida pelo antiveneno botrópico comercial, Fernandes et al. verificaram que o bloqueio da junção neuromuscular foi completamente prevenido quando há pré-incubação com antiveneno 19, 20. Juntos, esses resultados sugerem a participação de outros componentes do veneno para o bloqueio neuromuscular e questionam a importância das PLA2 para a atividade do veneno total na junção neuromuscular.
Tashima et al. ainda observaram grande similaridade entre a sequência de aminoácidos de uma fração isolada do veneno de B. fonsecai e diversas outras PLA2 básicas G6D49 (com resíduos de glicina na posição 6 e de ácido aspártico na posição 49) botrópicas, como as presentes nos veneno de B. jararaca e B. insularis 15. Sabendo-se que as PLA2 básicas G6D49 possuem potente ação miotóxica, induzem maior tempo de coagulação e edema local rápido e sustentado, os autores propuseram a possibilidade destes efeitos se reproduzirem nesta fração do veneno de B. fonsecai 9, 15, 18.
34 3.6. Fosfolipases A2
As fosfolipases são enzimas hidrolíticas de ligações ésteres de glicerofosfolipídios. De acordo com o sítio de hidrólise em que atuam, são classificadas em fosfolipases A1, A2, B, C e D (Figura 6). Dentre elas, as PLA2 são conhecidas por atuar na posição 2 da ligação acil-éster dos 3-sn-fosfoglicerídeos, causando sua quebra e liberação de ácidos graxos e lisofosfolipídios 17.
Figura 6. Sítio de hidrólise das diferentes classes de fosfolipases. As fosfolipases B são providas de atividade fosfolipase A1 e A2. Note: R1 e R2 são cadeias de hidrocarbonetos dos ácids graxos; e X é um grupamento polar, como CH2CH2N(CH3)3 na fosfatidilcolina, CH2CH2NH2 na fosfatidiletanolamina e CH2CH(COOH)NH2 na fosfatidilserina 17.
São diversos os glicerofosfolipídios de ocorrência natural que podem agir como substratos para as PLA2, como o fator ativador de plaquetas, fosfolipídios oxidados de cadeias curtas e fosfolipídios de cadeia longa. Suas estruturas variadas apresentam cadeias acil na posição sn-2 de diferentes tamanhos, variando de dois (acetil), 20 (aracdonato) ou mais carbonos. Desta forma, a hidrólise catalisada pelas PLA2 causa a liberação de diferentes ácidos graxos, de acordo com o substrato da reação 82.
As PLA2 podem ser classificadas em grupos de I a XI e seus subgrupos 83, 84, 85, 86, 87, 88. Estes grupos, por sua vez, podem ser separados em PLA2 que utilizam um resíduo de histidina ou de serina para realizar sua atividade catalítica. As PLA2 que utilizam histidina também contam com um
35
aspartato adjacente, formando a díade His/Asp, essencial para a ligação de íon Ca2+ e, assim, realização de sua atividade catalítica. São moléculas tipicamente pequenas (aproximadamente 14 kDa) e extracelulares, abrangendo os grupos I, II, III, V, IX, X e XI, incluindo as PLA2 de venenos de serpentes, abelhas, lagartos, escorpiões e caracóis 86, 89, 90, 91, 92. Já as PLA2 que utilizam o resíduo de serina englobam os grupos IV, VI, VII e VIII. Elas não dependem de cálcio para exibir atividade catalítica, sendo maiores e intracelulares 82.
As PLA2 ofídicas encontram-se nos grupos I e II, de acordo com suas sequências de aminoácidos e organização das pontes dissulfeto 93. O grupo I é representado pelas PLA2 de venenos elapídicos (subgrupo A) e pancreáticas (subgrupo B), contendo de 115-120 resíduos de aminoácidos e sete pontes dissulfeto. Já as PLA2 do grupo II contêm 120-125 resíduos de aminoácidos, sete pontes dissulfeto e são encontradas em venenos viperídicos (subgrupo A e B) e diversos tecidos de mamíferos, como líquido sinovial (subgrupo A), plaquetas (subgrupo A), testículos (subgrupo C), pâncreas (subgrupo D), baço (subgrupo D), cérebro (subgrupo E), coração (subgrupo E) e útero (subgrupo E) de humanos 81, 93.
O grupo II de PLA2 ainda pode ser dividido de acordo com o resíduo de aminoácido que ocupa a posição 49 de sua molécula. PLA2 com resíduo de ácido aspártico na posição 49 (PLA2 Asp49) também são chamadas de PLA2 catalíticas, uma vez que este aminoácido é essencial para a ligação do íon Ca2+ à molécula e, assim, realização da sua atividade enzimática. Por outro lado, PLA2 com resíduos de lisina (PLA2 Lys49) e serina (PLA2 Ser49) não são capazes de se ligarem ao íon Ca2+ de forma eficaz, sendo assim chamadas de não-catalíticas 94, 95.
Verheij et al. propuseram que a atividade catalítica das PLA2 se dá pela ação de uma unidade catalítica composta por resíduos de histidina na posição 48 (His48), ácido aspártico na posição 49 (Asp49) e uma molécula de água. A forte interação entre o próton na posição 3 do anel imidazólico da His48 com o grupo carboxílico do Asp49 impede que haja rotação do anel imidazólico. Desta forma, o nitrogênio na posição 1 do anel imidazólico fica em posição adequada para participar da catálise. Quando uma molécula de água faz o ataque nucleofílico ao carbono do grupo éster do glicerofosfolipídio, o anel imidazólico da His49 recebe um próton da molécula de água, facilitando a
36
hidrólise da ligação éster. Então o anel imidazólico doa o próton recebido anteriormente para um oxigênio do lisofosfolipídio a ser formado e liberado 96.
Resíduos de tirosina na posição 28 (Tyr28), Glicina na posição 30 (Gly30), glicina na posição 32 (Gly32) e ácido aspártico na posição 49 (Asp49) formam a alça de ligação para o íon Ca2+. Tal ligação é fundamental para a ação das PLA2 provenientes de venenos ofídicos, fixando o grupamento fosfato do substrato, estabilizando a carga negativa do oxigênio do grupo carbonil da ligação éster a ser hidrolisada e estabilizando o intermediário tetraédrico da reação catalítica 82, 97.
37
Figura 7. Mecanismo catalítico das PLA2. O ataque catalítico à ligação do substrato (A) é seguido pela formação de um intermediário tetrahédrico (B) e, por sim, hidrólise do glicerofosfolipídio (C) 90.
As PLA2 podem ser encontradas em abundância no pâncreas de mamíferos, onde possuem função digestiva, ou em veneno animais, como serpentes e abelhas, onde participam de seus efeitos biológicos. Além disso, ainda participam de diversos outros processos fisiológicos: contração da musculatura lisa, processos inflamatórios, fertilização, proliferação celular, manutenção do depósito de fosfolipídios, reparo da membrana plasmática, entre outros 82.
38
Os ácidos graxos e lisofosfolipídios liberados na quebra dos glicerofosfolipídios pelas PLA2 possuem sua própria importância farmacológica e fisiológica. Entre os ácidos graxos, destacam-se os ácidos oléico e aracdônico, importantes reservas de energia para o animal 98, 99. O ácido aracdônico ainda possui destaque na inflamação, agindo como segundo mensageiro e precursor dos eicosanoides 100, 101, 102. Os lisofosfolipídios, por sua vez, participam do remodelamento de fosfolipídios, sinalização celular e perturbação de membranas 103, 104.
Além as atividades relacionadas à hidrólise de fosfolipídios, as PLA2 encontradas em venenos ofídicos ainda expressam grande gama de ações biológicas, tais como: atividade edematogênica; neurotoxicidade pré e pós-sináptica; miotoxicidade local e sistêmica; atividade anticoagulante; indutor e inibidor da agregação plaquetária; atividades hemolítica e hemorrágica; atividade anti-hemorrágica; atividade hipotensora; atividade convulsivante; além da lesão de diversos órgãos e tecidos 16, 17.
Diversas evidências vêm desvinculando a atividade catalítica de diversas atividades biológicas PLA2 específicas, indicando a presença de ao menos dois sítios ativos em suas moléculas: um catalítico e outro farmacológico 97, 105. Além do mais, diversas PLA2 com efeitos biológicos de potências muito distintas apresentam grande homologia na sequência de aminoácidos e similaridade estrutural. Assim, a relação estrutura-atividade das PLA2 e previsão de suas atividades é extremamente difícil.
3.7. Miotoxicidade
Miotoxicidade é a ação citotóxica específica de um veneno ou toxina sobre o músculo esquelético, levando a degeneração e morte celular (mionecrose) 106. Trata-se de uma manifestação frequente nos envenenamentos induzidos por serpentes viperídicas e elapídicas 107, 108, assim como por ataques em massa por abelhas 109.
São diversos os exemplos de miotoxinas encontradas na natureza, separando-se em quatro grupos: pequenas miotoxinas, miotoxinas fosfolipásicas, cardiotoxinas e toxinas hemorrágicas. As miotoxinas pequenas possuem cadeia única de peptídeos (42 a 45 resíduos de aminoácidos), são
39
básicas e não enzimáticas. São exemplos de miotoxinas pequenas a crotamina e a miotoxina α, encontradas em venenos crotálicos, possuindo também a capacidade de bloquear receptores de sódio. As miotoxinas fosfolipásicas são compostas pelas PLA2 e proteínas complexadas a elas, dividindo-se em neurotóxicas e não-neurotóxicas (com e sem atividade enzimática). Já as cardiotoxinas são básicas e possuem cadeia única de proteína (aproximadamente 60 resíduos de aminoácidos). Por fim, as toxinas hemorrágicas possuem ação miotóxica por mecanismos indiretos. É o caso das metaloproteases hemorrágicas presentes em venenos ofídicos, levando à lesão do músculo esquelético provavelmente por isquemia como consequência da hemorragia 106, 110, 111, 112, 113.
Clinicamente, podemos encontrar dois quadros de miotoxicidade: sistêmica e local. A miotoxicidade sistêmica é caracterizada por dano muscular disseminado por todo o corpo, grande aumento da atividade CK plasmática e mioglobinúria, podendo evoluir para quadros de insuficiência renal e hipercalemia. É característica das serpentes elapídicas, mas também ocorre em alguns envenenamentos viperídicos 16, 114, 115. Já a miotoxicidade local, comum na maioria dos venenos botrópicos, causa mionecrose restrita ao local da picada, sem maiores manifestações sistêmicas 116, 117. Diversos indícios apontam que a variação entre PLA2 de ação local e sistêmica se dá em razão de diferentes especificidades na ligação com células musculares 105.
Diversas alterações no músculo esquelético são características da ação de PLA2, sem causar qualquer lesão nos vasos sanguíneos e células satélite. Em análise histológica pode-se encontrar no músculo lesionado: rompimento da membrana plasmática; áreas de degeneração em formato de cunha próximo à periferia da célula, em razão de seu rompimento, formando as chamadas “delta-lesions”; hipercontração das miofibrilas, inchaço e rompimento das mitocôndrias, formando estruturas floculentas na célula; rompimento de retículo sarcoplasmático e dos túbulos; e picnose do núcleo 118, 119. Além do mais, o processo inflamatório ainda é evidente in vivo, observando-se edema e recrutamento de macrófagos e leucócitos polimorfonucleares 120, 121, 122. Após a miotoxicidade aguda, se dá início o processo de regeneração do tecido. Células satélites miogênicas são ativadas e mioblastos se fundem, formando miotúbulos nos espaço liberado pelas células necróticas 123.
40
A figura 8 esquematiza o mecanismo de ação das miotoxinas fosfolipásicas. Diversos estudos vêm demonstrando que o mecanismo de ação das PLA2 se inicia pela ligação específica às membranas plasmáticas do músculo esquelético 124, 125. Sítios intracelulares de ação só são alcançados uma vez que a PLA2 causam lesão na membrana plasmática e ganham acesso ao citossol 126. Sugere-se que as PLA2 reconheçam proteínas expressas na membrana plasmática de suas células-alvo, mas ainda não se tem evidência de receptores específicos envolvidos no processo de miotoxicidade 105.
Figura 8. Sequência hipotética dos eventos da degeneração celular do músculo esquelético causada pela ação de PLA2 miotóxicas derivadas de venenos 9.
Além do mais, os produtos da hidrólise dos glicerofosfolipídios podem exercer atividade miotóxica, potencializando a atividade as PLA2. Ácidos graxos livres e lisofosfolipídios lesam a membrana plasmática por possuírem ação detergente 127, acilarem proteínas de membrana 128 ou por agirem como mensageiros intracelulares 129.
Após o rompimento da membrana plasmática, se dá início a uma série de eventos que configuram a miotoxicidade. Inicialmente ocorre um
41
rápido efluxo de moléculas citosólicas (como CK, lactato desidrogenase, aspartato aminotransferase, mioglobina e creatina) e influxo rápido e intenso de cálcio, seguindo o gradiente eletroquímico 121, 130, 131, 132, 133, 134, 135. Com o influxo de cálcio, ocorre a hipercontração de alguns sarcômeros e, consequentemente estiramento de outros, causando a hipercontração das miofibrilas observada em análise histológica 111, 136, 137, 138, 139, 140. A hipercontração, por sua vez, causa lesão mecânica à membrana plasmática, rompendo-a.
O influxo de cálcio também é responsável por ativar proteases citosólicas Ca2+-dependentes, como μ-calpaína e m-calpaína. As calpaínas causam degradação miofibrilar, principalmente de desmina e titina 140, 141. A desmina é essencial para a formação de ligações entre as linas Z e entre as miofibrilas e a membrana plasmática 142. Desta forma, sua degradação afeta diretamente a estrutura celular e da unidade contrátil. Já a degradação de titina leva à perda de regiões de registro do sarcômero, desagregação das bandas A e I, além da perda de actina e miosina para o citosol 140. Após algumas horas, o participação de células inflamatórias, principalmente leucócitos e macrófagos, potencializa a degradação de proteínas miofibrilares 143.
As alterações mitocondriais observadas na mionecrose por PLA2 também se deve ao influxo de cálcio. Com o aumento na concentração plasmática de íons Ca2+, a mitocôndria perde o controle sobre seu volume, assim como tem sua membrana lesionada por PLA2 citossólicas Ca2+ -dependentes. A atividade de PLA2 intracelulares também parece participar da lesão de outras estruturas de membrana intracelulares, como túbulos T e retículo sarcoplasmático 111, 126, 136, 144, 145, 146.
42
4. MATERIAL E MÉTODOS
_______________________________
4.1. Reagentes
O anestésico inalatório isoflurano foi adquirido da Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos (Itapira/SP). Todos os reagentes e sais com alto grau de pureza foram obtidos dos laboratórios: Sigma-Aldrich Chemicals, J.T. Baker Chemicals, Synth, Merck KGaA e Bio Rad Laboratories.
4.2. Animais
Foram utilizados camundongos machos da linhagem Swiss, pesando entre 18 a 25 g, obtidos do "Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica" (CEMIB) da UNICAMP (Campinas, SP). Também foram usados pintainhos da linhagem HY LINE W36, derivados da Granja Globo Aves. Os animais foram mantidos em gaiolas abastecidas com água e ração ad libitum, em ambiente com temperatura constante e iluminação controlada (ciclo de 12 horas claro / 12 horas escuro). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Unicamp (CEUA/UNICAMP, protocolo n° 3311-1). Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas estabelecidas pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL).
4.3. Veneno bruto de B. fonsecai
O lote de veneno liofilizado de B. fonsecai utilizado neste trabalho foi resultante de um pool de cinco espécimes adultos, doado pelo Prof. Dr. José Carlos Cogo, do Serpentário do Centro de Estudos da Natureza (CEN) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP - São José dos Campos, SP).
43 4.4. Ensaios bioquímicos
4.4.1. Atividade PLA2
A atividade PLA2 foi avaliada utilizando ensaio colorimétrico por degradação de fosfatidilcolina modificado a partir do método descrito por Price 147. Foi preparada uma solução estoque contendo HEPES (4 mM), Triton X-100 (5 mM), CaCl2 (10mM) e azul de bromotimol (0.124%) armazenada em temperatura ambiente. Antes da realização do ensaio, esta solução teve o pH ajustado para 7,5 e foi aquecida em banho-maria a 37 °C. Após o aquecimento, adicionou-se 5 mM do substrato fosfatidilcolina dissolvida em metanol (resultando em 5 % no ensaio final) e o pH foi rapidamente reajustado, buscando evitar diminuição na temperatura do tampão e hidrólise da fosfatidilcolina. Em uma placa de ELISA contendo 96 poços, foram adicionados, por poço, 180 µl da solução de trabalho e 20 µl das amostras [branco do ensaio, curva de HCl (3,125; 6,25; 12,5; 25 e 50 nmol de HCl), veneno de B. fonsecai ou frações obtidas nas etapas cromatográficas). Em um leitor de ELISA previamente aquecido a 37 °C, as amostras foram incubadas por 5 minutos 147.
A mudança de absorbância após a incubação foi monitorada a 620 nm utilizando um leito de placa SpectraMax 340 plate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA 94089, USA). A presença de atividade PLA2 causará a liberação de H+ no meio, com consequente acidificação e mudança de coloração para mais próximo do amarelo (em razão do azul de bromotimol). Como o comprimento de onda utilizado para a leitura é absorvido pelo espectro azul-verde, ou seja, ausência de reação, quando subtraímos o branco das leituras obtemos valores negativos. Estes valores foram então corrigidos, multiplicando-os por -1, possibilitando dar sequência aos cálculos. Foi feita uma curva de regressão logarítmica com as concentrações de HCl, com a qual os valores de leitura das demais amostras foram calculados. Os resultados foram expressos em nmol de HCl 147.
O ensaio também foi executado em condições de inibição da atividade PLA2: diminuição da temperatura de incubação para 24 °C e substituição do CaCl2 da solução de trabalho por SrCl2 (22,22 mM).
