Após a purificação da LTx2 recombinante, nós realizamos ensaios biológicos para testar se a proteína encontra-se ativa. O conteúdo de proteína do material eluído da coluna foi quantificado e a amostra foi resuspensa em PBS pH 7,2.
4.6.1 – Teste de atividade antimicrobiana
Para verificar a atividade antimicrobiana da toxina LTx2 recombinante utilizamos 4 microrganismos: Salmonella Agona, E. coli TOP 10 F’, Staphiloccocos epidermidis e
Pseudomonas sp. A atividade antimicrobiana foi observada pela formação de um halo de inibição nas placas (figura 17). O sorotipo Salmonella Agona utilizado no experimento foi isolado de pacientes em um trabalho realizado em Ouro Preto, Minas Gerais (Fernandes et. al. 1997). No experimento com Salmonella Agona 142 observamos a formação de um halo de 17 mm no local onde aplicamos a toxina (400 mg/mL), 20 mm onde aplicamos ampicilina 100 mg/mL e 22 mm onde aplicamos canamicina 50 mg/mL. Observamos, na Salmonella Agona 186, um halo de inibição de 10 mm no local onde aplicamos a toxina, um halo de 23 mm onde aplicamos de ampicilina 100 mg/mL e de 22 mm onde aplicamos canamicina 50 mg/mL. Os números 142 e 186 são referentes ao número do paciente do qual a bactéria foi isolada. Em E.
coli TOP 10 F’ observamos a formação de um halo de inibição de 6 mm no local onde aplicamos a toxina (400 mg/mL), e de 19 mm onde colocamos 10 μL de ampicilina 100 mg/mL. No experimento com S. epidermidis, observamos a formação de um halo de inibição de 12 mm no local onde aplicamos a toxina e de 27 mm no local da tetraciclina 15 mg/mL. No experimento com Pseudomonas sp. não observamos a formação de nenhum halo no local onde aplicamos a toxina na concentração de 30,0 mg/μL. A tabela I mostra os resultados condensados dos ensaios antimicrobiano.
Figura 17 - Ensaio antimicrobiano com o Salmonella Agona 142 (A); Salmonella Agona 142 (B); E.
coli TOP 1’0 F’ (C) e Staphilococcus epidermidis (D). A formação dos halos de inibição onde aplicamos 10 μL da toxina na concentração de 400,0 mg/mL é indicada pela seta vermelha. Os locais onde aplicamos antibióticos estão indicados pelas setas azuis. Os antibióticos aplicados, o diâmetro dos halos de inibição e as respectivas concentrações estão apresentados na tabela I.
Tabela I: Diâmetro dos halos de inibição formados nos ensaios antimicrobianos utilizando-se 10 microlitros de LTX2 recombinante e diferentes antibióticos.
Antibiótico (controle positivo) Microrganismo LTx2 Recombinante 4000 μg Ampicilina 1000 μg Canamicina 500 μg Tetraciclina 150 μg
E. coli TOP 10 F’ 6 mm 19 mm Não foi usada Não foi usada
S. agona 186 10 mm 23 mm 22 mm Não foi usada
S. agona 142 17 mm 20 mm 22 mm Não foi usada
S. epidermidis 12 mm Não foi usada Não foi usada 27 mm
Pseudomonas sp Toxina 300 μg
Não houve halo
5 – Discussão
Venenos de aranhas contêm diversos componentes de interesse para a sociedade e, por isso, muitos pesquisadores têm se dedicado a pesquisar sua composição. Toxinas presentes no veneno de diversas aranhas já foram isoladas e caracterizadas, mas a utilização de técnicas de biologia molecular permitiu contornar uma série de limitações das técnicas existentes. A utilização de bibliotecas de cDNA combinadas com técnicas de biologia molecular facilita o isolamento e a obtenção de quantidades significativas das toxinas necessárias para estudos mais detalhados com relação à estrutura e mecanismo de ação destas toxinas (Diniz et. al. 1993, Kalapothakis et. al. 1998, Escoubas et. al. 2000, Kalapothakis et. al. 2002, Cardoso et. al. 2003, de Deus et. al. 2003).
O veneno da aranha Lasiodora sp ainda é pouco explorado. Embora tenha sido relatada atividade tóxica de frações desse veneno sobre insetos e mamíferos, poucos estudos foram realizados com este veneno. Kushmerick et. al. (2001), com o objetivo de estudar a ação do veneno total de Lasiodora sp. em canais iônicos de células GH3, testaram o efeito desse veneno nas oscilações dos níveis de cálcio intracelular. Utilizando-se a técnica de Patch Clamp, estes autores observararam inibição de canais de cálcio do tipo L e modulação da cinética de canais de sódio. Quando as células foram tratadas com o veneno (400 μg/mL de proteína) na presença de tetrodotoxina (TTX), as oscilações no sinal de cálcio foram rapidamente eliminadas. A TTX é um inibidor específico dos canais de sódio e o bloqueio desses canais eliminou as oscilações dos níveis intracelulares de cálcio dependentes de canais de sódio. Para testar a participação dos canais de sódio nos níveis intracelulares de cálcio, o mesmo experimento foi realizado sem a TTX. Nessas condições, o veneno eliminou inicialmente o sinal de cálcio intracelular. Porém, em um segundo momento que os pesquisadores chamaram “fase 2”, foi possível observar novamente o sinal de cálcio. Esse resultado permitiu concluir que o veneno total da Lasiodora sp., além de agir em canais de cálcio tipo L, também altera a cinética de canais de sódio.
Kalapothakis et. al. (2003) utilizando o veneno total de Lasiodora sp em preparação de tecido cardíaco de rato observou que o veneno, na maior dose utilizada (100 μg), causou bradicardia bem como alterações no ritmo cardíaco. Os autores sugeriram, então, que o veneno exercia esses efeitos por causar uma liberação de acetilcolina a partir dos terminais parassimpáticos. Essa hipótese foi confirmada, nesse mesmo trabalho, em um experimento no qual se utilizou anti-colinesterase. A anti-colinesterase neostigmina aumentou significativamente o efeito do veneno.
De Deus (2003) obteve 3 frações distintas ao fracionar o veneno total da aranha Lasiodora sp em coluna de filtração molecular Sephadex G-50F. Estas frações foram denominadas P1, P2 e P3. Ao testar a atividade biológica das frações, a autora observou que as três frações possuíam ação em mamíferos, enquanto somente as frações P2 e P3 possuíam atividade em insetos. Com o objetivo de identificar e caracterizar os clones que codificam para toxinas presentes no veneno total, foi feita uma varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno de Lasiodora
sp. utilizando o antisoro policlonal IgG anti-veneno total como anticorpo primário. Nesta varredura foi identificado o clone 1228, que contem a seqüência codificante para a toxina madura LTx2. A toxina LTx2 é expressa na forma de um prepropeptídeo composto por peptídeo sinal, um peptídeo intermediário e a toxina madura (Figura 5). A região do peptídeo sinal da LTx2 é composta por 23 resíduos de aminoácidos e apresenta as características de um peptídeo sinal clássico, como o núcleo hidrofóbico rico em leucina, logo após o qual aparece o sítio de reconhecimento da enzima peptidase sinal. O sítio de reconhecimento da enzima apresenta uma distribuição bem localizada e não randômica de resíduos de alanina (Perlman & Halvorson 1983). A região do peptídeo intermediário da LTx2 é composta por 27 resíduos de aminoácidos. O peptídeo sinal está relacionado à exportação da molécula e orientação dentro da célula (Boyd e Beckwith 1990). A função dos peptídeos intermediários ainda não foi bem esclarecida, mas Oliveira et. al. (1990 e 1991) e Price-Carter e cols. (1996) sugerem que esteja relacionado com o enovelamento da toxina, e que os mesmos são alvos de enzimas envolvidas em modificações pós-traducionais (Price-Carter e cols, 1996). A região da toxina madura, que é composta por 49 resíduos de aminoácidos, apresenta grande similaridade com as toxinas huwetoxina-II, huwetoxina-VII e huwetoxina-IIa, provenientes da aranha Selenoscosmia huwena, além das toxinas Ltx1 e LTx3, isoladas da aranha Lasiodora sp. Essa similaridade pode ser explicada pelo fato de ambas as aranhas, Lasiodora sp. e Selenocosmia huwena, pertencerem à mesma família. A huwetoxina-II (HWTX-II), um peptídeo com 37 resíduos de aminoácidos e 3 pontes disulfeto, ao ser testada, paralisou reversivelmente insetos, bloqueou a transmissão neuro-muscular em nervo de ratos, causou a morte em camundongos quando injetada i.c.v. e apresentou atividade cooperativa com a da HWTX-I (Shu & Liang 1999, Shu et. al. 2002). A estrutura tridimensional da HWTX-II é muito semelhante à de duas outras toxinas isoladas de caranguejeiras: ESTX, isolada da aranha norte americana Eurypelma californicum (Anette 1989); e a proteína 1 isolada do veneno da aranha mexicana Brachypelma smithii (Kaiser et. al. 1994). A outra toxina com atividade inseticida que divide grande similaridade com a LTx2 e HWTX-II é a huwetoxina-VII (HWTX-VII) (Dai et. al. 2003). A seqüência da HWTX-VII, composta de 35 resíduos de aminoácidos, é semelhante àquela da HWTX-II, exceto por seis resíduos. A atividade biológica
da HWTX-VII também é semelhante à da HWTX-II, causando paralisia em gafanhotos, causando morte em camundongos após injeção i.c.v. e agindo cooperativamente com a HWTX-I (Liang 2004).
A conformação terciária adotada por uma proteína é ditada muito mais pelo padrão de formação das pontes disulfeto do que simplesmente por sua seqüência de aminoácidos. E como é essa conformação que define primariamente a função de uma proteína, estudos de conformação são mais importantes do que simplesmente estudar a similaridade entre seqüências primárias para tentar definir a função de uma proteína (Shu et. al. 2001). Realizando um alinhamento com as toxinas LTx2, LTx1, LTx3, HWTX-II e HWTX-VII, observamos que os resíduos de cisteína estão em posições conservadas nessas toxinas. A predição de estrutura secundária realizada com as 3 toxinas pelo programa PELE (http://seqtool.sdsc.edu), mostrou a presença de duas alfa- hélices em todas as toxinas, sendo que elas estão na porção C-terminal nas HWTX-II e HWTX- VII e na porção N-terminal na LTx2. Já o programa GOR4 (http://doc.bioperl.org/releases/bioperl-1.4/Bio/Tools/Analysis/Protein/GOR4.html), que também mostrou duas alfa-hélices, as localizou na porção N-terminal em todas as toxinas submetidas à análise. Uma semelhança na estrutura terciária dessas toxinas poderia significar que a ação delas também sejam similar. Entretanto, não encontramos na literatura relatos sobre ensaios de atividades, mais específicos, realizados com as toxinas HWTX-II e HWTX-VII.
Em nosso trabalho, nós realizamos a excisão da seqüência codificante para a toxina madura LTx2 do vetor pBlueScript II SK (+/-) e a inserimos em vetor de expressão pET11a. Posteriormente, nós induzimos a expressão da proteína alvo e realizamos um ensaio biológico para testar a eficiência do processo de solubilização dos corpos de inclusão e renaturação das proteínas. Como hospedeiro para expressão, nós utilizamos a bactéria E. coli. A escolha dessa bactéria para a expressão de proteínas recombinantes tem sido recorrente nos trabalhos de biologia molecular devido ao seu genoma ser bem conhecido, possuir uma alta eficiência de transformação e a facilidade para cultivar e manter as células (Saída et. al. 2006). As tentativas anteriores de clonagem não deram resultado devido ao fato de a enzima Nde1 não estar cortando de forma eficiente o produto da PCR, uma vez que esta precisa de uma região flanqueando o sítio de restrição onde ela possa se ancorar. A seqüência codificante foi então inserida no sítio para EcoRV do vetor pBlueScript II SK (+/-), de onde ela foi eficientemente excisada utilizando-se as enzimas Nde1 e BamHI. Após a excisão, procedemos à inserção da seqüência codificante para a LTx2 recombinante no vetor de expressão pET11a. O problema de recircularização do vetor foi contornado com a defosforilação do mesmo. Após a confirmação da clonagem por PCR de colônia, realizamos o seqüenciamento em ambas as fitas do fragmento de acordo com o método
de Sanger (1977) para confirmar se o frame estava correto. No resultado do sequenciamento (Anexo I) foi possível observar tanto o códon de iniciação quanto o stop códon, bem como a seqüência codificante para toxina madura; a análise também permitiu confirmar que a inserção da seqüência codificante no sítio múltiplo de clonagem do vetor de expressão pET11a se deu de forma correta. Procedemos, então, a indução da expressão da toxina recombinante utilizando IPTG. O sistema pET foi o escolhido por este ser considerado um dos sistemas de indução mais poderosos já desenvolvidos para a clonagem e expressão de proteínas recombinantes em bactérias E. coli. O sistema de indução é baseado no promotor T7 RNA polimerase, desenvolvido por Studier et. al. (1990). Nos vetores pET11a o “lac operator” se encontra inserido entre o promotor T7 e seqüências de iniciação de tradução, o que permite a desrepressão mediada por IPTG do promotor T7 em adição a indução por IPTG da T7 polimerase do promotor lac UV5 em cepas de bactérias DE3 (Figura 18). (Manual de plasmídeos da Novagen; Studier et.
Figura 18 – Controle da regulação da expressão da proteína recombinante pelo promotor T7 lac.
Fonte: http://www.novagen.com
O processo de indução inicialmente foi realizado de acordo com o que está descrito em Sambrook et. al. (1989). Entretanto, observamos que tanto o crescimento da cultura quanto a taxa de expressão estavam baixos. Seguindo as recomendações do manual do sistema pET para expressão de proteínas tóxicas (Studier et. al. 1990; Ataíde 2000), utilizamos, ao invés do meio de cultura LB, o meio de cultura SOC para crescimento da bactéria. Quando as culturas atingem a fase estacionária de crescimento, toda a glicose disponível já foi consumida e então uma fonte alternativa de carbono, como o glicerol, passa a ser utilizada. O metabolismo de fontes alternativas de carbono resultam no aumento dos níveis de cAMP o que leva à expressão da T7 RNA polimerase mesmo na ausência de IPTG, o que é chamado de expressão basal da proteína alvo (Grossman at. al. 1998). Minimizar a expressão basal é particularmente importante para a
expressão com vetores pET quando a proteína alvo possui algum tipo de atividade tóxica (Saida
et. al. 2006). Portanto, a utilização do meio de cultura SOC teve como objetivo diminuir a expressão basal da proteína alvo, já que este meio contém glicose, e eliminou o problema do pouco crescimento da cultura. A baixa taxa de expressão da proteína alvo foi revertida através de sucessivas trocas do meio de cultura. Células sem o plasmídeo podem crescer rapidamente na cultura sempre que faltar o antibiótico seletivo. O uso de ampicilina como antibiótico seletivo requer cuidados porque a β-lactamase é produzida em quantidades significativas pelas células resistentes e é secretada no meio, onde pode destruir toda a ampicilina. Além disso, a ampicilina é sensível à hidrólise causada pelo meio ácido resultante do metabolismo celular (Studier et. al. 1990; Ataíde 2000). Somado a isso, outro problema que pode ocorrer é que quase todas as células retêm o plasmídeo até a saturação. Entretanto, sob incubação contínua o número de células contendo o plasmídeo diminui sucessivamente e, com a ampicilina sendo degradada, um número maior de células sem o plasmídeo cresce na cultura. (Studier et. al. 1990; Ataíde 2000). Não ficar atento a estes problemas pode levar a uma interpretação errônea de que os genes estão sendo pouco expressos quando, na verdade, há apenas uma pequena fração das células da cultura contendo o plasmídeo recombinante. Para contornar esse problema recorremos, como foi descrito no item 3.11.1 de materiais e métodos, à utilização de subculturas diluídas para a indução. O que ajudou a eliminar do meio a β-lactamase secretada e manteve o meio sempre seletivo.
Após a indução observamos, através de ensaios imunoquímicos e SDS-PAGE, que a proteína alvo estava sendo expressa na forma de corpos de inclusão. A expressão de proteínas em células procarióticas é uma tarefa complexa já que as proteínas muitas vezes são expressas na forma de corpos de inclusão (Singh & Jia, 2005). Nestas células, proteínas mal enoveladas ou agregados de proteínas são renaturados em sua conformação nativa com o auxílio de chaperones. Se o renovelamento correto não é possível, essas proteínas são degradadas por proteases. Os corpos de inclusão são densos agregados de proteínas que não sofrem ação de proteases (Markossian & Kurganov 2004) e também são formados pelas bactérias como uma resposta à toxicidade da proteína recombinante (Sorensen et. al. 2003). A formação de corpos de inclusão pelas bactérias pode ser vantajosa na medida em que é grande a quantidade de proteína recombinante encontrada nesses agregados. Entretanto, gera uma série de dificuldades para a obtenção da proteína solúvel e ativa. Um procedimento para a obtenção de proteínas ativas que vem apresentando resultados favoráveis é a desnaturação dos corpos de inclusão e a posterior renaturação das proteínas solubilizadas (Nishiyama et. al. 2003, Singh & Jia 2005, Okumura et. al. 2006). Porém, a renaturação das proteínas solubilizadas a partir de corpos de inclusão é um processo de tentativa
e erro (Tsumoto et. al. 2003). Definir uma estratégia eficiente para desnaturação dos corpos de inclusão e posterior enovelamento da proteína recombinante é uma das tarefas mais desafiadoras e importantes em todo o processo de expressão heteróloga (Middelberg 2002). A escolha do agente desnaturante, como por exemplo uréia, hidrocloreto de guanidina ou detergentes, é crucial para a eficiência da solubilização, para a conformação a ser adotada pela proteína quando desnaturada bem como para o processo de renaturação (Tsumoto et. al. 2003). A eficiência da renaturação também é afetada pela maneira como o agente desnaturante é removido da solução (Tsumoto et. al. 2003). Para a obtenção da proteína solúvel seguimos, com modificações, o protocolo descrito por Roberto et. al. (2004).
A desnaturação dos corpos de inclusão foi realizada em solução contendo uréia 6 M e a renaturação foi realizada através de diálise. Normalmente a concentração de uréia de 6 a 8 M é suficiente para garantir a desnaturação dos corpos de inclusão (Tsumoto et. al. 2003). Utilizamos a concentração de 6 M, pois é essa a concentração máxima de sal suportada pela coluna de cromatografia utilizada na purificação. O material renaturado foi então aplicado em uma coluna de fase reversa no sistema HPLC. Esse procedimento nos permitiu, além de purificar a proteína, retirarmos qualquer uréia restante presente na amostra. O material coletado foi aplicado em gel SDS-PAGE para averiguarmos a eficiência da purificação. No resultado da eletroforese foi possível observar a presença de uma banda única, o que confirma a purificação. Para confirmar que a banda observada na eletroforese se tratava da toxina recombinante, realizamos um ensaio de Western Blotting utilizando o veneno total como controle positivo. O resultado do Western Blotting mostrou que a proteína recombinante foi reconhecida pelo antisoro policlonal anti- veneno total. O procedimento que utilizamos para obternção de proteína ativa já havia sido utilizado com sucesso em outros trabalhos (Roberto et. al. 2004, Tsumoto et. al. 2003, Sorensen
et. al. 2003).
Após a confirmação de que a proteína purificada correspondia à toxina LTx2 recombinante, realizamos um ensaio antimicrobiano para testarmos se a proteína recombinante encontrava-se ativa e se ela possuía esse tipo de atividade. Em nosso ensaio antimicrobiano foram utilizados quatro microrganismos: Salmonella Agona isolada de dois pacientes durante um surto ocorrido na cidade de Ouro Preto, Minas Gerais; Escherichia coli TOP10 F’, Estaphilococcos epidermidis
e Pseudomonas sp. A salmonelose é uma das zoonoses de maior importância médica, afetando pessoas tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento (Fernandes et. al. 1997). Alguns sorotipos de Salmonella persistem por um longo período, já outros apenas ocorrem por curtos espaços de tempo. Como foi o caso da Salmonella Agona, que ocorreu em vários países, incluindo o Brasil (Calzada et. al. 1984, Clark et. al. 1973, Pessoa et. al. 1978).
Em Ouro Preto, este sorotipo ocorreu por um período de 6 meses, sendo detectado de 28 de Novembro de 1984 a 24 de Maio de 1985 (Fernandes et. al. 1997, Calzada et. al. 1984 & Clark
et. al.. 1973). Fernandes et. al. (1992) mostrou que as cepas de Salmonella Agona pertencentes ao biotipo 1a apresentavam resistência a diversos antibióticos. A Salmonella Agona, assim como os outros sorotipos de Salmonella, é incapaz de fermentar lactose. A identificação de cepas capazes de fermentar lactose, isoladas de crianças hospitalizadas, chamou a atenção dos pesquisadores, que tentaram isolar e caracterizar essas cepas (Fernandes et. al. 1997). A toxina, na concentração de 300,0 μg/mL, inibiu o crescimento de ambas a colônias de Salmonella Agona utilizadas, bem como o crescimento de Estaphilococcos epidermidis e de E. coli TOP10 F’, o que pode justificar o crescimento lento da colônia antes de eliminarmos a expressão basal da proteína recombinante. A toxina não inibiu o crescimento de Pseudomonas sp. na concentração de 40,0 μg/mL. A comparação do resultado obtido em nosso ensaio com aqueles realizados em outros estudos de atividade microbiana é difícil de ser feito devido a diferenças na metodologia (ensaio de crescimento em cultura x crescimento em placas) e diferenças nas cepas de microrganismos utilizados.
A busca por peptídeos com atividade bactericida em venenos animais, apesar da disponibilidade de um grande número de antibióticos comerciais, pode ser de interesse para o combate a doenças infecciosas devido ao surgimento de bactérias resistentes aos antibióticos clássicos (Lohner & Staudegger 2001). Para que se consiga obter substâncias naturais que sejam realmente eficazes no combate a essas doenças infecciosas, é vital o investimento em pesquisas que têm como objetivo identificar substâncias com atividade antimicrobiana específica e que, preferencialmente, exerçam essa atividade através de mecanismos distintos daqueles dos antibióticos clássicos (Daffre et. al. 2001). A presença de mais de 700 peptídeos antimicrobianos já foi constatada nos mais variados organismos, incluindo bactérias, fungos, insetos, moluscos, crustáceos, aracnídeos, entre outros (Daffre et. al.2001). A maioria dos peptídeos com atividade antimicrobiana descrita até o momento foram obtidos da hemolinfa, e alguns poucos foram encontrados como secreção da glândula de veneno de artrópodes (Pimenta e De Lima 2005). Dentre os venenos de aracnídeos, podemos citar: Lycosa singoriensis (Xu & Qu 1989, Budnik et.
al. 2004), as licotoxinas encontradas no veneno da aranha L. carolinensis (Yan & Adams 1998) e