ENSAIOS COM MODULADORES DE FABP4 E PPAR-GAMA

Um primeiro experimento foi conduzido nos tempos iniciais a fim de checar o efeito do inibidor sobre os camundongos nocauteados. O acréscimo do inibidor de FABP4 (iFABP4) mostrou que não houve diferenças significativas entre este e o PPAR-gama-KO sem inibidor nos tempos de 24 e 72h (Figura 43), evidenciando o esperado, uma vez que os camundongos nocauteados para PPAR-gama apresentaram um possível comprometimento da atuação da FABP4.

FIGURA 43. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS PPAR-GAMA-KO COM E SEM INIBIDOR DE FABP4. Experimentos realizados com macrófagos PPAR-gama-KO e parasitos de L. (L.) amazonensis na presença e ausência de inibidor de FABP4. Quantidade de amastigotas a cada 100 macrófagos com MOI=5. **** P < 0,0001 (ANOVA 1h sem inibidor vs. 24h sem inibidor, 24h sem inibidor vs. 72h sem inibidor).

Um novo experimento desta vez com macrófagos WT e PPAR-gama-KO foi realizado para a quantidade de macrófagos que não seriam infectados sob tratamento com inibidor de FABP4 (Figura 44), mesmo após a inoculação de parasitos. A infecção com macrófagos PPAR-gama-KO tratados ou não com o inibidor de FABP4 mostrou que o número de células não infectadas também não apresenta diferença significativa em todos os tempos considerados. Já a quantidade de macrófagos não infectados do grupo WT foi inferior em todas as condições consideradas quando comparado ao grupo PPAR-gama-KO, mesmo quando tratados com o inibidor de FABP4.

FIGURA 44. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO COM E SEM INIBIDOR DE FABP4. Experimentos realizados com macrófagos WT e PPAR-gama-KO e parasitos de L. (L.) amazonensis sob tratamento ou não de inibidor de FABP4. Quantidade de macrófagos não infectados com MOI=5. ** p ≤ 0,01 (ANOVA; WT 24h vs. KO 24h), * p ≤ 0.05 (ANOVA; WT 72h vs. KO 72h).

Com tal confirmação, para os ensaios subsequentes, os tempos de 1, 48 e 96h foram adotados para a contagem de infecção e, também, a forma amastigota axênica passou a ser utilizada, quando possível, em algumas infecções de macrófagos, uma vez que estas apresentaram um bom padrão de infecção mostrando rápida expansão de VPs nos macrófagos in vitro quando comparadas às formas promastigotas (eficiência observada também para o grupo de pesquisa com animais Balb/c). As infecções com MOI=5 apresentaram um grande número de parasitos no interior das células após 48h (Figura 45), especialmente nos macrófagos WT, ao passo que na presença de 20 µM do inibidor específico de FABP4 há praticamente 50% de redução do número de amastigotas/100 macrófagos em comparação ao grupo não tratado. Esta tendência já foi observada em outras etapas do projeto em nosso laboratório.

A seguir, macrófagos WT foram incubados com o agonista de PPAR-gama Rosiglitazona, uma tiazolidinediona capaz de aumentar a sensibilidade de adipócitos à insulina (Tan et al., 2002). O papel deste ligante na infecção de macrófagos por patógenos ainda não é bem estabelecido, uma vez que os estudos com esta molécula concentram-se na área de diabetes e adipogênese (Tsai et al., 2010). Na presença de 10 µM de Rosiglitazona há uma leve redução da carga parasitária, mas que se mantém ainda elevada após 48h e próxima à observada em macrófagos não tratados (Figura 45).

FIGURA 45. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO COM E SEM INIBIDOR DE FABP4 E ROSIGLITAZONA. Número de amastigotas de L. (L.) amazonensis a cada 100 macrófagos. Infecções com macrófagos diferenciados de medula óssea de camundongos WT e PPAR-gama-KO (KO). Após a primeira hora de infecção (MOI=5), as culturas foram lavadas com PBS 1x e incubadas (+) ou não com iFABP4 a 20 µM ou Rosiglitazona a 10 µM por 48h. As lamínulas foram fixadas e coradas para visualização e contagem de (LEGENDA CONTINUA NA PÁGINA SEGUINTE) CONTINUAÇÃO DA LEGENDA – FIGURA 45 amastigotas intracelulares. **** P < 0,0001 (ANOVA; WT vs. WT incubados com iFABP4, WT vs. WT incubadas com Rosiglitazona).

Ao analisarmos o perfil de infecção de macrófagos PPAR-gama-KO em comparação com macrófagos controle de animais WT, há redução expressiva da infecção, confirmando nossos importantes achados de infecções anteriores (Figura 33). Na presença de iFABP4, não são observadas diferenças significativas no número de amastigotas nos diferentes grupos de macrófagos. Além disso, macrófagos PPAR-gama-KO na presença de Rosiglitazona apresentam número de amastigotas equivalente ao de macrófagos não tratados, diferentemente dos macrófagos WT também tratados. De fato, quando os macrófagos KO infectados são incubados com o agonista, não ocorre reversão ao fenótipo do grupo WT, pois estas células não devem expressar o receptor em que o agonista se liga. Ressaltamos que neste conjunto de ensaios, talvez a Rosiglitazona na concentração e tempo de incubação testados não tenha sido capaz de induzir o aumento do número de parasitos nos macrófagos WT. Além disso, estudos demonstraram que a regulação dos balanços de FABP4 e PPAR-gama pode ser extremamente fina, sendo que a superexpressão do receptor pode levar a um efeito de feedback negativo (Makowski et al., 2005; Garin-Shkolnik et al., 2014), reduzindo a quantidade de FABP4 disponível, o que consequentemente afetaria a proliferação do parasito no interior das células hospedeiras.

Foi ainda observada uma discreta alteração nos parâmetros morfométricos (Figura 46) e de número de parasitos por vacúolo (Figura 47) entre os diferentes macrófagos para algumas das condições. A tendência dos VPs do grupo WT serem maiores que os VPs de macrófagos PPAR-gama-KO se manteve, assim como sua redução na presença de iFABP4. Na presença de Rosiglitazona foi possível observar aumento das áreas dos VPs nos macrófagos WT quando comparado às infecções com macrófagos também WT tratados com iFABP4 (Figura 46). De fato, as condições onde observamos haver mais vacúolos expandidos, maior número de vacúolos por macrófagos (Figura 47) e com mais amastigotas por VP são as mesmas condições com maiores cargas parasitárias quantificadas na Figura 45.

FIGURA 46. AVALIAÇÃO DAS ÁREAS DE VACÚOLOS PARASITÓFOROS DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO INFECTADOS COM LEISHMANIA E INCUBADOS OU NÃO COM INIBIDOR DE FABP4 E ROSIGLITAZONA. Área de VPs de macrófagos WT e PPAR-gama-KO infectados com L. (L.) amazonensis conforme condições descritas na Figura 45. Cada símbolo representa a área de um VP. Foram medidas as áreas de pelo menos 115 VPs para cada condição. *** P ≤ 0.001 (ANOVA; WT vs. WT incubados com iFABP4 e WT incubados com iFABP4 vs. WT incubados com Rosiglitazona).

FIGURA 47. AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE AMASTIGOTAS POR VACÚOLO PARASITÓFORO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO INCUBADOS OU NÃO COM INIBIDOR DE FABP4 E ROSIGLITAZONA. Número de amastigotas por cada VP em macrófagos WT e PPAR-gama-KO infectados com L. (L.) amazonensis conforme condições descritas na Figura 45. Cada símbolo representa um amastigota intravacuolar, sendo contados ao menos 116 VPs para cada condição. **** P ≤ 0,0001 (ANOVA; WT vs. WT incubados com iFABP4); ** P ≤ 0.01 (ANOVA; WT incubados com iFABP4 vs. WT incubados com Rosiglitazona); * P ≤ 0.05 (ANOVA; KO vs. KO incubados com Rosiglitazona).

Os resultados observados nas Figuras 46 e 47 seguem o padrão já discutido na figura 45, exceto por um discreto aumento, porém não significativo, no grupo WT tratado com Rosiglitazona quando comparado ao grupo WT não tratado. Já a quantidade de VPs por macrófago (Figura 48) apenas confirmou aquilo já observado na figura 36, sem nenhuma outra diferença significativa entre os demais grupos tratados.

FIGURA 48. AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE VACÚOLOS PARASITÓFOROS POR MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO INFECTADOS COM LEISHMANIA E INCUBADOS OU NÃO COM INIBIDOR DE FABP4 E ROSIGLITAZONA. Número de VP por cada macrófago WT e PPAR-gama-KO infectados com L. (L.) amazonensis conforme condições descritas na Figura 45. Cada símbolo representa um VP, sendo contados ao menos 40 macrófagos para cada condição. **** P ≤ 0,0001 (ANOVA; WT vs. WT incubados com iFABP4); ** P ≤ 0.01 (ANOVA; WT incubados com iFABP4 vs. WT incubados com Rosiglitazona); * P < 0.05 (ANOVA; KO vs. KO incubados com Rosiglitazona).

4.2.2. RNA DE INTERFERÊNCIA

Vale salientar as dificuldades da introdução de siRNA em células primárias, especialmente aos macrófagos. Tal desafio parte dessas células expressarem enzimas que podem degradar nucleotídeos externos, já que são importantes células na resposta imunológica à patógenos/partículas estranhas (Zhang et al., 2009; Jensen et al., 2014). Além disso, a porcentagem de eficiência da técnica do RNA de interferência é questionável, uma vez que inúmeros fatores influenciam a funcionalidade das moléculas de siRNA (Li & Cha, 2007).

Para os primeiros experimentos realizados utilizando esta técnica, optamos pela MOI=2 com amastigotas axênicos, uma vez que as células haviam passado um maior tempo em cultura para diferenciação, assim como para a transfecção de seus respectivos RNAs, podendo, portanto, interferir na viabilidade celular devido à novas alterações, como a infecção de parasitas.

A fim de confirmar a funcionalidade da técnica, utilizamos um controle positivo não específico da transfecção conjugado à expressão de GFP (Green Fluorescent Protein) que foi confirmada por microscopia de fluorescência (Figura 49). O controle positivo da reação mostrando que a técnica de transfecção utilizando o protocolo de Lipofectamina foi exitoso e não interferiu na resposta frente à infecção, já que a quantidade de amastigotas intracelulares foi semelhante à observada para macrófagos não-transfectados (Figura 50).

FIGURA 49. MACRÓFAGOS TRANSFECTADOS COM GFP. Grupo controle da transfecção com macrófagos expressando GFP (verde). Os núcleos macrofágicos foram corados em azul (DAPI). Barra = 7 µm.

A infecção possibilitou a análise de alguns parâmetros semelhantes aos utilizados nas infecções do item 4.2.1. como o número de parasitos de L. (L.)

amazonensis a cada 50 macrófagos e a quantidade de macrófagos infectados a

cada 50 células analisadas.

Utilizamos um controle negativo como sendo não transfectado como garantia de que a infecção ocorreria normalmente, assim como para comparação em níveis de proteínas nas análises por Western Blot. Além disso, o grupo controle GFP ("GFP"), como descrito anteriormente, tornou-se o controle positivo da reação com

os mesmos propósitos relacionados às células não transfectadas. Observamos também células transfectadas com siFABP4 e siPPAR-gama viáveis e aderidas nos tempos de 1 e 48h (dados não mostrados).

Os resultados apresentados a seguir mostram uma proximidade da infecção nas condições "Não Transfectado" e "GFP", confirmando que a transfecção não interferiu na viabilidade da célula já que possibilitou a infecção de parasitas (Figuras 50 e 51). Foram observados também que para as células transfectadas com siFABP4 e siPPAR-gama, os amastigotas foram menos infectivos na primeira hora e mantiveram-se em número reduzido após 48h de infecção se comparadas às células Não Transfectadas e com GFP, tanto na quantidade de amastigotas por macrófago, quanto na quantidade de macrófagos infectados.

FIGURA 50. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-GAMA DURANTE 1H E 48H. Número de amastigotas por macrófago WT e KO infectados com amastigotas axênicos de L. (L.) amazonensis; MOI=2. Eixo x = condições de cada grupo silenciado para FABP4, PPAR-gama, transfectado GFP ou não transfectado e infectados por 1h e 48h.

FIGURA 51. MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-gama DURANTE 1H E 48H INFECTADOS COM LEISHMANIA. Macrófagos WT e KO infectados com amastigotas axênicos de L. (L.) amazonensis; MOI=2. Eixo x = condições de cada grupo silenciado para FABP4, PPAR-gama, transfectado GFP ou não transfectado e infectados por 1h e 48h.

Para uma segunda bateria de experimentos com RNAi, utilizamos novamente um controle positivo não específico da transfecção conjugado à expressão de GFP confirmada por microscopia de fluorescência (Figura 52) com a mesma finalidade de mostrar o êxito na técnica de transfecção por lipofectamina, a qual não interferiu no perfil das infecções.

Optamos por utilizar as formas promastigotas, uma vez que essas foram utilizadas na maioria dos experimentos realizados e, também, pelas infecções feitas com a forma amastigota ainda serem pioneiras para nosso grupo de pesquisa e assim termos um menor controle das possíveis variáveis durante o curso da infecção. Além disso, utilizamos uma MOI=10, mantendo ainda os tempos de 1h e 48h, porém acrescentando o tempo de 96h somente para contagem de infecção (Figura 53-55).

FIGURA 52. MACRÓFAGOS TRANSFECTADOS COM GFP. Grupo controle da transfecção com macrófagos expressando GFP (verde). Os núcleos macrofágicos foram corados em azul (DAPI). Barra = 10 µm.

O primeiro horário de infecção nos mostrou que para os macrófagos PPAR- gama-KO não houve diferença significativa para nenhum dos grupos, transfectado ou não (Figura 53), o que pode ser explicado pelos macrófagos já serem nocauteados para a característica PPAR-gama, o que poderia estar influenciando também a FABP4, como já observado em experimentos anteriores com inibidores de FABP4 (Figura 43). Já para os macrófagos WT houve diferença significativa entre os grupos não transfectado/tratado com LPS/transfectado com GFP e o transfectado para iFABP4 e, entre o não transfectado/tratado com LPS/transfectado com GFP e o transfectado para PPAR-gama (Figura 53). Por não haver diferença significativa entre o grupo não transfectado/tratado com LPS e entre o grupo transfectado com GFP, possivelmente a diferença na infecção não é decorrente deste procedimento de transfecção, mas sim uma influência do silenciamento tanto da FABP4 quanto do PPAR-gama. Ressalta-se que foi incluído o grupo estimulado com LPS para servir como controle positivo de produção de óxido nítrico nos ensaios de quantificação de nitrito (item 5.2.4.).

FIGURA 53. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-gama, NA PRESENÇA OU NÃO DE LPS DURANTE 1H. Número de amastigotas de L. (L.) amazonensis a cada 100 macrófagos. Infecções com macrófagos diferenciados de medula óssea de camundongos WT e PPAR-gama-KO (KO). Os macrófagos foram pré-tratados ou não seguindo o protocolo de transfecção de acordo com Chen, 2011, antes do contato com os promastigotas na MOI=10. As lamínulas foram fixadas e coradas para visualização e contagem de amastigotas intracelulares. **** P ≤ 0,0001 (ANOVA; WT não transfectado vs. WT siFABP4, WT não transfectado vs. WT siPPAR-gama).

Para o tempo de 48h, ocorreu uma queda no número de parasitas para todos os grupos com macrófagos PPAR-gama-KO, diferentemente do grupo WT em que houve um crescimento em todas as condições, incluindo nas células transfectadas com siFABP4 e siPPAR-gama, o que pode indicar uma possível reversão do silenciamento realizado, embora ainda apresente diferença significativa entre os grupos não transfectado/tratado com LPS/transfectado com GFP e o transfectado

para iFABP4 e, entre o não transfectado/tratado com LPS/transfectado com GFP e o transfectado para PPAR-gama (Figura 54).

FIGURA 54. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-GAMA, NA PRESENÇA OU NÃO DE LPS DURANTE 48H. Número de amastigotas de L. (L.) amazonensis a cada 100 macrófagos WT e PPAR-gama-KO conforme condições descritas na Figura 53. **** P ≤ 0,0001 (ANOVA; WT não transfectado vs. WT siFABP4, WT não transfectado vs. WT siPPAR-gama).

O tempo de 96h nos mostra novamente uma queda, dessa vez mais discreta, no número de amastigotas intracelulares para os grupos envolvendo macrófagos PPAR-gama-KO, não havendo novamente diferença significativa entre nenhuma das cinco condições analisadas (Figura 55). Todavia, o número de parasitas para as células WT infectadas apresentou um crescimento para todas as condições, com

especial atenção para as condições siFABP4 e si PPAR-gama que possivelmente recuperaram seu perfil infectivo (Figura 55), não havendo mais diferença significativa entre os cinco grupos selvagens, condição esta observada em tempos anteriores (Figura 53 e 54).

FIGURA 55. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-GAMA, NA PRESENÇA OU NÃO DE LPS DURANTE 96H. Número de amastigotas de L. (L.) amazonensis a cada 100 macrófagos WT e PPAR-gama-KO conforme condições descritas na Figura 53.