INSTITUTO DE BIOLOGIA
AMANDA DE BARROS PIFFER
AVALIAÇÃO FUNCIONAL DA PROTEÍNA LIGANTE DE ÁCIDOS GRAXOS TIPO 4 (FABP4) E MODULAÇÃO VIA PPAR-GAMA NA INFECÇÃO POR LEISHMANIA
AMAZONENSIS
AVALIAÇÃO FUNCIONAL DA PROTEÍNA LIGANTE DE ÁCIDOS GRAXOS TIPO 4 (FABP4) E MODULAÇÃO VIA PPAR-GAMA NA INFECÇÃO POR LEISHMANIA
AMAZONENSIS
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Animal, na área de Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA AMANDA DE BARROS PIFFER E ORIENTADA PELO PROF. DR. DANILO CICCONE MIGUEL.
Orientador: DANILO CICCONE MIGUEL
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Danilo Ciccone Miguel Prof. Dr. Marcelo Bispo de Jesus Prof. Dr. Mauro Javier Cortez Veliz
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico esta dissertação de mestrado àquela que nunca mediu esforços para me ver alcançando meus sonhos mesmo que por vezes muito distantes e tendo que abrir mão dos próprios: minha mãe.
que já não sou mais a mesma, sou constantemente melhor graças a cada um de vocês. Obrigada por terem feito parte desse momento e por fazerem parte da minha vida, vocês foram essenciais para o desenvolvimento e concretização deste trabalho.
À minha mãe me faltarão todas as palavras imagináveis, por mais que eu escreva inúmeras linhas, elas nunca representarão tudo o que fez por mim até hoje. Pessoa e mulher a qual mais me orgulho e me inspiro por todas adversidades que já passou. Graças à sua força e insistência cheguei até a pós-graduação de uma das melhores universidades do país saindo de uma escola pública, a qual faltavam peças de extrema importância, como professores. Quando entrei na graduação, sua escolaridade era a 4ª série primária, agora, está terminando o ensino médio já pensando em seu estudo futuro, mesmo com tantas dificuldades, seja ela financeira ou apenas de estímulo para seguir os estudos, segue firme com notas excelentes e, o mais importante, adquirindo conhecimento. Sua força e sonhos é o que me move. Chegaremos longe juntas. Tentarei ser para você ao menos 1% do pilar que você representa para mim. Amo muito você, mãe!
Talvez não tenha alguém que pergunte tanto de mim quanto a minha avó. Sua alegria contagiante é inspiradora, sua sede por conhecimento de coisas básicas é fascinante e sua preocupação com meu bem-estar constante me conforta. Te amo, vô!
Ao meu pai e irmão agradeço a força que me deram ao longo dessa jornada, mesmo que tenha sido de uma forma não habitual a de vocês (fria hahaha). Seja pelo suporte financeiro em momentos de troca de bolsa ou pela ajuda braçal na mudança de república. Amo muito vocês! E à minha cunhada Nicolle que é bem mais fofa que os dois anteriores haha, obrigada maravilhosa, amo você!
Ao Danilo, meu orientador, agradeço por toda paciência, suporte e ensinamentos que me proporcionou ao longo desses anos. O meio acadêmico não é um ambiente valorizado e reconhecido, o que por vezes acaba por desestimular a pesquisa, obrigada por manter o estímulo na busca por conhecimento e respostas. Obrigada também por ter acreditado na minha capacidade em desenvolver este trabalho que sempre achei complexo haha. Obrigada!
A partir daqui todas as pessoas mencionadas foram agrupadas de acordo com o meio que mais me lembram elas e também estão em ordem alfabética pra ninguém subentender ordem de prioridade hahaha e, além disso, o tamanho do parágrafo não quer dizer nada, sem nóia, #pas.
Aos professores, do departamento ou não, que me ensinaram e ajudaram muito nessa caminhada, desde empréstimos de RA para buscar gelo, um tempinho para tirar dúvidas de artigo e de experimentos, emprestar equipamento e material para experimentos, oferecer um cafézinho, uma balinha e alguns bolinhos ou até mesmo só pela conversa jogada fora pra quebrar o clima, o que acabou nos proporcionando uma aproximação que gerou todo o carinho que tenho por vocês. Queria deixar meu muito obrigada por tudo que se disponibilizaram a fazer por mim e por tudo que fazem pela
Ainda no departamento, gostaria de agradecer todas as pessoas que por aqui passaram durante meu curto período entre funcionários e alunos. Rapha, o maior muso vegano do mundo, obrigada por todos ensinamentos com comidinhas, produtos de beleza sem sofrimento e por propagar o ódio juntos hahaha, melhor veterinário desse mundinho. Obrigada também à Cirene que é muito engraçada e lida com as adversidades de forma muito saudável e divertida, ao Camilo que também é outro engraçado, obrigada pelas autoclavadas, à Eliane, pessoal do laboratório de Entomologia, à Aline por ser uma fofíssima que transmite energias boas por onde passa, ao Gustavo que ensinou como cuidar tão bem de pets roedores, à Letícia por ser uma maravilhosa que motiva as pessoas quem quer elas sejam independente da adversidade que estejam passando, seja pessoalmente ou online consegue ser uma perfeita, à Marina Klemm rainha da terapia larval e defensora dos insetinhos, à Thamiris Smania deusa da dança do ventre e rainha incompreendida dos insetos, ao Vinícius parça que nos abandonou e nunca mais voltou, acho que já deu um ano e você pode voltar viu, migo?, ao pessoal do professor Carlos, à Day, à Maria Carolina carioca mais perfeita que esse mundo já viu, já é um crime de beleza por fora e por dentro já pegou perpétua, você é incrível e espero que saiba disso, se não sabi a agora sabe haha, não deixe que nada acabe com essa luz e energia maravilhosa que existe em você, ao Maurício, ao Edgard por ser tão engras e militudo, inclusive continue por favor com as postagens, ao pessoal da professora Fernanda, à Larrisa e à Nathália, ao pessoal do professor Adriano, à Bianca, à Tabatha por ser a risada mais engraçadinha de Bolhão Geraldo, ao Thales por ser um fofinho e por ter me dado o troféu do ano, à Vivi por ser uma fofa com uma energia linda, e também ao pessoal do próprio Lebil, ao Bruno, ao Danilo Guarnier, à Luana por ser uma princesa braba e fofa, à Nathalia e a Vivian por ser um dos anjos mais perfeitos e inteligentes que esse mundo já viu, convivi muito pouco com você mas já foi o suficiente pra você fazer muita falta com esse seu humor e presença mais que perfeitos, comece a sair mais com a gente pelo amor de Djesus.
Bruna Bighetto, você já me deu tanto suporte psicológico que super nos entendemos seja ele qual for o assunto. Seja durante o cursinho, a graduação, morando juntas, no esporte, em alguns grupos de amizades, na terra natal, nos relacionamentos, na pós-graduação ou no limbo. A situação atual de ambas não está no momento mais favorável que já passamos, mas sei que vamos sair disso muito em breve e tudo voltará a ter mais estabilidade, ao menos financeira hahaha. Você faz muita falta nos meus dias e espero muito que você alcance o que te faça realmente feliz, que você se encontre na profissão e que todo seu esforço aqui não tenho sido em vão. Torço muito por você e para que tenhamos mais contato novamente, quem sabe até morando junto de novo? Amo você!
Elizabeth, você é o melhor evento que se pode ter em uma festa, uma das leoninas mais pistola que existe, fiquei muito feliz por toda sua evolução e livramento de embuste durante esse período que passamos juntas, desejo só coisas boas pra você, mals pelo pirulito sujo haha. Saiba que estarei sempre aqui para os momentos em que você não conseguirá andar sozinha (risos). Continue sempre pertinho, porfa. Te amo!
haha). Você é uma pessoa fantástica, ilumina o caminho por onde passa e aquece o coração de todos que estão perto de você. Suas mensagens de apoio e carinho são fantásticas. Saiba que você é uma das melhores pessoas que já conheci nessa vida. Amo você!
Isabela Vito, talvez você seja a leonina mais pistola que existe. Fomos duas portas por não termos nos aproximado antes, já que éramos vizinhas em duas cidades diferentes, além de colegas de curso em anos próximos. Não lembro ao certo como essa aproximação foi acontecendo, mas sou muito feliz e grata por isso. Bendito momento em que você estava saindo do conds e passou pela quadra de basquete e te chamei pros esportes. Saiba que ver seu coraçãozinho feliz em fazer o que gosta me transborda de alegria. Por favor, continue até eu voltar hahah, logo tô de volta em vários com você de novo. E não se machuque mais. Te amo!
À minha amiga-irmã Karen não faço ideia nem de como começar, porque só de tentar pensar em algo, já vem um turbilhão de coisas que já passamos juntas, algumas dá vontade de chorar, mas a maioria já me faz começar a rir. Sem toda sua ajuda e apoio eu definitivamente não estaria onde estou e você sabe disso, se não sabia agora tá sabendo hahaha. Você sem dúvida foi um baita pilar em minha vida e espero que continue sendo pra sempre, assim como espero que eu também seja para você. O dizer de quem faz comida pra você quando você está incansáveis horas no laboratório? Alguém que te leva em inúmeros lugares pra você comer, beber, se divertir e paga tudo isso quando você está sem condições financeiras para tal? Alguém que te aguenta diariamente chorando pelos mais variados motivos possíveis e no fim disso tudo só te faz virar um corotinho pra passar tudo? Alguém que te obriga a ir no médico, no psicólogo, a comer, a dormir, a relaxar, tudo isso só pra te ver bem? Todo esse cuidado e atenção reflete na força que nossa amizade tem. É o que torna qualquer rolê agradabilíssimo ao seu lado, sendo dando cabeçada em pessoas desconhecidas, dando o famoso “rolê”, perdendo o joelho quando entra os 150, mergulhando na lama, dando/tomando banho de cerveja/blueberry ou voltando pra casa só a capa da gaita. Sou grata demais por você ter se deslocado um milhão de quilômetros, largado tudo em Bélem e ter vindo pra cá, não uma, mas duas vezes. Não vejo a hora das duas serem assalariadas ao mesmo tempo porque aí, meu parceiro, sorta nois. Fico feliz que nossa amizade tenha evoluído ao ponto de adotarmos a Yersinia pestis juntas e que às vezes você fale bolacha a biscoito, mas não tão feliz ao ponto de suas limitações com remédios devido ao Lúpus estejam similares às minhas alergias, assim como seu possível desenvolvimento à intolerância à lactose, sinto muito hahaha. “Mas preciso de você pro rolê valer”. Te amo!
Karina Guimarães, Jeová! Mais uma prova de que os esportes me trouxeram pessoas incríveis, fantásticas e apaixonantes iguais a você. Quanto perrengue já passamos juntas, hein? Uma quebrando o quadril, outra quebrando o dedo, as duas entortando o corpo todo em festinha hehe, protesto, açaí da bad, touchdown, fisio da salvação do joelho, ombro, dedo, você é a minha superbonder, e antes disso, minha amiga e a companhia perfeita pros rolê tudo. Amo você!
por toda mensagem respondida me ajudando (e olha que foram aproximadamente muitas), por toda ajuda e paciência ao vivo também, por me aguentar chorando, rindo e chorando de novo. Obrigada por todas as piadinhas que ajudaram a tornar um momento ruim em um bom. Espero muito algum di a poder retribuir parte do que fez por mim, desejo de coração que suas habilidades com maquiagem quadrupliquem e você vire referência, porque vamos te divulgar muito. Te desejo toda felicidade desse mundo, porque se tem alguém que merece paz e alegria, esse alguém é você. Amo você!
Marília Valentini, Varília Malentini, tiq tiq tiq. O quE DizEr DesSa PeSSoA qUe suPeR ConHeÇo e coNsiDerO pAKas? Você é uma das pestinhas mais engraçadas que já parasitaram esse mundo. Canceriana mais fria e chorona que existe, você deveria sair mais com suas amigas LeisHmâníAs e menos com as engenharias feat LAU®, fica aí a crítica, de resto você é perfeita, número 01 em tudo e please Nauta come to Barão Geraldo. Amo você!
Ao Ygor Montebeautiful mal sei por onde começar (porque sou gado) ou o que dizer pra expressar o quão bem você tem me feito. É incrível saber que você tava sempre ali, mas foram necessários quatro anos pra aproximação acontecer e não poderia ter acontecido numa melhor hora. A força e motivação que você passa é incrível e inspiradora. A sua energia renova qualquer final de pós-graduação, a sua presença só transmite coisas boas. Obrigada demais por me fazer muito feliz, por me fazer rir muito de qualquer coisa, por ter tanto zelo e cuidado comigo. Espero estar causando a mesma sensação de paz e felicidade que você me passa e espero ser capaz de transmitir todo o suporte quando estiver no caos e poder te ajudar como você me ajuda. Te desejo só coisas boas e incríveis, tipo eu hahaha. Amo você!
À galera da bio que são aproximadamente um milhão de pessoas. Começando pelo pessoal da minha turma, 012n: Aline Parolin, uma fofa desde sempre e dona de uma inteligência sem igual, à Bruna Guissi, pivô linda monstra do basquete e vizinha de quarto na Asilo, quem diria que após cinquenta anos de graduação estaríamos morando na mesma rep, hein? Uma palhaça cozinheira perfeita, ao Caique Malospírito, Encosto nerdíssimo inteligentíssimo que já compartilhou mil aventuras de baixa renda comigo, após mil anos de graduação também estamos morando na mesma rep, por favor não leve a Minerva embora, e o que você faz com a sua bolsa que já acabou, hein? hahaha, ao Diego Graciano, BBB, famosíssimo Bagaço, melhor botânico, por ser um ser iluminado e possuidor de um humor sem igual, obrigada pela melhor oportunidade de aproximação que gerou na minha vida, à Ellen por toda simpatia, inteligência e pistolagem compartilhada, à Eliane por toda força e garra e passa pra nós, à Isabela, por ter despertado o monstro indagador e treteiro que existe em mim, por ser lindíssima e perfeita nos argumentos pra qualquer assunto que exista, à Jéssica Trampiko por organizar festas maravilhosas e pela pistolagem sem freio, à Karina Rodrigues, por ter sido um pilar durante muito tempo nessa caminhada, espero que algum dia voltemos nossa aproximação para continuarmos uma ajudando a outra como sempre foi, sua força é inspiradora, à Lívia por toda ajuda acadêmica e suporte de carinho de gatinhos. Ao pessoal que não é da turma, mas é da bio: à
companhia é perfeita assim como você e mais muitas gentes porque é gente demais haha, mas vocês sabem que são incríveis.
Ao Conds só tenho agradecimentos por quebrarem o dia de uma forma tão saudável e alegre. A energia que vocês transmitem mesmo morrendo a cada exercício é renovadora. Obrigada a todos que já me deram esse up diário: Adriana, Agda, André Giles, Clóvis Migué, Dieguinho, Eliseu, Emanuel, Fábio, Felipe, Fer, Piccolo, Gabi, Karine, Héri, Iná, Júlia, Laís, Lu, Pedro, Raíssa pipoca, Rafa Mayer, Robertão, Rodrigo, Treva, Túlião e Vanessa. Vocês são incríveis, quero voltar logo pra vocês!
Às meninas do basquete que são umas fofa perfeita engraçadas: à Arimi joga tudo e muito bem, à Beatrice mamain da Bagacinha, Beatriz Bião engraçada de uma forma descomunal, melhor comentadora de jogo de vôlei, à Camila jogadora monstra, à Catharina Musa que como o próprio nome já diz é uma baita musa, à Gabi velociraptor, as pernas mais velozes de Barão Geraldo, à Gabi Amanda, à Helena uma fofa monstra do basquete, à Júlia Camili outro nenê destruidor do basquete, à Kauany, à Luana linda, volta logo por favor, à Nathália Streher MVP da NBA com tattoos belíssimas pra combinar com a própria beleza natural, ao Léo por ser um fofo, acreditar, ensinar e motivar as pessoas de uma forma tão saudável, ao Prato, à Raquel que bota o Shaq no chinelo, à Tanã maravilhosa dona da NBA e do Cnpem, à Tati e à Vanessa esmagadora do basquete.
Aos amores da minha vida: as meninas mais lindas do futsal. Obrigada demais por terem sido um dos maiores pilares que já tive em minha vida! Me faltam palavras pra dizer o quão incrível vocês são. Alecsia, você é uma pessoa sensacional, uma excelente amiga e jogadora nem se fala, tem uma força muito grande perante às adversidades que essa nova vida tem lhe proporcionado, tudo dará certo no final. Amanda Oliveira, você é uma fofa que faz uma baita falta nos treinos, se tivesse um joelho novo te dava só pra você voltar. Aninha, você foi uma treinadora e amiga sensacional, sinto muitas saudades e se tivesse condições pagaria pra você e a Pipe morar aqui pertinho da gente de novo. Beatriz Schincariol, sempre te achei um neném fofo, nesses últimos tempos você foi de extrema importância em decisões importantes que tive de tomar e queria muito que você soubesse que você foi essencial pra isso, criei um carinho enorme por você. Beatriz Cristina, a melhor pessoa esfaqueada que conheço, cê é muito engraçada e incrível, jogadora nem precisa dizer, seu apelido já diz isso. Debys ou Débora Fernanda Shuévols, você é um neném, o fumante da Indonésia, goleira perfeita, pistolinha maravilhosa, amiga incrível, braba fofinha e futura amiga de turma da FEF. Estevam, você foi um auxiliar muito presente e amigo, se extrema importância pra nossa evolução tanto no esporte quanto na amizade. Evandro, você foi um técnico fantástico e um amigo incrível, que se importa com nosso lado pessoal e nos ajuda mesmo que com palavras, a enfrentar alguns problemas internos que interferem em nosso desenvolvimento pessoal. Giovanna, estamos juntas nessa há anos, mas recentemente senti uma maior proximidade e amizade, o que tornou tudo muito mais saudável e gostoso, você é sensacional e muito esforçada tendo em vista que enfrentou pra chegar onde chegou. Isabelle, você é a pessoa mais rápida da Terra ao mesmo tempo que é a coisa mais fofinha do mundo.
fofa maravilhosa. Maria Rita, sua tatuada frita, você é muito engraçada, incrível e maravilhosa, continue fritando e sortando os chapéu nas amiga. Maria, suas risadas enquanto você joga são muito boas, só podia fazer mais pão de queijo original pra gente, nova mestre química do grupo, muito feliz que você vai voltar pra gente. Mariana, você é uma metralhadora maravilhosa, muito fofa e divertida, só deveria voltar de vez pra nois. Marília Hanita, outra tatuada linda, sua presença incrível é muito boa e importante pra todas nós. Nara, foi muito bom ser treinada por alguém tão incrível, além de ter esse sotaque maravilhoso. Naylil, . Raquel, mal foi embora e já tá fazendo uma baita falta, você é a coisinha mais engraçada desse mundo, além de ser uma metralhadora igual a Mari. Renata, quem é Renata? Capitu, sua mulher linda, forte e incrível, meu carinho por você é muito grande, te admiro muito e torço pra que você tenha sua recompensa de todos esses tristes empecilhos. Tina, a velociraptor canhota, o Sul não te merece, você deveria voltar pro aconchego do nosso amor, saudades. Thailine, pagodeira mais fofa, linda e engraçada do mundo, volta pra gente também. Tupi, princesa amazona que joga tudo e ainda caçava rolinhas pra se alimentar em sua infância, você é sem palavras. À todas vocês: continuem sendo esses anjos na vida de quem cruza o caminho de vocês, a presença de vocês gera muita paz, obrigada por existirem e por proporcionarem uma amizade tão linda e incrível. Amo vocês. Tchukutchá, tchukutchô, tá, tá!
Às meninas flag por serem umas coisa linda demais: à Bianca rainha desse mundo todo e boa em absolutamente tudo que ela faz, inclusive em ser uma amiga fantástica e linda de cegar, à Cássia lindíssima e engraçadíssima que vai em tudo quanto é rolê aleatório que eu tô, à Jéssica Rego, à Lívia por ser um neném tão lindo e fofo, aquariana menos fria que existe, à Marcela linda fã n1 do Raça Negra, à Sabris por ser uma fofa e à Thuanny por ser uma das pessoas mais fofas e engraçadas desse mundo.
À galera do atletismo que abandonei mais um semestre por conta da pós hahaha: à Mayara maior maratonista que esse universo já viu, sua evolução e determinação são inspiradoras, ao Chicão por insistir tanto e ensinar tão bem coisas básicas e essenciais pra sobrevivência de um atleta haha e à toda galera das pirâmide dos rolê.
À dança do ventre por ter mostrado que sou apaixonada por mais uma coisa haha e que me faz muito bem, ao trampolim por ser tão desafiador e divertido ao mesmo tempo que deixa nois fortão e esperto haha, ao Douglas, ao João Baptistotti rei da FEF, à Nathi Guimarães.
Ao Museu de Ciências por tantos anos de aprendizado, pelas mil amizades feitas e pelas quebras na rotina que proporcionaram esporadicamente. À Carla historiadora fofíssima, à Gabi lindíssima, à Georgia maior rainha dos museus que existe, à Isa, à Vanessa, ao Vitor patrimônio tombado do museu e todos os outros porque é gente demais hahaha.
Às coisinhas mais perfeitas desse mundo que são os animais por me despertarem tanto amor e admiração, me dando forças nos dias mais difíceis e tornando os bons em melhores ainda.
Aos esportes por ser a melhor terapia que encontrei nessa jornada, sem o suporte que ele me proporcionou, nada disso teria valido a pena.
Ao meu dedo quebrado por ter me proporcionado habilidades ambidestras que possibilitaram a finalização deste mestrado.
E, por fim, mas não menos importante, agradeço a você que está lendo este trabalho e acreditando na ciência e que com certeza, faz parte dos que estão lutando bravamente pela educação em nosso país neste momento conturbado. Espero que em minha tese de doutorado, o cenário político e consequentemente educacional esteja mudado para melhor e que a prioridade do Estado seja a educação.
em forma de bolsa e reserva técnica para que eu pudesse adquirir reagentes e materiais necessários para a continuidade deste projeto e a manutenção do laboratório no qual estava inserida. Sem esse apoio, este estudo seria inviável. É importante ressaltar que as opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade da autora e não necessariamente refletem a visão da FAPESP.
“Quem faz ciência deve ser curioso, duvidar, estudar, descobrir. Ciência produz conhecimento... o conhecimento destrói mitos.”
fagocítico mononuclear dividindo-se por fissão binária em vacúolos parasitóforos. Atualmente, pouco se compreende sobre os mecanismos moleculares que controlam o metabolismo de Leishmania nestas organelas, tanto sob o ponto de vista de biossíntese de macromoléculas como do controle metabólico da célula hospedeira pelo parasito. Estudos preliminares de análise transcriptômica mostram que há aumento dos níveis de transcritos de FABP4 (fatty acid-binding protein 4) em macrófagos infectados com L. (L.) amazonensis por 48h. Por serem pequenas proteínas intracelulares as FABPs acessam o núcleo celular em determinadas condições fisiológicas atuando como transportadoras de ácidos graxos ligantes de fatores de transcrição, como os receptores ativados por proliferador de peroxissomo (por ex. PPAR-gama), sendo as FABPs do tipo 4 responsáveis pelo transporte de ácidos graxos para diferentes compartimentos celulares tanto em macrófagos como adipócitos. Com base nas propriedades biológicas descritas para a FABP4, além do fato de formas amastigotas dependerem do metabolismo de ácidos graxos para biossíntese de aminoácidos, especula-se que a FABP4 macrofágica possa desempenhar função importante na homeostase de lipídios na célula infectada durante o processo de infecção por Leishmania. Assim, pretendeu-se investigar neste projeto o papel da FABP4 a partir de ensaios de infecção in vitro em macrófagos na presença de inibidor específico para FABP4 bem como com reduzida expressão do gene da FABP4, a partir de interferência por RNA. Somado a isso, investigou-se a participação de PPAR-gama, que sabidamente interage com FABP4, ao longo de infecções por L. (L.) amazonensis in vitro. Com diferentes técnicas foi possível validar a influência de ambas as proteínas no estabelecimento e sobrevivência destes parasitos. Estudos in vivo foram conduzidos para avaliação do papel do PPAR-gama na evolução da lesão causada por L. (L.) amazonensis em camundongos C57BL/6 nocauteados para esta proteína, sugerindo que com inóculo reduzido de parasitos há retardo no aumento de lesões entre a 6a. e 8a. semana na ausência de PPAR-gama.
Resumidamente, embora não tenha sido possível elucidar completamente a relação entre tais componentes celulares durante este evento, confirmamos que alterações nesse equilíbrio interferem na capacidade infectiva de L. (L.) amazonensis. Com isso,
phagocytic system dividing by binary fission within parasitophorous vacuoles. Currently, little is understood about the molecular mechanisms that control
Leishmania metabolism in these organelles, both from macromolecule biosynthesis
and the host cell metabolic control by the parasite aspects. Preliminary transcriptomic analysis studies showed an increase in FABP4 (fatty acid binding protein 4) transcripts in macrophages infected with L. (L.) amazonensis for 48h. Because they are small intracellular proteins, FABPs access the cell nucleus under certain physiological conditions carrying fatty acids to transcription factors, such as peroxisome proliferator-activated receptors (e.g. PPAR-gamma). FABP type 4 is responsible for the transport of fatty acids to different cell compartments in both macrophages and adipocytes. Based on the biological properties described for FABP4, in addition to the fact that amastigote forms depend on fatty acid metabolism for amino acid biosynthesis, it is speculated that macrophagic FABP4 may play an important role in lipid homeostasis in the infected cell during the infection process by
Leishmania. Thus, it was intended to investigate in this project the role of FABP4 in in vitro infection assays using macrophages in the presence of FABP4-specific inhibitor
as well as with reduced expression of the FABP4 gene, via RNA interference. In addition, the participation of PPAR-gamma, which is known to interact with FABP4, was investigated L. (L.) amazonensis infections in vitro. With different techniques it was possible to validate the influence of both proteins on the establishment and survival of these parasites. In vivo studies were conducted to evaluate the role of PPAR-gamma in the lesion evolution caused by L. (L.) amazonensis in C57BL/6 mice knocked out for this protein, suggesting that with reduced parasite inoculation, there is a delay during lesion progression between the 6th and 8th week in the absence of
PPAR-gamma. Briefly, although it was not possible to fully elucidate the relationship between such cellular components during this event, we confirm that changes in this balance interferes with the infectious capacity of L. (L.) amazonensis. Thus, both FABP4 and PPAR-gamma are relatively important during the in vitro infection process.
FIGURA 1. FORMAS CLÍNICAS DA LEISHMANIOSE ... 32
FIGURA 2. OCORRÊNCIA DE LEISHMANIOSE CUTÂNEA E MUCOSA EM TERRITÓRIO NACIONAL NO PERÍODO DE 2015 A 2017 ... 34
FIGURA 3. OCORRÊNCIA DE CASOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL DE REGIÕES NO ESTADO DE SÃO PAULO ... 35
FIGURA 4. MORFOLOGIA DE PROMASTIGOTA DE LEISHMANIA ... 36
FIGURA 5. DIVISÃO BINÁRIA DA FORMA PROMASTIGOTA ... 37
FIGURA 6. CICLO DE VIDA DE LEISHMANIA NO INSETO VETOR ... 38
FIGURA 7. MORFOLOGIA DE AMASTIGOTA DE LEISHMANIA ... 39
FIGURA 8. ILUSTRAÇÃO DO CICLO BIOLÓGICO DO PARASITO DE LEISHMANIA NO TECIDO DE UM HOSPEDEIRO MAMÍFERO ... 40
FIGURA 9. DIFERENTES CÉLULAS HOSPEDEIRAS QUE LEISHMANIA PODE PARASITAR... 41
FIGURA 10. CICLO DE VIDA COMPLETO DE LEISHMANIA ... 42
FIGURA 11. VIAS DE OBTENÇÃO DE NUTRIENTES NO VACÚOLO PARASITÓFORO ... 44
FIGURA 12. ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA DA FABP4 ... 45
FIGURA 13. FUNÇÕES DA FABP4 NO MACRÓFAGO ... 47
FIGURA 14. ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA DO PPAR-gama ... 48
FIGURA 15. COORDENAÇÃO DE FABP4 NO TRÁFEGO DE COLESTEROL E NAS VIAS INFLAMATÓRIAS EM MACRÓFAGOS ... 49
FIGURA 16. RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS FRENTE À INFECÇÃO POR LEISHMANIA ... 52
FIGURA 17. CULTURAS DE PROMASTIGOTA E AMASTIGOTA AXÊNICO ... 57
FIGURA 18. GENOTIPAGEM DE CAMUNDONGOS ... 60
FIGURA 19. EXTRAÇÃO DE MEDULA ÓSSEA ... 61
FIGURA 20. CONDIÇÕES DAS INFECÇÕES IN VITRO ... 62
FIGURA 21. ANÁLISE DAS INFECÇÕES ... 62
FIGURA 22. CONTAGEM DE AMASTIGOTAS POR MACRÓFAGOS... 63
FIGURA 23. ESQUEMA UTILIZADO PARA AVALIAÇÃO DE MACRÓFAGOS INFECTADOS OU NÃO POR LEISHMANIA ... 64
FIGURA 26. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA ... 68 FIGURA 27. VISÃO GERAL DO FENÓTIPO DE CAMUNDONGOS C57BL/6 E BALB/C PPAR-GAMA-KO... 71 FIGURA 28. BANDAS PADRÃO PARA A GENOTIPAGEM DO SISTEMA CRE-LOX ... 72 FIGURA 29. GEL DE AGAROSE COM GENOTIPAGEM DOS QUATRO GRUPOS POSSÍVEIS (I-IV) ... 73 FIGURA 30. FITA DE DNA COM SÍTIO LOX ... 74 FIGURA 31. FORMAS PROMASTIGOTAS ADERIDAS A MACRÓFAGOS EM CULTURA ... 75 FIGURA 32. VACÚOLOS PARASITÓFOROS EM MACRÓFAGOS WT ... 75 FIGURA 33. CONTAGEM DE INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO ... 76 FIGURA 34. AVALIAÇÃO DAS ÁREAS DE VACÚOLOS PARASITÓFOROS DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO INFECTADOS COM LEISHMANIA ... 78 FIGURA 35. AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE AMASTIGOTAS POR VACÚOLO PARASITÓFORO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO ... 79 FIGURA 36. AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE VACÚOLOS PARASITÓFOROS POR MACRÓFAGOS ... 80 FIGURA 37. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS DIFERENCIADOS DE PRECURSORES DE MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS C57BL/6 PPAR-GAMA-KO COM L. (L.) amazonensis EM DIFERENTES MOIs ... 81 FIGURA 38. PARÂMETROS BIOLÓGICOS DA INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS PPAR-GAMA-KO COM LEISHMANIA NOS TEMPOS DE 24H E 72H ... 83 FIGURA 39. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO COM
LEISHMANIA (L.) AMAZONENSIS NOS TEMPOS 1H, 24H, 48H, 72H E 96H ... 85
FIGURA 40. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO COM
LEISHMANIA (V.) BRAZILIENSIS NOS TEMPOS 1H, 24H, 48H, 72H E 96H ... 86
FIGURA 41. IMAGEM DE MACRÓFAGOS INFECTADOS COM LEISHMANIA (L.)
AMAZONENSIS E LEISHMANIA (V.) BRAZILIENSIS POR 96H ... 87
FIGURA 43. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS PPAR-GAMA-KO COM E SEM INIBIDOR DE FABP4 ... 89 FIGURA 44. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO COM E SEM INIBIDOR DE FABP4 ... 90 FIGURA 45. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO COM E SEM INIBIDOR DE FABP4 E ROSIGLITAZONA ... 91 FIGURA 46. AVALIAÇÃO DAS ÁREAS DE VACÚOLOS PARASITÓFOROS DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO INFECTADOS COM LEISHMANIA E INCUBADOS OU NÃO COM INIBIDOR DE FABP4 E ROSIGLITAZONA ... 93 FIGURA 47. AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE AMASTIGOTAS POR VACÚOLO PARASITÓFORO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO INCUBADOS OU NÃO COM INIBIDOR DE FABP4 E ROSIGLITAZONA ... 94 FIGURA 48. AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE VACÚOLOS PARASITÓFOROS POR MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO INFECTADOS COM LEISHMANIA E INCUBADOS OU NÃO COM INIBIDOR DE FABP4 E ROSIGLITAZONA ... 95 FIGURA 49. MACRÓFAGOS TRANSFECTADOS COM GFP ... 96 FIGURA 50. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-GAMA DURANTE 1H E 48H ... 97 FIGURA 51. MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-gama DURANTE 1H E 48H INFECTADOS COM
LEISHMANIA ... 98
FIGURA 52. MACRÓFAGOS TRANSFECTADOS COM GFP ... 99 FIGURA 53. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-gama, NA PRESENÇA OU NÃO DE LPS DURANTE 1H... 100 FIGURA 54. INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-GAMA, NA PRESENÇA OU NÃO DE LPS DURANTE 48H ... 101
PRESENÇA OU NÃO DE LPS DURANTE 96H ... 102 FIGURA 56. NÍVEIS DE PROTEÍNA FABP4 E PPAR-GAMA DURANTE INFECÇÃO POR LEISHMANIA NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE INIBIDOR DE FABP4 E ROSIGLITAZONA ... 103 FIGURA 57. LOCAL DE LIGAÇÃO DO INIBIDOR BMS309403 NA FABP4 ... 105 FIGURA 58. NÍVEIS DE PROTEÍNA FABP4 E PPAR-gama DURANTE INFECÇÃO POR AMASTIGOTA AXÊNICO DE LEISHMANIA EM MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-GAMA, NA PRESENÇA OU NÃO DE LPS DURANTE 48H ... 107 FIGURA 59. NÍVEIS DE PROTEÍNA FABP4 E PPAR-GAMA DURANTE INFECÇÃO POR PROMASTIGOTA DE LEISHMANIA EM MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-gama, NA PRESENÇA OU NÃO DE LPS DURANTE 1H E 48H ... 108 FIGURA 60. CONCENTRAÇÃO DE NITRITO DURANTE INFECÇÃO POR
LEISHMANIA NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE INIBIDOR DE FABP4,
ROSIGLITAZONA E LPS ... 111 FIGURA 61. CONCENTRAÇÃO DE NITRITO DURANTE INFECÇÃO POR
LEISHMANIA EM MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU
NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-GAMA, NA PRESENÇA OU NÃO DE LPS DURANTE 1H ... 112 FIGURA 62. CONCENTRAÇÃO DE NITRITO DURANTE INFECÇÃO POR
LEISHMANIA EM MACRÓFAGOS WT E PPAR-GAMA-KO TRANSFECTADOS OU
NÃO COM GFP, siFABP4 E siPPAR-GAMA, NA PRESENÇA OU NÃO DE LPS DURANTE 48H E 96H ... 113 FIGURA 63. INFECÇÃO IN VIVO EM ANIMAIS WT E PPAR-GAMA-KO ... 115 FIGURA 64. IMAGENS DE LESÕES DE INFECÇÕES POR LEISHMANIA (L.)
AMAZONENSIS IN VIVO ... 116
FIGURA 65. IMPRINTING DE TECIDO INFECTADO POR LEISHMANIA ... 117 FIGURA 66. INFECÇÃO DE ANIMAIS WT E PPAR-GAMA-KO COM L. (L.)
ABCA1 transportador 1 de cassete de ligação de adenosina trifosfato A-FABP proteína ligante de ácido graxo de adipócitos
AP1 proteína ativadora-1 aP2 proteína adipócita 2
CD36 grupamento de diferenciação 36 cm centímetro
cm² centímetro quadrado DAPI 4',6'-diamino-2-fenil-indol DMSO dimetilsulfóxido
DNA ácido desoxirribonucléico dNTP desoxinucleotídeos trifosfato EDTA ácido etilenodiamino tetracético EP endossomo precoce
ER endossomo de reciclagem ET endossomo tardio
FABP proteína ligante de ácido graxo FABP3 proteína ligante de ácido graxo tipo 3 FABP4 proteína ligante de ácido graxo tipo 4 FABP5 proteína ligante de ácido graxo tipo 5 FABP7 proteína ligante de ácido graxo tipo 7 FABP9 proteína ligante de ácido graxo tipo 9 g força g (gravidade)
GFP proteína verde fluorescente
h hora
HEPES ácido sulfônico etano hidroxietilpiperazina
ICLTc transmissão índice composto de leishmaniose no triênio iFABP4 inibidor de FABP4
IKK complexo de proteína quinase IFN-gama interferon-gama
iNOS óxido nítrico-sintase induzida JNK c-jun N-terminal quinase kDa quilodalton
kDNA DNA mitocondrial presente no cinetoplasto kHz quilohertz
kV quilovolt
L. Leishmania
LXR-alfa receptor X do fígado alfa MOI multiplicidade de infecção MØ macrófago mA miliampère mg miligrama ml mililitro mM milimolar mm milímetro NaCl cloreto de sódio NaF fluoreto de sódio
NF-k-beta factor nuclear kappa beta NO óxido nítrico
OMS/WHO Organização Mundial da Saúde/World Health Organization OPAS Organização Pan-Americana da Saúde
PBS solução salina em tampão fosfato
PBST solução salina em tampão fosfato + tween 20 PCR reação em cadeia da polimerase
pH potencial hidrogeniônico PMSF fenilmetanosulfonilfluoruro
PPAR-alfa receptor ativado por proliferador de peroxissomo alfa PPAR-beta/sigma receptor ativado por proliferador de peroxissomo beta/sigma PPARγ/ PPARg/
PPAR-gama
receptor ativado por proliferador de peroxissomo gama RE retículo endoplasmático
RNI intermediários reativos de nitrogênio RXR receptores retinóide X
SDS dodecil sulfato de sódio
SDS- PAGE eletroforese em gel de acrilamida contendo SDS SFB soro fetal bovino
siFABP4 ácido ribonucleico interferente pequeno FABP4 siPPAR-gama ácido ribonucleico interferente pequeno PPAR-gama siRNA ácido ribonucleico interferente pequeno
TGF-beta fator de crescimento transformador beta
TRIS-HCl hidroximetilaminometano contendo ácido clorídrico
V. Viannia V volts VP vacúolo parasitóforo W watts WT selvagem μg micrograma μL microlitro μm micromêtro μM micromolar
β beta γ gama
°C graus Celsius % porcentagem ≤ menor ou igual
1. INTRODUÇÃO ... 29 1.1. A DOENÇA ... 30 1.2. DISTRIBUIÇÃO ... 33 1.3. O PARASITO ... 35 1.4. CÉLULAS HOSPEDEIRAS ... 40 1.5. FABPs E PPAR-GAMA ... 45 1.6. RESPOSTA IMUNOLÓGICA ... 50 2. OBJETIVOS ... 54 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 56 3.1. CULTURA DE PARASITAS ... 57 3.2. OBTENÇÃO DE ANIMAIS E GENOTIPAGEM ... 57 3.3. OBTENÇÃO DE MACRÓFAGOS ... 60 3.3.1. INFECÇÕES IN VITRO ... 61 3.3.1.1. ACRÉSCIMO DE MODULADORES DE FABP4 E PPAR-GAMA .... 64 3.3.2. WESTERN BLOT ... 65 3.3.3. RNA DE INTERFERÊNCIA ... 66 3.3.4. QUANTIFICAÇÃO DE NITRITO ... 67 3.3.5. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA ... 68 3.4. INFECÇÃO IN VIVO ... 68 3.5. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 69 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 70 4.1. GENOTIPAGEM DE ANIMAIS ... 71 4.2. INFECÇÕES IN VITRO ... 74 4.2.1. ENSAIOS COM MODULADORES DE FABP4 E PPAR-GAMA ... 88 4.2.2. RNA DE INTERFERÊNCIA ... 95
4.3. INFECÇÃO IN VIVO ... 114 5. CONCLUSÃO ... 120 6. REFERÊNCIAS ... 122 7. ANEXOS ... 132
Os tripanossomatídeos pertencentes ao gênero Leishmania compõem um importante grupo de mais de 20 espécies parasitas que podem causar amplo espectro de sinais e sintomas caracterizando a leishmaniose. Os mesmos atingem humanos e outros mamíferos a partir da hematofagia de fêmeas de insetos flebotomíneos (gênero Phlebotomus spp. no Velho Mundo e Lutzomyia spp. no Novo Mundo) (Murray et al., 2005; McConville & Naderer, 2011; Alexander et al., 1999). O gênero Leishmania pode ser agrupado em diferentes subgêneros e complexos, sendo o subgênero Leishmania (Ross, 1903) e complexo mexicana utilizado para classificar a espécie Leishmania (Leishmania) amazonensis (Lainson & Shaw, 1972), enquanto a espécie Leishmania (Viannia) braziliensis (Vianna, 1911) é agrupada no subgênero Viannia (Lainson & Shaw 1987) e complexo braziliensis (Akhoundi et al., 2016). L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis são espécies causadoras da leishmaniose cutânea no Novo Mundo, sendo a primeira delas o principal agente etiológico para esta forma clínica no Brasil. Os primeiros relatos de leishmaniose no país são referenciados em documento datado de 1827 (Camargo & Barcinski, 2003). Já em 1855, Cerqueira observou lesões dérmicas identificadas como Botão de Biskra (revisado por Basano & Camargo, 2004).
1.1. A DOENÇA
A manifestação clínica da leishmaniose é regulada por fatores como o estado imunológico do hospedeiro e as espécies do agente etiológico, as quais apresentarão diferenças de virulência/infecciosidade (Weigle & Saravia, 1996; Antoine et al., 2004; Murray et al., 2005). A doença pode ser caracterizada classicamente como leishmaniose cutânea (ou tegumentar) e visceral (ou calazar) (Soares-Bezerra et al., 2004), podendo induzir, respectivamente, lesões cutâneas localizada ou disseminada com a formação de úlceras, nódulos, lesões mucocutâneas com extensa destruição de membranas mucosas ou difusas, além ainda de infecções viscerais (Murray et al., 2005), podendo esta ser letal a menos que tratada (Sharma et al., 2008; Hefnawy et al., 2018) (Figura 01).
A classificação clínica da leishmaniose varia de acordo com os critérios considerados pelo autor a partir da fisiopatogenia. Apresentando lesão indolor e base eritematosa, a leishmaniose cutânea costuma manifestar-se em áreas expostas da pele com bordas bem delimitadas e formato ovalado ou arredondado e, em casos de
infecção secundária bacteriana, pode ocorrer produção de exsudato seropurulento com dor local (Ministério da Saúde, 2017).
Diferentes formas clínicas podem resultar da leishmaniose cutânea no Brasil: a forma cutânea localizada tem tendência à cura espontânea e traz o acometimento primário da pele, apresentando uma única lesão ou múltiplas (Figura 01 i); a forma mucosa ou mucocutânea leva à lesões destrutivas nas mucosas das vias aéreas superiores podendo ocorrer obstrução nasal, disfagia, epistaxe, odinofagia e dispneia, ocorrendo em 3 a 5% dos casos da leishmaniose cutânea com L. (V.)
braziliensis, seguida por L. (V.) guyanensis sendo as espécies causadoras (Figura 01
ii). Em aproximadamente 2% dos casos dos casos totais de leishmaniose cutânea, a forma cutânea disseminada pode ser causada pelas espécies L. (V.) braziliensis e L.
(L.) amazonensis podendo alcançar centenas de lesões papulares de aparência
acneiforme ao longo de todo segmento corporal, além disso, em 30% destes casos há manifestações sistêmicas como mal-estar geral, febre e emagrecimento (Figura 01 iii). Causada pela espécie L. (L.) amazonensis, a forma cutânea difusa cobre grandes extensões cutâneas e ocorre em pacientes com deficiência específica na resposta imune celular a antígenos de Leishmania (Figura 01 iv). A forma visceral caracteriza-se por acometimento de órgãos como baço e fígado, além de comprometimento de medula óssea (Figura 01 v) (Ministério da Saúde, 2017). No início, a doença pode se apresentar na forma aguda ou insidiosa com um período de incubação podendo variar entre 2 semanas até 8 meses (Burza et al., 2018). No Brasil, L. (L.) infantum é a espécie responsável pela doença, apesar de existirem relatos de visceralização causada por L. (L.) amazonensis (Ministério da Saúde, 2017).
FIGURA 1. FORMAS CLÍNICAS DA LEISHMANIOSE. i. Forma cutânea localizada com lesão ulcerada franca com bordas elevadas; ii. Forma mucosa com lesões úlcero-crostosa e grande edema inflamatório no lábio e nariz; iii. Forma cutânea disseminada com lesões ulceradas e bordas elevadas; iv. Forma cutânea difusa com múltiplas nodulações não ulceradas; v. Forma visceral com inchaço de baço e fígado com perda de peso.
(i; ii; iii) Adaptado de: Manual de vigilância da leishmaniose tegumentar. Ministério da Saúde, 2017. (iv) Adaptado de: Flores, M. A. B. Parasitología médica. 2014.
(v) Adaptado de: www.who.int/leishmaniasis/visceral_leishmaniasis/en/
Em sua maioria, os tratamentos quimioterápicos da leishmaniose são custosos e requerem a internação de pacientes em muitos casos. Além disso, há número limitado de medicamentos disponíveis e estes apresentam alto grau de toxicidade. Para fármacos de primeira escolha temos os antimoniais pentavalentes Glucantime e Pentostam (Bastos et al., 2016). Ressalta-se o fato preocupante de parasitos resistentes aos antimoniais pentavalentes terem sido isolados de pacientes humanos na Índia (Croft et al., 2006). Essa medicação atua interferindo na bioenergética das formas amastigotas, sendo indicada para todas as formas de leishmaniose cutânea, entretanto, repetidas doses deste medicamento levam à retenção deste fármaco no fígado e baço, tornando-o tóxico (Ministério da Saúde, 2017). Os fármacos de
segunda escolha são anfotericina B, pentamidinas, miltefosina e paromomicina (Bastos et al., 2016). A anfotericina B é um antifúngico que atua com toxicidade seletiva na membrana plasmática de Leishmania interagindo especificamente com o ergosterol e levando a formação de poros. Já é relatado que o tratamento com este fármaco pode resultar em diversos efeitos colaterais, incluindo nefrotoxicidade (Filippin & Souza, 2006). As pentamidinas parecem interferir no potencial de membrana mitocondrial e associação ao DNA desta organela, com isso a replicação e transcrição são prejudicadas (Bastos et al., 2016; Ministério da Saúde, 2017, Alcântara et al., 2018). Quanto à miltefosina, acredita-se que esta altere as vias de sinalização e cause a inibição da síntese de componentes essenciais à Leishmania. Esse medicamento apresenta teratogenicidade e toxicidade renal (Guerin et al., 2002). Por fim, a paromomicina apresenta mecanismo de ação que interfere no crescimento do parasito e tem como recorrentes efeitos colaterais a disfunção hepática, a ototoxicidade, assim como ação nefrotóxica (de Menezes et al., 2015).
1.2. DISTRIBUIÇÃO
De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que anualmente ocorram de 700 mil a 1 milhão de novos casos e cerca de 26 mil a 65 mil mortes (WHO, 2019). A doença é endêmica em 97 países, segundo dados de 2017 (WHO, 2017). Neste mesmo ano, 94% dos novos casos notificados à OMS ocorreram em sete países, entre eles, o Brasil (WHO, 2017). Nas Américas, a leishmaniose está presente em 18 países, com a ocorrência de 940.396 novos casos de leishmaniose cutânea e mucosa no período de 2001 a 2017, sendo a forma clínica cutânea a mais comum (WHO, 2017; OPAS, 2017). Do total de casos de 2017, 72,6% foram reportados no Brasil, que correspondem a 17.526 novos casos, sendo 16.708 referentes à forma cutânea (OPAS, 2017). Dados de 2017, mostra que a população presente em área de transmissão atinge 47,6% com 17,7 casos a cada 100 mil habitantes (OPAS, 2017) (Figura 02).
No Estado de São Paulo, entre os anos de 2007 a 2018, foram reportados 3.243 novos casos da forma clínica cutânea e 915 da forma mucocutânea, 642 novos casos da forma visceral com 55 óbitos foram reportados no período de 2014 a 2019 (SINAN, 2018) (Figura 03).
FIGURA 2. OCORRÊNCIA DE LEISHMANIOSE CUTÂNEA E MUCOSA EM TERRITÓRIO NACIONAL NO PERÍODO DE 2015 A 2017. ICLTc: Transmissão Índice Composto de Leishmaniose no Triênio. Incidência de casos a cada 100.000 habitantes. Adaptado de: www.paho.org.
FIGURA 3. OCORRÊNCIA DE CASOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL DE REGIÕES NO ESTADO DE SÃO PAULO. Mapa Kernel ilustrando casos de leishmaniose visceral humana entre 1999 e 2013 nas regiões de saúde de Araçatuba, Bauru, Marília, Presidente Prudente e São José do Rio Preto. Adaptado de: Cardim, M. F. M.; Guirado, M. M.; Dibo, M. R.; Neto, F. C. 2016.
1.3. O PARASITO
O agente etiológico causador da leishmaniose alterna seu ciclo de vida apresentando hospedeiros distintos: um invertebrado e outro vertebrado, assim como diferentes formas de vida, estas que possuem uma estrutura característica denominada cinetoplasto com DNA próprio (kDNA, composto por dois tipos de DNA circulares mitocondriais), localizado próximo ao bolso flagelar do parasito (Bates & Rogers, 2004; Kamhawi, 2006; Singh et al., 2016). O parasito apresenta duas formas principais, sendo a forma flagelada encontrada extracelularmente no tubo digestivo do hospedeiro invertebrado, denominada promastigota (Bates & Rogers, 2004; Kamhawi, 2006) (Figura 04).
FIGURA 4. MORFOLOGIA DE PROMASTIGOTA DE LEISHMANIA. A. Ilustração da forma móvel e flagelada do parasito de Leishmania indicando as estruturas do promastigota; B. Imagem obtida de cultura de L. (L.) amazonensis. Forma encontrada no trato digestivo de flebotomíneos e mantidos in vitro com meio 199 suplementado com soro fetal bovino.
(A) Adaptado de: Wheeler, R. J.; Gluenz, E.; Gull, K. 2013.
(B) Promastigota em lâmina corado com Kit Panóptico Rápido (Newprov) proveniente de gota de alíquota de cultura e observado por microscopia óptica (Piffer, A. B. 2018). Barra = 10 µm.
Ainda no intestino do flebotomíneo, os promastigotas procíclicos podem replicar-se por fissão binária (Figura 05) em um ambiente nutricionalmente rico (Rogers, 2002) e, posteriormente, passam por um processo de diferenciação tornando-se promastigotas metacíclicos indivisíveis, formas capazes de infectar hospedeiros vertebrados durante o repasto sanguíneo realizado por flebotomíneos fêmeas (Bates & Rogers, 2004; Kamhawi, 2006) (Figura 06).
FIGURA 5. DIVISÃO BINÁRIA DA FORMA PROMASTIGOTA. Ilustração e imagens da morfogênese do corpo celular de um promastigota em divisão.
Coluna esquerda: adaptado de: Wheeler, R. J.; Gluenz, E.; Gull, K. 2013. Coluna direita: imagens obtidas por microscopia óptica a partir de cultura in vitro de promastigotas em lâmina corados com Kit Panóptico Rápido (Newprov) (Piffer, A. B. 2018). Barra = 10 µm.
FIGURA 6. CICLO DE VIDA DE LEISHMANIA NO INSETO VETOR. Ciclo de vida dos parasitos de Leishmania no trato digestivo de um vetor flebotomíneo. Formas amastigotas são ingeridas através de um repasto sanguíneo realizado em um hospedeiro infectado. Tais formas passam a se diferenciar em promastigotas procíclicos, forma esta que na matriz peritrófica irá se dividir ativamente até se tornarem promastigotas nectomônadas que se mantêm fixos ao epitélio intestinal do inseto a fim de não serem eliminados durante a excreção de sangue digerido. Diferentes formas passam a surgir com os parasitos migrando em direção à porção anterior do intestino médio, as formas presentes irão se diferenciar em promastigotas leptomônadas dando por fim origem à forma infectante, os promastigotas metacíclicos, que atingem a porção que possibilita uma nova transmissão a hospedeiros. A saliva secretada no local do repasto sanguíneo contém componentes que agem sobre as células imunes locais, como os neutrófilos, por exemplo.
Adaptado de: Serafim, T. D.; Dey, R.; Nakhasi, H. L.; Valenzuela, J. G.; Kamhawi, S. (2017).
No hospedeiro vertebrado, parasitos promastigotas sofrem alterações morfológicas e bioquímicas quando internalizados em compartimentos fagolisossômicos, ou vacúolos parasitóforos, tornando-se amastigotas intracelulares (Figura 07), formas desprovidas de flagelo aparente, mas que possuem mecanismos para lidar com as condições prejudiciais deste ambiente possibilitando sua sobrevivência dentro das células hospedeiras (item 1.4.) (Antoine et al., 2004;
McConville & Naderer, 2011) (Figura 08). Em um novo repasto sanguíneo, os insetos ingerem do hospedeiro amastigotas e/ou macrófagos infectados com amastigotas, formas estas que se transformam em promastigotas, completando o ciclo no intestino do vetor (Bates & Rogers, 2004).
FIGURA 7. MORFOLOGIA DE AMASTIGOTA DE LEISHMANIA. A. Ilustração da forma amastigota indicando as estruturas encontradas neste parasita, evidenciando o flagelo reduzido; B. Formas amastigotas inseridas em infiltrado tecidual. Notar vacúolo parasitóforo expandido com diversos parasitos em seu interior, achado típico de infecções causadas por parasitos do complexo mexicana. (A) Adaptado de: Wheeler, R. J.; Gluenz, E.; Gull, K. 2013.
(B) Fotomicrografia de material de aposição de lesão de camundongos C57BL/6 infectado com L. (L.) amazonensis, material corado com Kit Panóptico Rápido (Newprov) (Piffer, A. B. 2018). Barra = 10 µm.
FIGURA 8. ILUSTRAÇÃO DO CICLO BIOLÓGICO DO PARASITO DE LEISHMANIA NO TECIDO DE UM HOSPEDEIRO MAMÍFERO. Formas promastigotas são injetadas através de um repasto sanguíneo realizado por um vetor infectado. As formas promastigotas invadem as células de defesa locais e em seu interior se diferenciam em formas amastigotas multiplicando-se até ocorrer sua liberação e, posterior infecção de novas células hospedeiras. Em um novo repasto sanguíneo, formas amastigotas são ingeridas e completam seu ciclo de vida no interior do flebotomíneo.
Adaptado de: Hepburn, N. C. 2013.
1.4. CÉLULAS HOSPEDEIRAS
Durante o processo de infecção, formas promastigotas metacíclicas são fagocitadas por uma variedade de células (Figura 09), entre elas neutrófilos e macrófagos, entretanto, tais parasitos são incapazes de se diferenciar e replicar em neutrófilos devido aos baixos níveis de aminoácidos essenciais disponíveis (Rubin-Bejerano et al., 2003; Antoine et al., 2004; Naderer & McConville, 2008). Por outro
lado, os macrófagos são a principal célula hospedeira infectada por Leishmania (Antoine et al., 2004) (Figura 10).
FIGURA 9. DIFERENTES CÉLULAS HOSPEDEIRAS QUE LEISHMANIA PODE PARASITAR. No início da infecção, quando as formas promastigotas são injetadas no hospedeiro, estes parasitos são fagocitados pelas células residentes, como neutrófilos e células dendríticas, por exemplo. Com isso, novas células de defesa são recrutadas ao local da infecção. A partir disso, fibroblastos, células dendríticas e células de Kupffer (para espécies viscerotrópicas) podem albergar o parasito, além do próprio macrófago.
FIGURA 10. CICLO DE VIDA COMPLETO DE LEISHMANIA. Ciclo de vida genérico completo do parasito de Leishmania. Resumo da junção das figuras 6, 8 e 9.
Quando fagocitados por macrófagos, os promastigotas se transformam em formas amastigotas no interior de compartimentos denominados vacúolos parasitóforos (VPs). A biogênese dos VPs ocorre a partir de eventos de fusão/fissão por um fagossomo que adquire características endossômicas e eventualmente lisossomais, levando a fagolisossomos maduros (Antoine et al., 2004; Hepburn, 2013; Naderer & McConville, 2008; Rubin-Bejerano et al., 2003; Samanovic et al., 2009; Real & Mortara, 2012) (Figura 11). Os lisossomos secundários constituem a principal fonte de membrana para a formação do VP de infecções por Leishmania (Real & Mortara, 2012). Portanto, o interior dessas organelas apresenta pH baixo (4,7-5,2) e altos níveis de proteases (Antoine et al., 2004; Muraille et al., 2010), cuja expressão pode ser regulada pelos macrófagos a partir da resposta celular que for ativá-lo possibilitando a sobrevivência dos amastigotas em seu interior (Kima, 2007; Wanasen & Soong, 2008; Das et al., 2010; Bhardwaj et al., 2010). Além disso, a composição nutricional também favorece a permanência e replicação do parasito, uma vez que estes modulam ativamente as vias de sinalização de macrófagos (Kima, 2007; Das et al., 2010; Bhardwaj et al., 2010).
FIGURA 11. VIAS DE OBTENÇÃO DE NUTRIENTES NO VACÚOLO PARASITÓFORO. Os endossomos de reciclagem e precoce internalizam macromoléculas e micronutrientes que serão utilizados pelo parasito a partir da fusão do endossomo tardio e do lisossomo ao compartimento em que Leishmania permanece albergada. O compartimento pode se fundir a outros fagossomos, autofagossomos e vesículas do retículo endoplasmático. ER: Endossomo de reciclagem; EP: Endossomo precoce; ET: Endossomo tardio.
Adaptado de: McConville, M. J.; Naderer, T. 2011.
Para assegurar o suprimento de nutrientes, amastigotas intracelulares exploram múltiplas fontes de carbono, como açúcares, aminoácidos e lipídios, podendo também utilizar ácidos graxos como fonte energética (Naderer & McConville, 2008), pela modulação do tráfego intracelular por vias complexas de transporte (Antoine et al., 2004; Hepburn, 2013). O transporte de precursores lipídicos pode ser facilitado pelas proteínas de ligação a ácidos graxos (FABPs) (Makowski & Hotamisligil, 2005), sendo estas expressas de maneira altamente específica para cada tecido (Lehmann et al., 2004).
1.5. FABPs E PPAR-GAMA
As FABPs são proteínas de 14 a 15 kDa que coordenam respostas lipídicas nas células como importação, armazenamento e exportação; essas moléculas se ligam reversivelmente a ligantes hidrofóbicos como ácidos graxos saturados e insaturados de cadeia longa, eicosanoides, entre outros lipídios com alta afinidade e ampla seletividade, sendo assim definidas como proteínas de transporte (Coe & Bernlohr, 1998; Zimmerman & Veerkamp, 2002; Haunerland & Spener, 2004; Chmurzyńska, 2006; Furuhashi & Hotamisligil, 2008) (Figura 12). A interação FABP–ácidos graxos é bem estabelecida, uma vez que ocorre aumento acentuado na expressão de FABP em condições de altas exposições aos ácidos graxos (Haunerland & Spener, 2004).
FIGURA 12. ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA DA FABP4. Estrutura da proteína de ligação a ácidos graxos (FABP4) indicando diferentes resíduos e moléculas.
Adaptado de: www.rcsb.org (Código: 2HNX)
Essas proteínas apresentam diversas isoformas que exibem padrões únicos de expressão tecidual, embora não sejam totalmente específicas para um único tipo
celular ou tecido, já que a maioria desses tecidos pode expressar mais que uma isoforma (Lehmann et al., 2004; Furuhashi & Hotamisligil, 2008). Portanto, o agrupamento destas proteínas é feito de acordo com sua presença em determinados locais, temos 9 isoformas descritas, como o FABP do tipo 1 sendo abundante no tecido hepático, já no tecido cardíaco e músculo esquelético FABP tipo 3, FABP tipo 5 na epiderme e FABP tipo 7 no tecido nervoso (Furuhashi & Hotamisligil, 2008; Furuhashi et al., 2011; Thumser et al., 2014; Furuhashi et al., 2019). Uma das FABPs com expressão em macrófagos e adipócitos é a FABP do tipo 4, conhecida também como A-FABP ou aP2 (Coe & Bernlohr, 1998; Fu et al., 2000; Furuhashi et al., 2019). No interior dos macrófagos, as FABP4 apresentam um importante papel no carreamento de ácidos graxos para diversas organelas, como o retículo endoplasmático e até mesmo para o núcleo, já que parece acessar facilmente em determinadas condições fisiológicas, (Furuhashi & Hotamisligil, 2008), onde estão envolvidas também na sinalização do tráfego de colesterol (Makowski, 2005), uma vez que estas estão intimamente relacionadas ao controle das vias de ativação de ABCA1, transportador responsável pelo efluxo celular de colesterol e fosfolipídios (Cavelier et al., 2006). Adicionalmente, a atividade inflamatória de macrófagos parece ser modulada através da FABP4, dado que a ausência de tal proteína interfira na via IKK–NF-k-beta alterando o perfil de expressão de citocinas (Makowski et al., 2005). Tem-se reportado a atividade tanto in vitro como in vivo da FABP4 na modulação de resposta inflamatória e do acúmulo de ésteres de colesterol, confirmados pelo tratamento com inibidor específico da FABP4 que causou redução de macrófagos enriquecidos com lipídios (Furuhashi et al., 2007). Sabe-se ainda que algumas destas vias são moduladas durante o processo de infecção por Leishmania, em que a sinalização mediada por NF-k-beta é crucial para a proteção contra
FIGURA 13. FUNÇÕES DA FABP4 NO MACRÓFAGO. A inibição do PPAR-gama atenua o efluxo de colesterol através de sinais lipídicos gerados pela FABP4. Além disso, a FABP4 regula respostas inflamatórias via NF-k-beta.
Adaptado de: Furuhashi, M.; Hotamisligil, G. S. 2008.
A regulação da expressão gênica mediada por ácidos graxos conta com a participação das FABPs, em que estas interagem por vezes com os receptores ativados por proliferadores de peroxissoma tipo gama (PPAR-gama) (Zimmerman & Veerkamp, 2002; Haunerland & Spener 2004; Furuhashi & Hotamisligil, 2008; Lecoeur et al., 2013; Wang et al., 2014) (Figura 14), modulando sua atividade e tornando-se necessária para a ativação de tal receptor (Boß et al., 2015).
FIGURA 14. ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA DO PPAR-gama. Estrutura do receptor ativado por proliferador de peroxissoma tipo gama.
Adaptado de: www.rcsb.org (Código: 6FZP)
Curiosamente, há evidências na literatura demonstrando que a inibição da FABP4 aumenta os níveis e atividade do PPAR-gama, já que a disponibilidade de ácidos graxos livres capazes de inibir a via NF-k-beta é maior, resultando assim em um aumento da atividade do PPAR-gama decorrente do bloqueio da resposta inflamatória, ao passo que outros achados já mostraram que a superexpressão da FABP4 pode reduzir a atividade e a expressão do PPAR-gama, visto que há baixa disponibilidade de ácidos graxos (Makowski et al., 2005; Garin-Shkolnik, 2014) (Figura 15). Tal fato demonstra que deve haver um processo dinâmico de regulação da interação indireta entre FABP4 e PPAR-gama.
FIGURA 15. COORDENAÇÃO DE FABP4 NO TRÁFEGO DE COLESTEROL E NAS VIAS INFLAMATÓRIAS EM MACRÓFAGOS. A. Presença de FABP4 restringe a disponibilidade de ácidos graxos, impossibilitando a ligação com possíveis alvos, como o PPAR-gama. B. Ausência de FABP4 aumenta a disponibilidade de ácidos graxos e sua consequente ligação com o PPAR-gama gerando maior efluxo de colesterol.
Adaptado de: Makowski, L.; Brittingham, K. C.; Reynolds, J. M.; Suttles, J.; Hotamisligil, G. S. 2005.
Abundantes e muito bem descritos em células do tecido adiposo, os PPARs por sua vez possuem um importante papel na regulação do armazenamento e catabolismo de ácidos graxos (Kliewer et al., 2001; Tan et al., 2002; Evans et al., 2004), como funções no metabolismo de lipídios e carboidratos, na proliferação e diferenciação celular, na inflamação, na resposta imune e na biologia vascular (Tontonoz & Spiegelman, 2008). Os PPARs formam um complexo com os receptores retinóide X (RXR), que por sua vez interagem com os elementos de resposta (PPAR) localizados no ácido desoxirribonucleico (DNA), com consequente ativação da transcrição (Michalik & Wahli, 2006). Existem três tipos de PPARs nos mamíferos, cada qual expresso por diferentes genes e codificados em diferentes tecidos: i) PPAR-alfa expresso principalmente no fígado e tecido adiposo marrom e menos expresso no músculo esquelético, coração, osso e rim. ii) PPAR-sigma (também referido como PPAR-beta) mais expresso no rim, intestino e coração, porém também é encontrado em menor extensão em diversos outros tecidos. iii) PPAR-gama mais abundante no tecido adiposo e menos expresso no sistema imunológico, no cólon e na retina sendo este subdividido em quatro isoformas: gama-1 mais expresso no coração, rim, pâncreas, baço, músculo e cólon; gama-2
predominantemente expresso no tecido adiposo; gama-3 expresso no intestino grosso, tecido adiposo branco e em macrófagos; gama-4 presente em células endoteliais (Tan et al., 2002; Berger & Moller, 2002; Tyagi et al., 2011).
As formas e isoformas dos receptores possuem seletividade estrita ao ligante e um exemplo de receptor para ácidos graxos carreados pela proteína citosólica FABP4 é a proteína nuclear PPAR-gama, em que tal isoforma apresenta padrão de expressão altamente regulado e está relacionada ao metabolismo lipídico de macrófagos (Desvergne & Wahli, 1999; Tan et al., 2002; Furuhashi & Hotamisligil, 2008; Boß et al., 2015). Agonistas de PPAR-gama como as tiazolidinedionas, rosiglitazona e pioglitazona atuam na diferenciação de adipócitos e têm sido utilizadas no tratamento de diabetes mellitus tipo II, dado que promovem uma melhora na sensibilidade celular à insulina (Michalik & Wahli, 2006).
A FABP4 ligada a certos tipos de ácidos graxos é translocada para o núcleo podendo interagir com PPAR-gama. Estudos mostraram que na presença da Rosiglitazona há intensa redistribuição da FABP4 no núcleo (Tan et al., 2002; Yang et al., 2002). Assim, PPAR-gama é implicado como um dos receptores essenciais para a homeostasia macrofágica (Ricote et al., 1999). Além disso, a expressão diversificada dos PPARs em diferentes tipos de células imunitárias devem desempenhar importante papel na regulação da resposta imunológica, visto que a ativação dos PPARs possibilite o escape da resposta imune do hospedeiro (Straus & Glass, 2007), já que esta ativação promove o aumento do metabolismo hospedeiro e consequente produção de energia, suprimindo ainda, a inflamação (Chan et al., 2010).
1.6. RESPOSTA IMUNOLÓGICA
Durante infecções por Leishmania, a síntese e secreção de determinadas citocinas serão responsáveis pela diferenciação de macrófagos, onde citocinas Th1 estimulariam uma diferenciação dos macrófagos para macrófagos M1 pró-inflamatórios, enquanto citocinas Th2 sustentariam uma diferenciação em macrófagos M2 anti-inflamatórios. O padrão de expressão de diferentes citocinas é alterado de acordo com o status imunológico do paciente e em alguns casos com a espécie de Leishmania. Tais citocinas desempenham funções diretas na modulação das quimiocinas envolvidas em processos de quimiotaxia e estabelecimento de resposta inflamatória celular (Ritter et al., 2004).
De forma geral, sabe-se que a imunidade Th1 é a que apresenta maior resistência contra parasitos de Leishmania, uma vez que a síntese de interferon-gama (IFN-interferon-gama) ativaria e estimularia os macrófagos a produzirem óxido nítrico. Essa produção se deve também a ativação de NF-k-beta, via essa que pode ser ativada por lipopolissacarídeos (LPS) (da Silveira Cruz-Machado, 2018). Esse componente é normalmente utilizado como controle positivo na quantificação de nitrito. Por outro lado, a predominância da resposta Th2 é responsável pela maior suscetibilidade à infecção, já que há produção de interleucinas que induzem tal perfil (Heinzel et al., 1989). Estudos como o de Chan e colaboradores demonstraram que o PPAR-gama ativado por agonistas estimula a diferenciação dos monócitos para macrófagos M2 anti-inflamatórios podendo assim favorecer a multiplicação dos parasitos, tendo em vista que a ativação de PPAR-gama suprimiu a produção de IFN-gama e óxido nítrico, promovendo o aumento da carga parasitária por permitir a sobrevivência do parasita como uma infecção parasitária crônica (Straus & Glass, 2007; Chan et al., 2010) (Figura 16).
FIGURA 16. RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS FRENTE À INFECÇÃO POR LEISHMANIA. A imunidade Th1 liberando IFN-gama, leva a macrófagos classicamente ativados, em que estes produzem óxido nítrico (iNOS), interleucina-1 (IL-1), fator de necrose tumoral (TNF) e intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio (ROI, RNI) que atuam, por sua vez, na eliminação dos amastigotas. Por outro lado, a imunidade Th2 liberando IL-4, leva à ativação do receptor ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR) e, alternativamente, aos macrófagos que produzem arginase, IL-10, fator de crescimento transformador beta (TGF-beta) e PPAR que permitem a propagação do parasita.
Adaptado de: Chan, M. M.; Evans, K. W.; Moore, A. R.; Fong, D. 2010.
Além disso, experimentos de infecção realizados com macrófagos C57BL/6 e parasitos L. (L.) donavani, demonstraram que perante adição do ativador de IL-4 houve um aumento da infectividade, com macrófagos apresentando maior carga parasitária. Já quando adicionado um antagonista de PPAR-gama, houve uma queda na infectividade. Tais dados corroboram demais estudos envolvendo a
