H Troca e H Dipolar representam as energias envolvidas em interações entre elétrons
3.10 Ensaios de toxicidade dos peptídeos 1 Atividade hemolítica
Ensaios de atividade hemolítica dos peptídeos foram realizados a fim de estudar a toxicidade dos mesmos e comparar o grau de atividade dos diversos fragmentos.
Cinco mililitros de sangue obtido de voluntários saudáveis foram misturados com 40 mL de solução salina estéril (0,9% NaCl em água), centrifugados por 10 minutos a 1500 rotações por minuto (rpm), equivalente a 500 g. O sobrenadante foi então removido. Esse processo da lavagem das células foi realizado três vezes até que o sobrenadante estivesse limpo após a centrifugação.
Em seguida, 2 mL do pellet de hemácias foram misturados com 8 mL de solução salina, resultando numa suspensão de 20% em volume de células.
Uma placa de polipropileno de 96 poços (Corning, NY, EUA) foi previamente preparada com diluições seriadas do peptídeo em solução salina com concentrações entre 128 e 2 M e um volume final de 50 L. Para o ensaio, 50 L da suspensão de hemácias a 20% foram adicionados em cada poço na placa contendo as diluições dos peptídeos para um volume final de hemácias de 10%. Como controle negativo usou-se solução salina estéril, e como controle positivo, Triton X-100 a 0,1%.
As placas foram incubadas por 24 horas a 37°C e ao final centrifugadas a 1200 rpm (400 g) por 10 minutos. O sobrenadante contendo a hemoglobina liberada pela ação dos peptídeos foi diluído 5 vezes em uma placa poliestireno de 96 poços de fundo chato (Greiner Bio-One, Áustria). A absorbância em 414 e 546 nm foi então medida em um leitor de placas Synergy HT (Bio-Tek, VT, EUA).
A porcentagem de hemólise foi calculada baseada na absorbância medida pela seguinte expressão:
Ativ. Hem. (%) = 100 x (APEP – ANEG)/(APOS – ANEG) Equação 3.24
onde APEP, ANEG eAPOS referem-se às absorbâncias da amostra com o peptídeo, e
dos controles positivo e negativo respectivamente. 3.10.2 Atividade contra células eucarióticas HeLa
A citotoxicidade dos peptídeos contra células HeLa WT foi estimada por meio do ensaio de viabilidade celular. A atividade metabólica das células foi medida
utilizando-se um kit CellTiter 96® AQ One Solution Cell Proliferation Assay (Promega,
WI, EUA). O teste baseia-se na capacidade de enzimas oxidoredutases de células viáveis converterem o sal MTS em um produto, formazan, solúvel no meio de
cultura, cuja absorbância medida em 490 nm é diretamente proporcional à viabilidade celular (Fig. 3.18).
Figura 3.18. Reação de conversão do MTS em formazan.
O dano na membrana plasmática de células HeLa WT pela ação dos peptídeos foi estimado por meio de um ensaio de permeabilidade da enzima lactato desidrogenase utilizando o kit CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay
(Promega, WI, EUA). O teste colorimétrico baseia-se na reação na redução de NAD+
(dinucleótido de nicotinamida e adenina) a NADH, catalisada pela enzima LDH e na oxidação de NADH por um sal de tetrazólio (INT) que é então convertido em um produto formazan (Fig 3.19). A absorbância do formazan em 490 nm é diretamente proporcional ao número de células lisadas.
Figura 3.19. Reações envolvendo a lactato desidrogenase e a formação do produto colorimétrico formazan.
3.10.2.1 Cultura de células HeLa WT
As células HeLa WT foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen, MA, EUA) contendo 10% de soro fetal bovino e 1% dos antibióticos penicilina/estreptomicina.
Inicialmente, alíquotas de aproximadamente 1 mL e 106 células estocadas em
nitrogênio líquido foram descongeladas e, junto com 3 mL de meio DMEM, passadas para uma garrafa para cultura de células. As células, que crescem aderidas à superfície da garrafa foram então incubadas a 37°C em uma atmosfera umidificada e
Ao alcançar entre 90 e 100% de confluência, o meio foi retirado e as células aderidas foram lavadas com entre 3 e 5 mL de PBS (Invitrogen, MA, EUA) por três vezes. Em seguida, 2 mL de tripsina foram adicionados e as garrafas foram incubadas por 10 minutos a 37°C para que as células fossem ressuspendidas e coletadas. O total de células foi então dividido e adicionado em duas ou mais garrafas junto com meio DMEM para aderirem novamente à superfície do plástico mantendo a cultura de células.
A confluência, a integridade das células bem como a adesão e ressuspensão das mesmas foram checadas em um microscópio óptico com aumentos de 10 e 100 vezes.
3.10.2.2 Contagem das células e preparação das placas para os ensaios
Para realização dos ensaios de toxicidade e permeabilidade da membrana, células HeLa WT com ao menos três passagens foram coletadas, diluídas em meio DMEM e tiveram a concentração determinada em um leitor Z2 Coulter Counter (Beckman, CA, USA). Em seguida, as células foram diluídas para uma concentração
de 2,5.105 células/mL e 200 L da suspensão foram adicionados em cada poço de
uma placa de poliestireno de 96 poços (Greiner Bio-one, Áustria), totalizando 5.104
células/poço. As placas foram então incubadas por 24 horas para adesão das células nas mesmas condições das garrafas de cultura.
3.10.2.3 Exposição das células aos peptídeos
Depois de checadas a integridade e adesão das células, o meio DMEM foi
retirado e as células lavadas duas vezes com 100 L por poço de PBS. Em seguida
foram adicionados 100 L por poço de diluições seriadas entre 128 e 2 M dos peptídeos em meio DMEM. Triton X-100 0,1% foi usado como controle positivo (0% de viabilidade para MTS e 100% de permeabilidade de LDH) e meio DMEM como controle negativo.
As células expostas a diferentes concentrações dos peptídeos foram
3.10.2.4 Ensaio de viabilidade celular
Para verificação da viabilidade celular, 20 L do reagente MTS foi adicionado
em cada poço contendo as células previamente expostas aos peptídeos. As placas foram incubadas por mais uma hora e a absorbância de cada poço medida em 490 nm.
A porcentagem de viabilidade celular foi calculada com base nos controles
positivo (0%, APOS) e negativo (100%, ANEG).
Viab. Cel. (%) = 100 x (APOS– APEP)/(APOS– ANEG) Equação 3.25
3.10.2.5 Ensaio de integridade da membrana celular
As placas para o ensaio de permeabilidade celular foram, após o período de
incubação de 4 horas, centrifugadas por 4 minutos a 250 g e 50 L do sobrenadante
de cada poço transferidos para a placa de reação.
A cada poço foram adicionados 50 L do substrato reconstituído em tampão fornecido no kit utilizado. A placa foi incubada à temperatura ambiente por 10 minutos para processamento da reação até a adição de 50 L da solução de ácido acético 1 M para parada da reação.
A porcentagem de permeabilização da membrana celular foi calculada com
base nos controles positivo (100%, APOS) e negativo (0%, ANEG).
Permeab. (%) = 100 x (APEP– ANEG)/(APOS– ANEG) Equação 3.26
3.11 Modelagem estrutural dos peptídeos in silico