Espectroscopia de Dicroísmo circular (CD) 1 Atividade óptica

Macromoléculas em geral possuem assimetria molecular, de forma que sua estrutura não é sobreponível à sua imagem especular.

Moléculas assimétricas podem ser caracterizadas espectroscopicamente de acordo com sua atividade óptica em dextrorrotatórias (giram o plano da luz plano- polarizada para direita) ou levorrotatórias (giram o plano da luz plano-polarizada para esquerda). Esse fenômeno, primeiramente observado em cristais de tartarato de sódio e amônio tetra-hidratado por Louis Pasteur em 1848, é chamado de quiralidade (Flack, 2009).

As propriedades quirais das moléculas relacionadas às suas estruturas são estudadas por dois métodos espectroscópicos principais (Woody, 1996). O primeiro e mais simples é a polarimetria, método em que a amostra é analisada por um feixe de luz monocromática plano-polarizada. A amostra interage com a radiação girando em um determinado ângulo (α) o plano de polarização da luz sendo que, além das

propriedades ópticas da molécula (rotação específica, [α]), depende da

concentração da molécula quiral (C) e do caminho percorrido pela luz na amostra (l). A polarimetria segue a lei de Lambert-Beer:

α = [α].C . l Equação 3.1

3.5.2 Estudo de propriedades da moléculas quirais por CD

Outro método de estudo das propriedades quirais das moléculas é o dicroísmo circular. No CD, quantidades iguais de duas componentes de luz circularmente polarizada, uma à esquerda e outra à direita, passam por uma amostra quiral que absorve diferencialmente cada uma delas, e a diferença de absorção de cada uma das componentes é medida.

A absorção de cada uma das componentes obedece à lei de Beer-Lambert, sendo medida no final a diferença de absorção de cada uma das componentes (ΔA).

ΔA = AE– AD= ( E– D) .C . l Equação 3.2

onde AE e AD são as absorbâncias da luz circularmente polarizada à esquerda e à

direita, respectivamente; E e D são os coeficientes de absorção molar da luz

circularmente polarizada à esquerda e à direita, respectivamente; C é a concentração do soluto e l é o caminho óptico (Woody, 1996).

A absorção diferencial das componentes resulta numa luz elipticamente polarizada (Fig. 3.1) definida por um ângulo θ medido em graus (deg).

Figura 3.1. Esquema da luz elipticamente polarizada (roxo) formada pela luz circularmente polarizada à direita (azul) e à esquerda (vermelho) com intensidades diferentes.

A absorção diferencial (ΔA) e o ângulo da elipse formada pela luz elipticamente polarizada (θ) se relacionam por (Woody, 1996):

θ = 2,303 . ΔA . 180/4π = 2,303 . ( E– D) .C .l .180/4π Equação 3.3

3.5.3 Estudo de proteínas e peptídeos por CD

O CD é amplamente usado no estudo estrutural de moléculas quirais como proteínas e peptídeos (Kelly et al., 2005).

No estudo da estrutura secundária de proteínas e peptídeos o principal cromóforo é a ligação peptídica que apresenta assimetria, e, portanto, CD. O grupo amida das ligações peptídicas apresenta transições eletrônicas de baixa energia dos

tipos n → π* (entre 215 e 230 nm) e π0→ π* (entre 185 e 200 nm) que são as

principais responsáveis pelo sinal de CD de polipeptídeos na região do ultravioleta distante (abaixo de 260 nm). Resíduos aromáticos apresentam transições

embora, em muitos casos, tais resíduos contribuam para o espectro de proteínas na região do ultravioleta distante. Pontes de dissulfeto também apresentam CD relacionado à transição n→ * (ao redor de 260 nm) (Woody, 1996; Kelly et al., 2005).

A luz ultravioleta circularmente polarizada ao passar por uma amostra de um polipeptídeo tem suas componentes diferencialmente absorvidas de acordo com o

conjunto dos ângulos de torção φ (Cα-N) e ψ (Cα-C) que determinam a estrutura

secundária do polipeptídeo (Fig. 3.2). Assim, por meio dos espectros de CD na região do ultravioleta distante é possível caracterizar a estrutura secundária de proteínas e peptídeos.

Figura 3.2. Representação esquemática da ligação peptídica, evidenciando os ângulos de torção φ e ψ (Voet & Voet, 2004).

Cada tipo de estrutura secundária, correspondendo a conjuntos específicos

dos ângulos de torção φ (Cα-N) e ψ (Cα-C), origina um espectro de CD característico

Figura 3.3. Espectros de CD na região do ultravioleta distante associados a

diferentes tipos de estruturas secundárias. ( ), α-hélice; ( ), folha-

antiparalela; ( ), dobra- do tipo I; ( ), hélice estendida 310 ou hélice de

poli(Pro); ( ), estrutura randômica (Kelly et al., 2005).

Nos espectros de CD, para eliminar a dependência linear do caminho óptico,

da concentração e do número de resíduos define-_{se elipticidade molar residual ([θ]):}

[_{θ] = θ/(10.C.n.l)} Equação 3.4

onde C é a concentração do peptídeo em mol/L, n é o número de resíduos, e l é o

caminho óptico da cela utilizada expresso em cm. As unidades de _{θ e [θ] na}

equação são miligrau (mdeg) e grau.cm2.dmol-1, respectivamente.

3.5.4 Obtenção dos espectros de CD

Espectros de CD foram coletados em um espectropolarímetro Jasco J-720 na região do UV distante (190-260 nm), a 22 ± 1°C.

Para os experimentos com micelas utilizou-se uma cela de caminho óptico de

1 mm, a concentração dos peptídeos foi de 12 M e foram realizadas quatro

acumulações para cada espectro. Nos experimentos com LUV, utilizou-se uma cela de caminho óptico de 5 mm, a concentração dos peptídeos foi de 5 M e foram realizadas seis acumulações para cada espectro. Os experimentos foram realizados em tampão PBC 0,5 mM.

Foram coletados espectros dos peptídeos em solução e na presença de diferentes concentrações de membranas modelo. Coletaram-se espectros das micelas ou das vesículas em solução nas concentrações estudadas para posterior subtração dos espectros dos peptídeos.

Os espectros obtidos em unidades de miligraus foram processados e

convertidos em [θ] utilizando-se o programa Microcal Origin 8.5.

3.5.5 Análise e desconvolução dos espectros de CD

Os espectros de CD normalizados para [θ] foram desconvoluídos para cálculo

das porcentagens de cada tipo de estrutura secundária nos peptídeos em diferentes condições.Na presença de micelas ou bicamadas, os espectros selecionados para análise e desconvolução apresentavam somente a população ligada do peptídeo. Tal verificação foi realizada aumentando a concentração lipídica na amostra até que o espectro obtido não mudasse indicando a saturação da ligação.

Para o cálculo estrutural, utilizou-se o software Pepfit (Reed & Reed, 1997) e um conjunto de espectros padrão de Greenfield & Fasman, 1969. O software realiza a desconvolução calculando as proporções entre as curvas padrões de cada estrutura secundária correspondentes ao espectro de interesse.

A análise da ligação dos peptídeos às membranas modelo foi feita relacionando a intensidade de [θ] em 222 nm com a concentração de lipídios em cada espectro de CD. Os valores de elipticidade molar foram então normalizados

pelo valor de intensidade em 222 nm obtido em solução (_[θ]N = [θ]222 / [θ]222 Solução)

de modo a obter isotermas de ligação dos peptídeos em diferentes condições. Aos

dados _{experimentais ([θ]}Normalizado e [Lipídio]) foram ajustados os coeficientes da

equação de Hill quantificando características da interação como afinidade dos peptídeos pelas membranas modelo (K) e cooperatividade do processo (n).

[θ]N= 1 + ([θ]NMáx– 1) [Lip]n / (Kn + [Lip]n) Equação 3.5

A constante de ligação (Kb, M-1) é então calculada pelo inverso do valor da

constante de Hill obtido pelo ajuste: