Ensaios em linhas celulares

Neste procedimento experimental com células em cultura, a linha celular utilizada foi a MG-63, que deriva de tumores ósseos malignos. Trata-se de células que conservam algumas características osteoblásticas, mas com alterações cromossómicas, que conduzem a funções moleculares e celulares anormais. [73]

3.5.1. Ensaio MTT

Com o objetivo de determinar a viabilidade celular, o ensaio do MTT baseou-se na redução do MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Note-se que esta redução se deve à atividade das succinato-desidrogenases mitocondriais das células metabolicamente ativas. Estas enzimas promoveram a redução dos sais de tretazólio, que apresentavam uma cor amarela, a formazano, de cor escura. Estes sais de formazano foram, posteriormente, dissolvidos e a absorvência foi lida num comprimento de onda de 492 nm. Este ensaio colorimétrico é muito útil para a medição da citotoxicidade e proliferação celular

in vitro, para além de ser conveniente, sensível, rápido e preciso. [74]

3.5.1.1. Preparação das soluções dos produtos

Os produtos testados foram o produto “3 Algas” (A), “Banho Aromático” (B) e “Água do Mar” (M). As quantidades utilizadas foram concentradas duas vezes (2x a quantidade), mantendo a concentração final pretendida na placa aquando da diluição com o meio de cultura celular. A solução mãe (solução 5) de cada produto ficou no banho a 37 ºC, durante a noite.

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Após este passo, foram transferidas para uma temperatura de 73ºC, durante duas horas. Posteriormente, todas as soluções foram filtradas com um filtro 4,5 µm. A partir da solução mãe de cada produto, efetuou-se a preparação de uma série de diluições sucessivas, de acordo com o índice de diluição calculado. Os cálculos e o esquema representativo deste processo estão discriminados na Figura 16.

Figura 16: Quantidades dos produtos utilizados e respetivas diluições a serem testadas em cultura celular.

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3.5.1.2. Descongelação de células

3.5.1.2.1. Reagentes e soluções

As células foram descongeladas recorrendo à utilização do meio de cultura RPMI 1640 suplementado com soro vitelo-fetal (SVF).

3.5.1.2.2. Procedimento

Uma vez que as amostras foram conservadas em azoto líquido, foi indispensável recorrer à descongelação. Assim, os tubos de congelação do azoto foram retirados e descongelados, ainda que não totalmente, em banho-maria, a 37˚C. Na câmara de fluxo laminar, o conteúdo dos tubos foi agitado com uma pipeta de Pasteur. Após este passo, o conteúdo celular foi transferido, gota a gota, para um tubo com meio de cultura RPMI e efetuou-se uma centrifugação de 10 minutos a 200 x g. Rejeitou-se o sobrenadante, colocou- se 1 mL de meio de cultura e homogeneizou-se a solução. Em seguida, semeou-se o centrifugado, em frascos de cultura, com 5 mL de meio de cultura e foram colocados na câmara de CO2, a 37ºC. Um dia depois, mudou-se o meio de cultura e prosseguiu-se com a

cultura. A cultura durou cerca de sete dias, até as células estarem confluentes.

3.5.1.3. Determinação da viabilidade celular

3.5.1.3.1. Crescimento e adesão celular às placas

O passo que, a seguir, é descrito foi fundamental, uma vez que permite identificar possíveis contaminações nos poços das placas de ELISA semeadas. Escolheu-se uma caixa de cultura com uma densidade aproximada de 60 a 70% e retirou-se todo o meio de cultura da caixa para um tubo de centrifugação. Adicionaram-se 1,5 mL de tripsina/EDTA à caixa de cultura, durante dois minutos, na placa de aquecimento a 37 ˚C. Verificou-se se as células estavam soltas e transferiu-se todo o conteúdo da caixa para o tubo de centrifugação. De seguida, centrifugou-se o tubo durante 10 minutos, a 200 x g, e decantou-se o sobrenadante. Ressuspendeu-se as células num novo meio de cultura, procedendo-se em seguida à sua

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contagem numa câmara de Neubauer. Numa placa de cultura de 96 poços, semeou-se em cada poço 2×104 células, com meio de cultura completo, para num volume final no poço de 100 µL e, por último, colocou-se a placa durante a noite na câmara de CO2, a 37 ˚C.

3.5.1.3.2. Teste com o tratamento pretendido

Após a incubação de 24 horas, removeu-se o meio de cultura e colocou-se novo meio de cultura, que continha a solução que se pretendia testar nas várias diluições. As quantidades e diluições estão representadas na Figura 17. Incubou-se a placa durante 72 horas.

3.5.1.3.3. Tratamento com MTT e leitura da absorvência

Ultrapassadas as 72 horas de incubação, foi preparada uma solução mãe de MTT (5 mg/mL) (Sigma) com tampão fosfato (PBS), a pH 7,4, e foi filtrada. O meio de cultura celular usado conteve fenol, o que alterou a absorvência, tendo sido necessário efetuar uma lavagem antes de colocar o MTT. Foi, então, efetuada a lavagem, removendo o meio de cultura e colocando 80 µL de PBS a cada poço, e que posteriormente foi retirado. Após a retirada do PBS, colocaram-se 10 µL de MTT mais 80 µL de PBS a cada poço. Incubou-se a placa a 37ºC, durante quatro horas, e removeu-se cuidadosamente o conteúdo dos poços, tendo em atenção que não se removessem os cristais de formazano. Adicionaram-se 100 µL de DMSO a cada poço de cultura e agitou-se a placa durante cinco minutos, após a adição do DMSO. A leitura foi efetuada, num leitor ELISA, a um comprimento de onda de 492 nm.

3.5.2. Ensaio do cometa em culturas celulares

Na eventualidade de ser necessário descongelar e fazer crescer mais células, o procedimento aplicado é o que se encontra descrito no parâmetro 3.5.1.2. “Descongelação de Células”. As quantidades e os produtos, ou conjugação destes, estão representados na seguinte tabela (Tabela 5).

44 Tabela 5: Tabela referente aos produtos e às quantidades testadas neste ensaio.

3.5.2.1. Crescimento e adesão celular às placas

Este passo é em tudo semelhante ao do ensaio do MTT, partindo da escolha da caixa de cultura com uma densidade aproximada de 60 a 70%. Após este procedimento, retirou-se todo o meio de cultura da caixa para um tubo de centrifugação. Adicionaram-se 1,5 mL de tripsina/EDTA à caixa de cultura, durante dois minutos, na placa de aquecimento, a 37 ˚C. Verificou-se se as células estavam soltas e transferiu-se todo o conteúdo da caixa para o tubo de centrifugação. De seguida, centrifugou-se o tubo durante 10 minutos a 200 x g e decantou- se o sobrenadante. Ressuspendeu-se as células num novo meio de cultura, procedendo-se depois à contagem das células numa câmara de Neubauer. Numa placa de cultura de 96 poços, semeou-se em cada poço 2×104 células, com meio de cultura completo para num volume final no poço de 100 µL e a placa foi colocada durante a noite na câmara de CO2, a 37 ˚C.

3.5.2.2. Teste com o tratamento pretendido

Uma vez mais, este procedimento é igual ao efetuado no ensaio do MTT. Após a incubação de 24 horas, removeu-se o meio de cultura e colocou-se novo meio de cultura que continha o ou os produtos que se pretende testar nas várias diluições. As quantidades e as diluições estão representadas na Figura 16. A placa foi incubada, durante 72 horas, e, após esse período, as células foram congeladas até se iniciar o ensaio do cometa. O ensaio do cometa nas células de cultura foi iniciado no ponto do tratamento de amostras, a partir do qual o procedimento foi o mesmo.

Produto Quantidades de produto no Ensaio

“3 Algas” 55,9 g/L

“Banho Aromático” 100 µL/L

“Água Mar” 20% Água Mar

“3 Algas” + “THALION” 55,9 g/L + 200 µL/L

“3 Algas” + “Lama Marinha” 55,9 g/L + 45,5 g/L

“3 Algas” + “Banho Aromático” 55,9 g/L + 100 µL/L

“3 Algas” + “Água Mar” 55,9 g/L + 20% Água Mar

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