ENSAIOS FUNCIONAIS IN VITRO

4.8.1 Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi analisada por meio do ensaio com o corante Alamar Blue (Invitrogen, EUA). Trata-se de um método colorimétrico sensível e de fácil execução, que possibilita avaliar a atividade metabólica das células a partir da redução da resazurina (corante

azul isento de fluorescência) em resorufina, um corante rosa com alta fluorescência (MENYHÁRT et al., 2016).

Para esta finalidade, as células SCC-25 foram cultivadas em microplacas de 96 poços, na densidade de 2 x 104 células/poço, e submetidas a carenciamento por 24 horas. Em seguida, foram realizados ensaios em quadruplicata para cada grupo (G0, G10 e G20). Nos intervalos de 24, 48 e 72 horas após a administração da rhPAI-1, o meio foi removido e as células foram cultivadas com 10 μL de Alamar Blue e 90 μL de meio DMEM/F-12 sob condições normais de cultivo. Após quatro horas, os valores de absorbância das soluções foram mensurados em leitor de microplacas (Epoch-Biotech Instruments, EUA), nos comprimentos de onda de 570 nm (forma reduzida) e 600 nm (forma oxidada). Finalmente, a redução do Alamar Blue foi calculada por meio de equação fornecida pelo fabricante.

4.8.2 Análise do ciclo celular

A distribuição das células de acordo com a fase do ciclo celular (G0/G1, células quiescentes; S, etapa de síntese de material genético; G2/M, células com alta capacidade proliferativa) foi determinada por citometria de fluxo, utilizando-se iodeto de propídio (PI) para marcação de DNA. As células foram cultivadas em microplacas de seis poços, na densidade de 1,5 x 105 células/poço. Após 24 horas de carenciamento, os grupos celulares receberam os tratamentos indicados no Quadro 3.

Seguindo adaptação do protocolo de Henriques et al. (2014), transcorridas 24 horas da administração da rhPAI-1, as células foram submetidas aos seguintes procedimentos: lavagem com PBS; tripsinização; centrifugação a 3000 rpm por 5 minutos, a 4ºC; lavagem com PBS; nova centrifugação; fixação em etanol (70%) por 60 minutos, a -20ºC; lavagem com PBS; nova centrifugação; descarte do sobrenadante. Os pellets foram ressuspendidos em 200 µL de solução contendo Triton™ X-100 (0,1%) e RNAse-A (2 mg/mL) (Sigma-Aldrich, EUA) e incubados por 60 minutos, a 37ºC, com o propósito de permeabilizar a membrana plasmática. Foi adicionada solução de PI (50 µg/mL; Invitrogen, EUA) em PBS, e as amostras foram incubadas sob abrigo da luz, em temperatura ambiente, por 10 minutos. Após transferência para tubos FACS, foi realizada a leitura de no mínimo 10.000 eventos em cada amostra no citômetro de fluxo FACS Canto II (BD Biosciences, EUA). Com o auxílio do programa FlowJo (versão 7.6.3; Tree Star Inc., EUA), foi determinada a porcentagem de células em cada fase do ciclo celular. Este experimento foi conduzido em quadruplicata.

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4.8.3 Detecção de morte celular

Com o objetivo de avaliar os efeitos da rhPAI-1 sobre a morte celular, foi utilizado o kit Annexin V-FITC and PI Dead Cell Apoptosis for Flow Citometry (Invitrogen, EUA). A anexina V-FITC é um marcador que se liga a fosfolipídios carregados negativamente, expressos na superfície celular durante o processo de apoptose. Por sua vez, o PI possui a capacidade de ligação ao DNA. Contudo, em decorrência de seu alto peso molecular, este marcador é incapaz de atravessar a membrana plasmática íntegra. Dessa forma, a marcação positiva para o PI indica a presença de poros na membrana, compatível com estágios finais da apoptose ou necrose (MENYHÁRT et al., 2016).

Para este ensaio, as células foram cultivadas em microplacas de seis poços, na densidade de 1,5 x 105 células/poço, e submetidas a carenciamento por 24 horas. Para cada grupo celular, foram utilizados quatro poços, possibilitando a análise em quadruplicata. Vinte e quatro horas após os tratamentos descritos anteriormente (Quadro 3), foi realizada tripsinização, seguida por centrifugação a 3200 rpm por 5 minutos, lavagem com PBS e descarte do sobrenadante. As células foram ressuspendidas em 95 µL de tampão de ligação e incubadas com 5 µL de Anexina V-FITC, por 20 minutos, em temperatura ambiente, sob proteção de luz. Após o período de incubação, as células foram lavadas e ressuspendidas em 200 μL de tampão de ligação, contendo 10 µL da solução de PI (20 µg/mL). Por fim, foi realizada a análise em citômetro de fluxo FACS Canto II (BD Biosciences, EUA), sendo mensurada a emissão de fluorescência a 530 nm e 575 nm. Com o auxílio do programa FlowJo (versão 7.6.3; Tree Star Inc., EUA), foram determinados os níveis relativos (%) das populações celulares descritas a seguir, com base na expressão de Anexina V e PI: células Anexina V–/PI– (viáveis); células Anexina V+/PI– (em apoptose inicial); células Anexina V+/PI+ (em apoptose tardia); células Anexina V–/PI+ (necróticas) (SUN; ZONG, 2016).

4.8.4 Ensaio de migração celular

O potencial migratório foi avaliado pelo ensaio Wound healing, também denominado Scratch, seguindo adaptações do protocolo descrito por Liang, Park e Guan (2007). Células SCC-25 foram cultivadas em microplacas de 24 poços, na densidade de 1,5 x 105 células/poço, e submetidas a carenciamento por 24 horas. Posteriormente, foi criada uma área de descontinuidade (ferida) retilínea na monocamada celular de cada poço, utilizando-se uma ponteira estéril de 200 µL, de modo firme.

Após a criação das feridas, foram realizadas lavagens com PBS, visando a eliminação de debris celulares. Em seguida, os grupos celulares foram tratados conforme descrito no Quadro 3. O fechamento das feridas foi monitorado em microscópio invertido Nikon Eclipse Ti-U (Nikon, Japão), a partir deste momento (T0) e, posteriormente, a cada 6 horas, durante um total de 24 horas. Nestes intervalos, foram obtidas fotografias de três campos microscópicos (100x) na região da ferida, utilizando-se o software NIS-Elements 3.0 (Nikon, Japão). Ao longo do ensaio, teve-se o cuidado de fotografar os mesmos campos microscópicos. As áreas das feridas (livres de células) foram mensuradas por meio do programa Image Processing and Analysis in Java (ImageJ®, National Institutes of Health, EUA) e comparadas entre os grupos. Este experimento foi conduzido em triplicata.

4.8.5 Ensaio de invasão celular

Para o ensaio de invasão celular, foram utilizados insertos Transwell (Corning, EUA) com 6,5 mm de diâmetro, em microplaca de 24 poços. Trata-se de um sistema constituído por dois compartimentos, separados por uma membrana de policarbonato com poros de 8 µm. As membranas de policarbonato foram recobertas com matrigel (E1270, Sigma-Aldrich, EUA), que consiste em uma membrana basal reconstituída, composta por colágeno IV, laminina, heparan-sulfato, entactina, nidogênio e fatores de crescimento (LEE et al., 2015). O matrigel obstrui os poros da membrana, bloqueando a migração das células não invasivas. Por outro lado, as células com maior potencial invasivo degradam enzimaticamente o matrigel, o que permite sua invasão através dos poros da membrana.

A solução estoque de matrigel foi descongelada overnight no refrigerador e, posteriormente, diluída em DMEM/F-12 sem FBS na proporção de 1:1. A seguir, 50 μL da solução resultante foram dispostos sobre cada membrana, de modo a formar uma fina camada. As microplacas contendo os insertos Transwell foram incubadas na estufa a 37ºC, por 2 horas, para total geleificação do matrigel. As células SCC-25, previamente carenciadas por 24 horas, foram tripsinizadas e contadas na câmara de Neubauer. Em seguida, foi dispensado na câmara superior do Transwell um total de 8 x 104 células, suspensas em 250 μL de DMEM/F-12 sem FBS. Por sua vez, no compartimento inferior, foram acrescentados 500 μL de DMEM/F-12 com FBS (10%), para efeito quimioatrativo. Foram semeados três poços por grupo (G0, G10 e G20), possibilitando análise em triplicata. Com a incubação da microplaca a 37ºC por 72 horas, ocorreu a invasão das células no matrigel e adesão à face inferior das membranas de policarbonato. Ao término desta etapa, as células localizadas na face superior das membranas

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foram removidas com o auxílio de swab, ao passo que as células aderidas à face inferior foram fixadas em formol (10%) e coradas em azul de toluidina (1%) (HENRIQUES et al., 2014).

Posteriormente, as membranas de policarbonato foram transferidas para lâminas histológicas preparadas com meio de montagem (Erv-mount®, Brasil). Após a montagem das lamínulas sobre as lâminas, estas foram visualizadas em microscópio óptico Nikon Eclipse E200 (Nikon, Japão). Cinco campos microscópicos (400x) aleatórios foram fotografados com o auxílio de câmera digital acoplada ao microscópio e do software Motic Image Plus 2.0 (Motic®, Canadá). Por meio do programa Image Processing and Analysis in Java (ImageJ®, National Institutes of Health, EUA), foram quantificadas as células invasoras presentes nos campos fotografados.