Ensaios para dosagem de citocinas e óxido nítrico

Placas de Elisa (Costar Cambridge, MA, USA) foram sensibilizadas com 50 μL/poços de anticorpo monoclonal de captura diluído em tampão carbonato pH 9,6, incubadas por 3 horas à temperatura ambiente e bloqueadas com 150 μL/poços de uma solução de PBST + 1% de soro albumina bovina (SAB-Sigma Chemical, St; Louis, Mo). Após o bloqueio, as placas foram lavadas 3 vezes em PBS + 0,05% de tween 20 (PBST) e, em seguida, adicionos 50 μL/poços de meio RPMI + 2% nas duas primeiras fileiras, onde foram diluídas, na razão 1:2, os padrões de IL-2, IFN-γ, IL-10 eIL-4. Nas fileiras seguintes, as amostras foram distribuídas e diluídas. As placas foram incubadas por 18 horas, a 4 °C; após a incubação, foram lavadas 3 vezes em PBST e 50 μL/poços do segundo anticorpo diluído em PBST + 0,1% de SAB foram adicionados, seguido de incubação por 1 hora, à temperatura ambiente. Foram feitas mais 3 lavagens em PBST e 75 μL/poços do conjugado enzimático diluído em PBST + 0,1% de SAB, foram adicionados às placas. Em seguida, elas foram incubadas por 1 hora. A reação foi revelada, após novo ciclo de lavagens, com 100 μL/poços do substrato contendo ácido cítrico 0,1M, fosfato de sódio 0,2M, água destilada, cromógeno ABTS (-2,2 azino-bis(3- ethylbenzethiazoline-6 sulfonic acid) Sigma) e água oxigenada 30% (Sigma). A reação foi bloqueada com ácido cítrico 0,2M e a leitura feita em leitor de ELISA (Dynatech MR 5000) a 410 nm.

Para dosagem de IL-2, as placas foram sensibilizadas com 4 ng/mL do anticorpo monoclonal anti-IL-2 (1 A 12) e o 2° anticorpo monoclonal biotinilado anti-IL- 2 (5H4) a 2 μg/ mL foi adicionado, após a incubação das amostras e padrão.

Para dosagem de IFN-γ, o primeiro anticorpo monoclonal anti-IFN- γ (XMG 1.2) foi utilizado na concentração de 4 μg/mL e o 2° anticorpo monoclonal biotinilado (AN18) na concentração de 2 μg/mL.

Para dosagens de IL-10, o primeiro anticorpo monoclonal anti-IL-10 (C252-2 A5) foi utilizado na concentração de 8 μg/mL e o 2° anticorpo monoclonal biotinilado (SXC-1) na concentração de 0,5 μg/mL.

As curvas padrão usadas para calcular as quantidades das citocinas foram obtidas com concentração de 0,44 a 14 ng de IL-2 recombinante/mL; 0,78 a 25 ng de IFN-γ recombinante/mL e 0,156 a 5 ng de IL-10 recombinate/mL.

Para dosagem de óxido nítrico foi utilizado o método colorimétrico de Griess, mede indiretamente a produção de NO pela determinação de nitrito acumulado no sobrenadante de cultura. Limiar de sensibilidade do teste 1,56 μM/mL.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1 2 3 4 5 6

Tempo (h)

V

o

lu

m

e

do Edem

a

(m

L

)

controle Theviridosídeo (100 mg/kg) Extrato Aquoso (200 mg/kg)

Gráfico 1 - Ensaio de teste in vivo, através de edema de pata de rato, por carragenina 1% IP, com p< 0,05 quando comparados ao grupo controle.

O theviridosídeo (100 mg/kg) apresentou atividade anti-edematogênica estatisticamente significativa, entre 5 e 6 horas nas condições utilizadas, administrado posteriormente ao agente flogístico com 77, 90% de inibição com um intervalo de 95% de confiança (cf. Gráfico 1).

Na dose de 100 µg/mL, nem o theviridoside nem seu derivado peroxidado foram capazes de estimular as citocinas (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN), bem como o Óxido Nítrico.

7 CONCLUSÃO

Das raízes de L. alba forneceram 3 iridóides (theviridosídeo, mussaenosídeo e gardosídeo), que foram caracterizados por bases químicas, estudos espectroscópicos e comparação com dados da literatura. O theviridosídeo e o mussaenosídeo são aqui descrito pela primeira vez nas raízes da espécie e o gardosídeo ainda inédito no gênero.

A quimiotipia do vegetal em estudo pode ser considerada citralífera de acordo com Julião et al., 2003, porém devido a considerável quantidade de cis-verbenol, como segundo grupo majoritário, induz a se pensar em uma nova variante para esse quimiotipo.

Devido à pequena aromaticidade das raízes, os compostos voláteis apresentaram-se discretos em relação aos das folhas, porém não foi observado em nenhuma base de dados os compostos voláteis das raízes de Lippia alba. Carvona, éster metílico do ácido hexadecanóico, patchoulano e limoneno foram os compostos evidenciados nas raízes.

Quanto a toxicidade do EAQ apresentou-se moderadamente tóxico, com uma DL50 de 1156,25 mg/kg. Os animais apresentaram durante o ensaio intensas contorções

abdominais, excreção fecal, movimentos circulares, piloerecao, movimento estereotipado, ereção de cauda e espasmos.

O extrato aquoso não apresentou atividade frente os microorganismos testados.

O theviridosídeo apresentou uma atividade antiinflamatória de 77,90% através de Indução do Edema de pata de rato por carragenina 1% com intervalo de confiança de 95% (p < 0,05).

O teste in vitro de estimulação das citocinas (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN- γ). Na dose de 100 µg/mL, nem o theviridoside nem seu derivado peroxidado foram capazes de estimular as citocinas, bem como o Óxido Nítrico (NO). Mediadores (prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos), estão possivelmente envolvidos com as atividades constatadas.

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