Iridóides glicosilados das raízes de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae): obtenção, caracterização e bioatividade

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. IRIDÓIDES GLICOSILADOS DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA (MILL.) N.E. BROWN (VERBENACEAE): OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E BIOATIVIDADE. JOSE GUEDES DE SENA FILHO. RECIFE, 2007.

(2) José Guedes de Sena Filho. IRIDÓIDES GLICOSILADOS DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA (MILL.) N.E. BROWN (VERBENACEAE): OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E BIOATIVIDADE. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, do Departamento de Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas na Área de Química de Produtos Naturais.. Orientador: Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier. Recife-PE, 2007.

(3) Sena Filho, José Guedes de Iridóides glicosilados das raízes de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae): obtenção, caracterização e bioatividade / José Guedes de Sena Filho. – Recife : O Autor, 2007. 61 folhas : il., fig., tab., gráf. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2007. Inclui bibliografia e apêndice. 1. Iridóides glicosilados – Lippia alba. 2. Iridóides glicosilados – Bioatividade. I. Título. 615.322 615.321. CDU (2.ed.) CDD (22.ed.). UFPE CCS2007-07.

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(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO. REITOR Amaro Henrique Pessoa Lins. VICE-REITOR Gilson Edmar Gonçalves e Silva. PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Celso Pinto de Melo. DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE José Thadeu Pinheiro. VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros. CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Jane Sheila Higino. VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Samuel Daniel de Sousa. COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Pedro José Rolim Neto. VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Beate Saegesser Santos.

(6) A minha esposa Veruschka Esther Leal Maranhão Guedes de Sena Dedico.

(7) “One of the great achievements of chemistry has been to show that all the matter in the world, be it a lump of rock, a glass of water, an ostrich feather, or a tree, is built from no more than a hundred or so simple substances called chemical elements” Peter Atkins.

(8) AGRADECIMENTOS A Deus, em primeiro lugar, por ter me dado a oportunidade de realizar este trabalho. A minha mãe Eronides Apolinário pelo intenso apoio em todos os sentidos, ao meu Pai José Guedes de Sena e aos meus irmãos Victor e Danillo Apolinário. Ao significado da palavra Orientar, agradeço de forma honrosa ao meu orientador Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier por tudo. Aos tios que me apoiaram nessa caminhada, principalmente Tio Romildo, Tia Penha, Tia Iraíde, Tio Zé Canela (i.m.), Tio Arimatéia, Tia Aparecida, Tia Lurdes (i.m.) e aos primos: Deise, Romeu, Flávia, Júlio, Neto, Camilla e Juliana Apolinário, Nathalie Sena. AOS AMIGOS Ademário, Clébio, Cristiane, Elis, Elis Pena, Evani Araújo, Flávio Valadares, Janaína, Jaqueline, Jovita Braga, Teógenes, Karina Randau, Késia Pontual, Laurimar, Luciana Ramos, Marcos e Vandessa. À Hildegard Wehner pela longa amizade e colaboração na língua germânica. A Daniel Uchôa, da Universidade do Ceará. À Drª. Jennifer Duringer da Oregon State Universtity-USA. AOS PROFESSORES Prof. Dra. Ivone Antônia de Souza; Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho; Prof. Dr. Raimundo Brás Filho; Prof. Dra.Valdênia Costa INSTITUIÇÕES Universidade Federal de Pernambuco - UFPE Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – IPA Universidade Federal da Paraíba – UFPB Universidade Federal do Ceará - UFCE Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF Oregon State University - USA Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, A todos que contribuíram para conclusão deste trabalho. OBRIGADO!.

(9) SUMÁRIO. LISTA DE ABREVIATURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE GRÁFICOS RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO. 15. 2. OBJETIVOS. 22. 2.1. GERAL. 22. 2.2. ESPECÍFICOS. 22. 3.0 CAPÍTULO I: ESTUDO FITOQUIMICO DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA 3.1 MATERIAL VEGETAL. 23. 3.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS. 23. 3.3 DROGAS E REAGENTES UTILIZADOS. 24. 3.4 EQUIPAMENTOS. 25. 3.5 OUTROS. 26. 3.6 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA (Perfil Fitoquímico) 3.6.1 Metodologia Utilizada. 26. 3.6.2 Resultados do Perfil Fitoquímico. 28. 3.7 CARACTERIZAÇÃO DOS TERPENOS NAS FOLHAS E RAÍZES 3.7.1 Análise Cromatográfica (CG/EM). 28. 3.7.2 Identificação dos Compostos Químicos. 28. 3.7.3 Resultados dos terpenos pelo cromatógrafo a gás. 28. 3.7.3.1 Análise da Quimiotipia. 31. 23. 26. 28.

(10) 3.7.3.2 Análise das raízes. 33. 3.8 EXTRAÇÃO E ISOLAMENTO METABÓLITOS SECUNDÁRIOS 3.9 ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS 3.9.1 Estrutura do Composto Lp1, Lp2 e Lp3. 34. 4.0 CAPÍTULO II: AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50 DO EAQ 4.1 METODOLOGIA. 40. 4.2 RESULTADOS. 41. 4.2.1 Avaliação da Toxicidade Aguda e Determinação da DL50 do EAQ 5.0 CAPITULO III: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA 5.1 MATERIAIS E MÉTODOS. 41. 5.1.1 Microorganismos Utilizados. 46. 5.1.2 Técnica de Difusão em poços. 46. 5.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO. 46. 6.0 CAPITULO IV: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA E IMUNOREGULADORA 6.1 INTRODUÇÃO. 49. 6.2 METODOLOGIA. 49. 6.2.1 Animais. 49. 6.2.2 Edema de pata induzido por carragenina. 50. 6.2.3 Tratamento dos animais. 50. 6.2.4 Procedimentos para Preparação dos produtos de peroxidação do iridóide 6.2.5 Obtenção de sobrenadantes de culturas de células de baço para dosagem de citocinas e óxido nítrico 6.2.6 Ensaios para dosagem de citocinas e óxido nítrico. 50. 6.3 RESULTADOS. 54. 7.0 CONCLUSÃO. 55. 8.0 REFERÊNCIAS. 56. 37 37. 40. 46 46. 49. 51 52.

(11) LISTA DE ABREVIATURAS (-) – Negativo (+) – Positivo ATCC- American Type Culture Collection 2D – Segunda dimensão AcOEt – Acetato de etila AcOH – Ácido acético CCD – Cromatografia em camada delgada DL50 - dose letal para 50% dos animais EEA – Extrato Acetato de Etila ELISA- Enzyme linked Immunosorbent Assay (ensaio imunoenzimático) EME – Extrato Metanólico CG/EM – cromatógrafo a Gás acoplado com espectro de massa HE – Extrato Hexânico IL- citocinas i.p. – via intraperitoneal IPA – Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária min. – Minuto Me2CO – Acetona MeOH – Metanol RMN – Ressonância magnética nuclear 1 H – RMN de hidrogênio 13 C – RMN de Carbono 13 s – singleto d – dubleto m – multipleto dl – dubleto longo DMSO-d6 – Dimetilsulfóxido deuterado COSY – Correlated Spectroscopy HMBC – Heteronuclear Multi Bond Correlation HMQC – Heteronuclear Multi Quantun Correlation DEPT – Distortionless Enhacement Polarization Transfer. MH- Müller Hinton MIC – Concentração Inibitória Mínima NO- Óxido Nítrico NT- Não testadas ppm – partes por milhão p/v – peso/volume Rf – Fator de Retenção seg. – segundo ss – erro padrão U.V. – Ultravioleta v.o. - Via Oral v/v – volume/volume P< - Intervalo de Confiança uma – Unidade de Massa Atomica PBS- Phosphate buffered saline ( solução tamponada com fosfato) PBST- Solução de Salina tamponada com fosfato a 0,05% de Tween 20 SAB- Soro albumina bovina OBSERVAÇÃO: As abreviaturas utilizadas neste trabalho e que não constam desta relação, encontram-se descritas como convenções adotadas.

(12) LISTA DE TABELAS TABELA 1: CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS PARA O SCREENING FITOQUÍMICO .......... 27 TABELA 2: TERPENÓIDES CARACTERIZADOS DAS FOLHAS DE LIPPIA ALBA ATRAVÉS DE GC-MS.......................................................................................................................................... 30 TABELA 3:TERPENÓIDES CARACTERIZADOS DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA ATRAVÉS DO GC-MS.......................................................................................................................................... 31 TABLE 4: HMQC E HMBC DO THEVIRIDOSÍDEO ISOLADO....................................................... 38 TABELA 5: HMBC DO GARDOSÍDEO E MUSSAENOSÍDEO ISOLADO...................................... 39 TABELA 6: EFEITOS TOXICOLÓGICOS RELACIONADOS ÀS DOSES ADMINISTRADAS NA FASE PRELIMINAR DA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50........................................................................................................................................ 42 TABELA 7: EFEITOS TOXICOLÓGICOS RELACIONADOS ÀS DOSES ADMINISTRADAS NA FASE DEFINITIVA DA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50. ............................................................................................................................................. 43 TABELA 8: RELAÇÃO LETALIDADE E DOSE ADMINISTRADA NA FASE PRELIMINAR DA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50. .......................... 44 TABLE 9: RELAÇÃO LETALIDADE E DOSE ADMINISTRADA NA FASE DEFINITIVA DA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50. .......................... 44 TABELA 10: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS EXTRATOS ACETATO DE ETILA, METANOL E ÁGUA DE L. ALBA .............................................................................................. 47 TABELA 11:CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (MIC) EXIBIDA PELOS EXTRATOS EEA E EME.................................................................................................................................. 48.

(13) Lista de Figuras FIGURA 1: IRIDODIAL E IRIDOMIMERCINA ................................................................................. 15 FIGURA 2 - ESTRUTURA DO PLUMIERÍDEO................................................................................ 16 FIGURA 3 - ORGANOGRAMA REPRESENTANDO AS DIVISÕES DOS IRIDÓIDES EM RELAÇÃO AO NÚMERO DE ÁTOMOS DE CARBONO. ....................................................... 16 FIGURE 4 - ESTRUTURA DA NEPETALACTONA (I) E DO NEPETALACTOL (II).................... 17 FIGURA 5 - INFLORESCÊNCIAS DE LIPPIA ALBA (MILL.) N.E. BROWN.................................. 18 FIGURA 6 - INFLORESCÊNCIA JOVEM E INFLORESCÊNCIA ADULTA COM BRÁCTEAS EM LIPPIA ALBA................................................................................................................................ 19 FIGURA 7 - HABITAT DA LIPPIA ALBA .......................................................................................... 20 FIGURA 8 - REPRODUÇÃO DAS PARTES AÉREAS DE LIPPIA ALBA (MILL.) N. E. BROWN. 21 FIGURA 9 - ORGANOGRAMA DO MÉTODO EXTRATIVO........................................................... 24 FIGURA 10 - PRINCIPAIS CONSTITUINTES VOLÁTEIS DAS FOLHAS DA ESPÉCIE EM ESTUDO....................................................................................................................................... 32 FIGURA 11- PRINCIPAIS CONSTITUINTES VOLÁTEIS DAS RAÍZES DA ESPÉCIE EM ESTUDO....................................................................................................................................... 33 FIGURA 12: CROMATOGRAMAS DE FRAÇÕES DA COLUNA EM SÍLICA, UTILIZANDO ACOET E MEOH (80:20) COMO ELUENTE............................................................................. 35 FIGURA 13:CROMATOGRAMA CONTENDO OS 3 IRIDÓIDES ISOLADOS ............................... 36 FIGURA 14: THEVIRIDOSÍDEO (I) E PADRÃO DE RHAMNOSE E GALACTOSE (II) ............... 36 FIGURA 15 - ESTRUTURA QUÍMICA DO THEVIRIDOSÍDEO (I) ................................................. 38 FIGURA 16 - ESTRUTURA QUÍMICA DO GARDOSÍDEO (II) E MUSSAENOSÍDEO (III) RESPECTIVAMENTE................................................................................................................. 39 FIGURA 17: CURVA DOSE-RESPOSTA DA TOXICIDADE DO EXTRATO AQUOSO DE LIPPIA ALBA (MILL.) N.E. BROWN. ..................................................................................................... 45 FIGURA 18: TRATAMENTO COM O METAPERIODATO: O PONTO 1 THEVIRIDOSIDEO ISOLADO, O PONTO 2 CORRESPONDE A FRAÇÃO ACETÔNICA E O PONTO 3 A FRAÇÃO AQUOSA DA COLUNA EM CARVÃO ATIVADO.....................................................................................................................................51.

(14) LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1: ENSAIO DE TESTE IN VIVO, ATRAVÉS DE EDEMA DE PATA DE RATO, POR CARRAGENINA 1 % IP, COM P< 0,05 QUANDO COMPARADOS AO GRUPO CONTROLE. ................................................................................................................................ 53.

(15) RESUMO O presente trabalho tem como foco a obtenção, caracterização e determinação da bioatividade dos iridóides glicosilados presentes nas raízes de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown, bem como a averiguação da quimiotipia da espécie em estudo. Trata-se de uma planta com marcante aplicação na medicina tradicional de nosso país onde é conhecida. por. “erva-cidreira”,. “chá-do-tabuleiro”,. “erva-cidreira-de-arbusto”,. “alecrim-selvagem”, “cidreira-brava” entre outros. De suas raízes foram isolados e caracterizados 3 iridóides: theviridosídeo, mussaenosídeo e gardosídeo, sendo o primeiro e o segundo descritos pela primeira vez nas raízes e o terceiro pela primeira vez no gênero. A quimiotipia foi definida como citralífera (19,08%), contudo a presença de cis-verbenol, também em razoável concentração (9,73%), induz a se pensar como uma nova variante para esse quimiotipo. Em adição, a análise dos terpenos menores das raízes (CG/EM) revelou a existência de: limoneno, carvona, o éster metílico do ácido hexadecanóico e patchoulano, ainda sem registros literários. O extrato aquoso (EAQ) não apresentou atividade antimicrobiana. A DL50 encontrada foi de 1156,25 mg.kg-1, onde foi observada intensas contorções abdominais, excreção fecal e movimento estereotipado. O extrato acetato de etila (EEA) e o extrato metanólico (EME) apresentaram resultados discretos contra os microorganismos: Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e Klebsiella pneumonia (ATCC 10031). O EAQ e o theviridosídeo foram observados no teste de carragenina a 1%, onde apresentou dados estatisticamente significativos com 77,90% (p<0,05) de inibição, quando comparado com o controle. Preliminarmente, a capacidade imunorreguladora de tais iridóides e produtos de sua peroxidação foi testada pela estimulação, in vitro, de células esplênicas murinas. Na dose de 100 μg/mL, estes compostos não foram capazes induzir a produção de IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10 ou óxido nítrico por estas células linfóides.. Palavras-chave: Lippia alba, Verbenaceae, iridóides glicosilados, quimiotipos,.

(16) ABSTRACT. The present work focuses the isolation, characterization and bioactivity, of iridoids glucosides from the roots of Lippia alba (Mill.) N. E. Brown, as well as the chemotype evaluation. It’s a notable plant in the traditional medicine in our country, where it is known as “erva-cidreira”, “chá-do-tabuleiro”, “erva-cidreira-de-arbusto”, “alecrimselvagem”, “cidreira-brava” and others. It was isolated and characterized 3 iridoids: theviridoside, mussaenoside e gardoside from the roots of such plant. The fists two are being described in the literature, for the first time in the roots, the third one for the first time in the Lippia genus. The chemotype was defined as “citralífera” due to major compound found citral (19.08%), therefore the presence of cis-verbenol in high concentration (9.73%) could be associated in a new derivate of this chemotype. In addition, the analyses of the minor terpenes from the roots (GC/MS) afford the existence of: limonene, carvone, 9-hexadecenoic acid methyl ester, and patchoulene, without literature data base. The Aqueous Extract (EAQ) did not present antimicrobial activity. The LD50 was 1156 mg/kg, moreover were observed fecal excretion, abdomens contortions and others. The ethyl acetate (EEA) and methanolic extract (EME) were modest against the microorganism tested: Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) and Klebsiella pneumonia (ATCC 10031). The EAQ and theviridoside were tested by carrageenan – induced rats paw edema, in which presented 77.90% (p<0.05) of inhibition comparable with the control. The immunologic evaluation in vitro front of 4 cytokines (IL-4, IL-10, IFN-g and IL-2) and nitric oxide were tested in theviridoside and its periodate oxidation product. Any stimulation of those cytokines weren’t observed in both substances, by linphoids cell. Key words: Lippia alba, Verbenaceae, iridoids glucoside, chemotype.

(17) 15. 1 INTRODUÇÃO Iridóides glicosilados são produtos do metabolismo secundário de alguns grupos vegetais e suas agliconas monoterpênicas são invariavelmente oxigenadas, com uma característica fusão do anel ciclopentapirano (COSSY, 1989; HARBORNE, 1998). Eles derivam formalmente do iridoidial, substância que ao lado da iridomirmecina (Figura 1) foram pela primeira vez descritos no final do século XIX na secreção de defesa da formiga australiana Iridomyrmex detectus. Somente a partir de 1958, com os trabalhos de O. Halpern e H. Schmid sobre a estrutura do plumierídio (Figura 2), foi que o esqueleto molecular dos iridóides começou a ser mais compreendido (El-NAGGAR, 1980).. Di-aldeído. Enol-hemiacetálico. iridomirmecina. Figura 1: Iridodial e Iridomirmecina. Originalmente este grupo de substâncias era chamado de pseudoindican, uma alusão ao glicosídeo precursor do índigo e existente em alguns representantes de Indigofera (Fabaceae). De fato sob a influência de ácidos ou enzimas agliconas de iridóides sofrem condensações originando derivados coloridos (El-NAGGAR, 1980; HEGNAUER, 1973)..

(18) 16. O. O. CH3. H H O. O O. H HO. H3C. OH H. O O OH OH OH. Figura 2 - Estrutura do plumierídeo. De acordo com número de átomos de Carbono a estrutura fundamental dos iridóides pode ser dividida em C10-iridóides, C9-iridoides e C8 iridóides. O organograma da Figura 3 resume as principais divisões estruturais dos iridóides (SANTOS, 2001).. Iridóides. C-10 iridóides. C-9 iridóides (perda do C-10 ou do C-11). C-8 (perda do C-10 e do C-11). 8-β-C-iridóides. 8-α-C-iridóides (8-epi-série). Figura 3 - Organograma representando as divisões dos iridóides em relação ao número de átomos de carbono..

(19) 17. Iridóides, por serem amargos ou venenosos, desempenham no vegetal um papel de proteção contra predadores, principalmente herbívoros (HEGNAUER, KOOIMAN, 1978). Algumas aplicabilidades foram descobertas com iridóides como, por exemplo: a nepetalactona (Figura 4) nos Estados Unidos encontrou duas aplicações, a primeira no desenvolvimento de brinquedos para gatos domésticos (Felix catus) a segunda incorporada à isca para a caça ao puma (Felix concolor). Encontradas na Lamiaceae Nepeta cataria L. ∗ (BEAUPIN, 1978), algumas agliconas de iridóides têm se mostrado importantes agentes de sinalização sensoriais para diversas espécies de insetos, como por exemplo, o feromônio de atração sexual de Megoura viciae, inseto onde os machos liberam para atração das fêmeas uma mistura de Nepetalactona e Nepetalactol ∗∗ (DAWSON et al., 1987). O. H3C. H3C. OH. O. CH3. O. I. CH3. II. Figura 4 - Estrutura da Nepetalactona (I) e do Nepetalactol (II). Inúmeras publicações demonstram as propriedades biológicas presente nos iridóides como: antiviral, antimicrobiana, antitumoral, hemodinâmica, colerética, vasocontrictora, hepatoprotetora e antiinflamatória. (TAKEDA et al., 1980; ISHIGURO et al., 1988; HOUGHTON et al., 1989; BRESCHI et al., 1992; RECIO et al., 1994; KAPADIA et al., 1996; BERMEJO et al., 2002). Nos vegetais os iridóides apresentam uma pronunciada distribuição em angiospermas. notadamente. nas. Lamiaceae,. Verbenaceae,. Scrophulariaceae. e. Plantaginaceae (HARBORNE, 1998). Sendo não raro, utilizados como marcadores taxonômicos a níveis de gênero e subgênero (RIMPLER & SAUERBIER, 1986). Dentre as Verbenaceae brasileiras, a Lippia alba também conhecida como Lippia geminata HBK ou Lantana alba Mill. (PIO CORREA, 1984), de há muito tem merecido destaque na ∗. Nepeta cataria (Lamiaceae), conhecida na Europa como ervas dos gatos, produz alto teor de nepetalactona (70-90%) em seus óleos essenciais. Nos Estados Unidos e Canadá é conhecida como Catnip. ∗∗ Esse ferohormônio sexual age sinergicamente, pois em ensaios com os compostos isolados não foi demostrada nenhuma atividade..

(20) 18. medicina tradicional, onde é conhecida vulgarmente conhecida como erva-cidreira, chá do tabuleiro, erva-cidreira de arbusto, alecrim-selvagem, cidreira-brava, falsa-melissa, cidreira-carmelita, salva-do-Brasil, salvia, salva-brava, salsa-limão etc. (BRAGA, 1976; MATOS, 1996). Empregando-se infusos ou decoctos de suas folhas para o tratamento de desordens gastrintestinais, disenterias, febre, tosse, asma e como tranqüilizante (LORENZI, 2002; VALE, 1999). Como outras espécies de Lippia, trata-se de um planta arbustiva chegando a atingir até 3 m de altura (STASHENKO, 2004), possue caule e ramos primários, longos, quadrangulares, ascendentes, pubescentes, folhas pecioladas, alternas ou opostas; flores pequenas; cálice curto pubescente e bipartido; corola violácea com lábio inferior maior que superior; fruto são drupas globosas de cor róseo-arroxeada; sementes pequenas de distribuição pantropical (CAMARGO, 1998; LORENZI, 2002). As inflorescências em Lippia são complexas, do tipo politélico (Figuras 5 e 6). São espigas bracteoladas, cilíndricas e na maioria das espécies capituliformes, como ocorre na espécie em estudo.. Figura 5 - Inflorescências de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown. ( Foto: Jose Guedes de Sena Filho, 2006). As flores são desprovidas de bractéolas. As brácteas geralmente são planas e dispostas em várias séries (Figuras 7 e 8). Na secção Goniostachyum são côncavas e imbricado-decusadas, às vezes, soldadas entre si. Na maioria dos casos são verdes e menores que as flores, enquanto na secção Rhodolippia são rosadas e maior que as flores (DE ROMERO, 1998)..

(21) 19. Figura 6 - Inflorescência jovem e inflorescência adulta com brácteas em Lippia alba. (Foto: Jose Guedes de Sena Filho, 2006). Uma grande diversidade tem sido observada na composição dos óleos essenciais de L. alba, dependendo da parte da planta, o estágio de desenvolvimento, localização geográfica, característica de solo, clima e outras condições (ALEA, 1996; STASHENKO, 2004). O conteúdo de seus óleos essenciais é bem diversificado ocorrendo, no entanto, uma certa constância e teor mais pronunciado de alguns compostos presentes, sugerindose a existencia de alguns quimiotipos, separados por seus elementos predominantes: 1,8cineol, carvona, diidrocarvona, terpineno, limoneno, citral, cânfora, d,l-limoneno, piperitona, β-cariofileno e linalol (TAVARES, 2005). A atividade antiulcerogênica do extrato aquoso das partes aéreas da L. alba resultou em uma inibição de 76,98%, com intervalo de confiança de 97% (p < 0,01), mas não modificou o pH gástrico e acidez total, onde a ranitidina utilizada como padrão reduz significativamente estes parâmetros (PASCUAL, 2001). Revisando a literatura pertinente, observamos que predominantemente as partes aéreas sempre foram muito empregadas seja do ponto vista da utilização popular seja do ponto de vista de estudo científicos. Havendo uma grande vacância no tocante as raízes..

(22) 20. Figura 7 - Habitat da Lippia alba. (Foto: Jose Guedes de Sena Filho, 2006).

(23) 21. Figura 8 - Reprodução das partes aéreas de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown, Onde A: aspecto geral do ramo florido; B: folha; C: botão floral; D: inflorescência; E: brácteas adultas; F: corola..

(24) 22. 2. OBJETIVOS 2.1 GERAL Efetuar o estudo fitoquímico das raízes Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, bem como a bioatividade de extratos obtidos com solventes de polaridades diferentes e de moléculas isoladas.. 2.2 ESPECÍFICOS 9 Efetuar uma prospecção fitoquímica de extratos (diferentes polaridades) da raiz, evidenciando os principais grupos de substâncias presentes; 9 Determinar a quimiotipia da espécie em estudo. Extrair, isolar e purificar metabólitos secundários das raízes espécie em estudo; 9 Caracterizar estruturalmente os metabólitos secundários isolados; 9 Averiguar a toxicidade aguda, através do teste de efeitos gerais e determinar a DL50 do resíduo de extrato bruto aquoso das raízes do vegetal; 9 Avaliar a atividade antimicrobiana de extratos brutos de diversas polaridas das raízes de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown. 9 Avaliar a atividade antiinflamatória do extrato bruto aquoso das raízes de Lippia alba e de componentes majoritário na referida espécie. 9 Analisar a estimulação das citocinas (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN) através de ELISA e Óxido nítrico (NO) pelo método Griess em células esplênicas murinas..

(25) 23. 3. CAPÍTULO I ESTUDO FITOQUÍMICO DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA. 3.1 MATERIAL VEGETAL Os materiais vegetais utilizados nos estudos farmacoquímicos (folhas e raízes de Lippia alba) foram coletados em janeiro de 2005, no município de Timbaúba, Zona da Mata Norte (7º35’S; 35º22’W), Estado de Pernambuco, de exemplares em plena floração. Após a coleta, parte do material foi destinada à preparação da exsicata, identificada pela Profa. Dra. Rita de Cássia Pereira curadoura do herbário Dárdano de Andrade Lima, da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – IPA, onde um exemplar encontra-se depositado sob o número 70003.. 3.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS Raízes trituradas (62,76 g), foram submetidas a extração por maceração 48 h com aumento progressivo de polaridade, empregando-se n-Hexâno (HE), Acetato de Etila (EEA), Metanol (EME) e Água destilada (EAQ), obtendo-se os respectivos extratos e rendimentos HE (1,6%), EEA (1,44%), EME (2,24%) e EAQ (3,22%). Os Solventes foram eliminados a vácuo (Figura 9)..

(26) 24. DESPRESADO Figura 9 - Organograma do método extrativo. 3.3 DROGAS E REAGENTES UTILIZADOS ♦ Ácido gálico P.A. (MERCK) ♦ β - Amirina P.A. (MERCK) ♦ β - Sitosterol P.A. (MERCK) ♦ Glicose (MERCK) ♦ Galactose (MERCK) ♦ Rhamnose (MERCK) ♦ Acetato de etila P.A. (MERCK) ♦ Acetona P.A. (REAGEN) ♦ Ácido acético P.A. (MERCK) ♦ Ácido clorídrico P.A. (REAGEN) ♦ Ácido fórmico P.A. (MERCK) ♦ Ácido sulfúrico P.A. (MERCK) ♦ Água destilada P.A. (MERCK).

(27) 25. ♦ N-Hexano P.A (MERCK) ♦ Propanol P. A. (MERCK) ♦ Anidrido acético P.A. (MERCK) ♦ Anisaldeído (FLUKA) ♦ Benzeno P.A. (MERCK) ♦ Butanol P.A. (MERCK) ♦ Cloreto de 2,3,5, trifeniltetrazólio P.A. (MERCK) ♦ Clorofórmio P.A. (MERCK) ♦ D (+) – glicose P.A. (MERCK) ♦ Difenil Boriloxietilamina P.A. (FLUKA) ♦ Éter P.A. (MERCK) ♦ Formol P.A. (MERCK) ♦ Metanol P.A. (MERCK); ♦ Saponina (MERCK) ♦ Tampão fosfato pH = 5 P.A. (MERCK); ♦ Tolueno P.A. (MERCK); ♦ Vanilina P.A. (CARLO ERBA); ♦ Metaperiodato de Sódio (MERCK) ♦ (-) catequina. 3.4 EQUIPAMENTOS ♦ Balança eletrônica semi-analítica GEHAKA mod. BG 1000; ♦ Balança analítica GEHAKA mod. ♦ Bomba de vácuo; ♦ Câmara fotográfica Nikon Coolpix 7900; ♦ Câmara fotográfica Nikon SLR D50 ♦ Câmara Ultra-violeta (250 - 365 nm) CHOMATO VUE; ♦ Espectrofotômetro de ressonância BRUKER (DRX 500) 13C RMN (125 MHz); ♦ Espectrofotômetro de ressonância Varian Unity Plus 300 13C RMN (75 MHz); ♦ Espectrofotômetro de ressonância BRUKER (DRX 500) 1HRMN (500 MHz);.

(28) 26. ♦ Espectrofotômetro de ressonância Varian Unity Plus 300 1H RMN (300MHz); ♦ Estufa Precision Thelco Model 18; ♦ Multiprocessador ARNO; ♦ Rotavapor BUCHI INSTRUMENTS 5060 – CV.. 3.5 OUTROS ♦. Borrifadores para revelação em CCD;. ♦. Colunas cromatográficas;. ♦. Cubas cromatográficas para CCD;. ♦. Filmagem digital (Nikon Coolpix 7900);. ♦. Gel de sílica 70 – 230 Mesch MERCK;. ♦. Placas cromatográficas MERCK Art. 015533;. ♦. Sephadex LH-20, Pharmacia Chemicals;. ♦. Tubos de ensaio;. ♦. Capilares de 5 e 10 µL. 3.6 ABORDAGEM FITOQUÍMICA DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA (Perfil Fitoquímico). 3.6.1 Metodologia Utilizada Aplicaram-se alíquotas de 10 μL de EEA, EME e EAQ em diversas placas cromatográficas prontas de gel de sílica (Merck-Alemanha, art. 105554), empregando-se para obtenção dos cromatogramas diferentes fases móveis e reagentes adequados à caracterização das classes de substâncias a serem pesquisadas (ver Tabela 1). Esta prospecção fitoquímica coloca em evidência os principais tipos de metabólitos secundários: alcalóides, terpenóides (monoterpenóides, sesquiterpenóides, diterpenóides, triterpenóides, esteróides, iridóides e saponósidos), polifenóis (cumarinas, derivados cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, flavonóides, proantocianidinas e taninos gálicos) e açúcares redutores..

(29) 27. Tabela 1: Condições Cromatográficas para o Screening Fitoquímico. Alcalóides. A. Dragendorff. (WAGNER & BLADT, 1996). Monoterpenos, Sesquiterpenos e diterpenos. B. Vanilina sulfúrica. (WAGNER & BLADT, 1996). Triterpenos / esteróides. C. Lieberman / Burchard. (HARBORNE, 1998). Iridóides. A. Vanilina sulfúrica. (WAGNER & BLADT, 1996). Saponinas. A. Anisaldeído. (WAGNER & BLADT, 1996). Açúcares. D. 2,3,5 Trifeniltetrazólio. (WALLENFELS, 1950). (cloreto) Cumarinas. E. UV. (WAGNER & BLADT, 1996). Ácido gálico. A. Alumén de ferro 1%. (STIASY, 1911). Flavonóides. A. Difenil borinato de 2. (MARKHAN, 1982). aminoetila. (NEU, 1956). Difenil borinato de 2. (WAGNER & BLADT,. aminoetila. 1996). A. Vanilina clorídrica. (ROBERTSON , 1955). A. Alumén de ferro 1%. (STIASY, 1911). Fenilpropanoglicosídeos. Proantocianidinas condensadas,. A. leucoantocianidinas Taninos gálicos. A-AcOEt – HCOOH – AcOH – H2O (100 : 11 : 11 : 26 v/v) B-Benzeno – AcOEt (97: 3 v/v) C- EtOAc – HCOOH – AcOH – H2O (100 : 0,5 : 0,5 : 0,5 v/v) D- n-BuOH-Me2CO-Tampão fosfato pH = 5,0 (40 : 50 : 10 v/v) E- Et2O-tolueno-AcOH 10 % (50 : 50 : 50 v/v).

(30) 28. 3.6.2 Resultados do Perfil Fitoquímico Foi detectada a presença de terpenos, iridóides, fenilpropanoglicosídeos e açúcares, em contrapartida não foi evidenciada a presença de cumarinas, acido gálico, proantocianidinas, leucoantocianidinas, saponinas, flavonóides e alcalóides.. 3.7 CARACTERIZAÇÃO DOS TERPENOS NAS FOLHAS E RAÍZES Alíquotas de 100 mg dos extratos hexânicos das folhas e das raízes foram caracterizadas por cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrômetro de massas (CG/EM), a fim de determinar a quimiotipia da referida espécie, bem como averiguar os terpenos encontrados nas raízes e folhas, através do Perfil Fitoquímico (Tabela 2).. 3.7.1 Análise Cromatográfica (CG/EM) O resíduo do extrato hexânico das folhas (0,5 g) e raízes (0,5 g) foram reconstituídos com 0,5 mL de diclorometano e passada através de uma siringa-filtro de teflon (13 mm 0.22 micron) antes da injeção no cromatógrafo. A análise foi realizada utilizando-se um aparelho Perkin Elmer AutoSystem XL GS, equipado com uma autoamostra e com um injetor split-splitless, acoplado com uma coluna capilar PE-5MS em sílica fundida, contendo 5% de difenil e 95% de dimetilpolisiloxano (30 m x 0,25 mm), empregando-se a seguinte programação: 60 ºC durante 5.00 min, 60-280 ºC por 4 ºC/min, usando-se Hélio como gás carreador (0.8 ml/min). A temperatura do injetor foi de 220 ºC. As amostras (2 µl) foram injetadas usando um injetor PSSI na razão de Split (1:10). As condições do MS foram desenvolvidas através de um TurboMass Perkin Elmer com um espectrômetro de massa atualizado. A temperatura de interface foi de 200 ºC, fonte de ion 70 eV, faixa de scaner de 1.6 scans/seg e a faixa de massas de 50 a 400 uma.. 3.7.2 Identificação dos Compostos Químicos Dados qualitativos foram obtidos utilizando um TurboMass 5.1 com um programa de software (Perkin Elmer) e uma bilbioteca (Wiley NIST/EPA/NIH Mass.

(31) 29. Spectral) como base de dados 2005. Identificação dos componentes químicos foi efetuada pelo computador e correlacionada com a base de dados do espectro do banco de dados.. 3.7.3 Resultados dos terpenos pelo cromatógrafo a gás A Tabela 2 descreve os terpenos encontrados nas folhas da espécie em estudo, enquanto a Tabela 3 os terpenos encontrados nas raízes..

(32) 30. Tabela 2: Terpenóides caracterizados das folhas de Lippia alba através de CG-EM Tempo de retenção. Índice de Kovats*. Composto. Área. Porcentagem (%). 3.157. Estimado 915. ciclogeraniolano. 238915. 0.138467. 3.388. 903. 1,2,4-trimetil ciclohexano. 278460. 0.161386. 5.772. 1020. mesitileno. 2662729. 1.543227. 6.003. 1006. o-etil tolueno. 472776. 0.274005. 6.307. 1013. psi-limoneno. 1508642. 0.874358. 6.454. 1020. hemimelliteno. 5817182. 3.371441. 7.567. 1018. d-limoneno. 3715700. 2.153493. 7.693. 1079. butilciclohexano. 2933456. 1.700131. 8.491. 1445. propionato de carveol. 2700555. 1.56515. 10.644. 1085. cis-sabinol. 1416061. 0.820701. 11.988. 1133. dureno. 1833460. 1.062611. 15.012. 937. Isocamphano. 213770. 0.123894. 15.757. 1136. cis-verbenol. 16791648. 9.731869. 15.957. 1190. carvol, carvone. 6895926. 3.996644. 16.293. 1228. Cis-geraniol. 578270. 0.335146. 17.049. 1174. citral. 32923910. 19.08158. 20.535. 1342. acido nérico. 930532. 0.539305. 23.779. 1339. β-cubebeno. 296619. 0.17191. 24.903. 1440. β-farneseno. 180309. 0.104501. 24.987. 1386. (+)-Aromadendreno. 386393. 0.22394. 25.879. 1515. germacreno D. 4180741. 2.423015. 26.184. 1469. β-Eudesmeno, β-Selinino. 628726. 0.364388. 26.488. 1461. Τ-Gurjuneno. 325378. 0.188578. 26.646. 1440. α-Muuroleno. 174458. 0.10111. 26.940. 1560. Limoneno-6-ol, pivalato. 477670. 0.276841. 27.192. 1228. cis-geraniol. 95164. 0.055154. 27.297. 1344. α -cubeneno. 588533. 0.341094. 27.423. 1435. γ-cadineno. 117872. 0.068315. 29.848. 1507. Óxido de cariofileno. 1097148. 0.63587. 32.589. 1380. ledano. 64021. 0.037104. 36.285. 1393. patchouleno. 281121. 0.162928. 37.818. 4160. spheroidenona. 145685. 0.084434. * Valores são estimados utilizados da: Wiley NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library 2005..

(33) 31. Tabela 3:Terpenóides Caracterizados das raízes de Lippia alba através do CG-EM Tempo de Retenção. Composto. área. Porcentagem (%). 5.540. Índice de Kovats* 1296. benzene, (3,3-dimethyl-4-pentenyl)-. 140384. 0.717405. 5.771. 1020. psi-cumeno. 272563. 1.39288. 6.464. 1020. hemimeliteno, hemelitol. 1288059. 6.582376. 7.577. 1018. limoneno. 134412. 0.686886. 9.142. 1119. 2-etil-p-xilene. 326641. 1.669236. 9.236. 1119. Benzene, 1-etil-2,4-dimetil-. 671770. 3.43295. 9.467. 1119. 4-etil-m-xileno. 947028. 4.839603. 10.129. 1320. farnesano. 4444221. 22.71133. 10.423. 2184. retinal. 93778. 0.479234. 10.549. 1141. cumeno, m-ethyl. 240292. 1.227966. 11.999. 1133. dureno, durol. 2678960. 13.69031. 14.334. 1141. p-etil cumeno. 102147. 0.522002. 15.480. 1393. patchoulano. 1552932. 7.935958. 15.964. 1190. carvol, carvone. 1902528. 9.722501. 16.301. 1256. p-mentha-1(7),8(10)-dien-9-ol. 141161. 0.721376. 1886. éster metílico do. 3421235. 17.48356. 42.098. ácido hexadecanóico * Valores são estimados utilizados da: Wiley NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library 2005.. 3.7.3.1 Análise da Quimiotipia De acordo com os resultados encontrados no CG-EM, os principais constituintes voláteis das folhas do vegetal em estudo foram: citral, cis-verbenol, carvona e gemacrene D (Figura 10). De acordo com Matos et al. (1996), foi possível separar os óleos voláteis de Lippia alba em 3 tipos, sendo o primeiro, caracterizado por teores elevados de citral e mirceno, o segundo por altos teores de citral e limoneno e o terceiro tipo por altos teores de carvona e limoneno. Os resultados apresentados nessa análise encontram-se fora desses 3 tipos, enquanto Julião et al. (2003), classificou de acordo com o grupo majoritário. Sendo os possíveis por ele apresentado: 1,8-cineol, carvona, diidrocarvona, g-terpineno, limoneno, citral, cânfora, d,l-limoneno, piperitona, β-.

(34) 32. cariofileno e linalol, sendo assim. a quimiotipia desse vegetal em estudo pode ser. considerada citralífera, ou podendo ser enquadrada como uma variância desse quimiotipo devido ao segundo grupo majoritário: cis verbenol (9,73%) Figura 10.. O H. CH3. H3C. CH3. CH3. Citral (19,08%) CH3. O. H3C OH H3C. H3C. CH2. cis-verbenol (9,73%). Carvona (3,99%). CH3. CH2. CH3. Gemacreno D (2,42%) CH3. Figura 10 - Principais constituintes voláteis das folhas da espécie em estudo.

(35) 33. 3.7.3.2 Análise das raízes A pequena aromaticidade das substâncias presentes nas raízes, já expressa o discreto índices de componentes voláteis em relação às folhas, não constatamos na literatura nenhuma análise dos componentes voláteis das raízes do vegetal em estudo Figura 11.. CH3. Patchoulano. H3C H3C. CH3 CH3 O. Carvona H3C. CH2. CH3. H3C. CH2. Limoneno. Figura 11- Principais constituintes voláteis das raízes da espécie em estudo.

(36) 34. 3.8 EXTRAÇÃO E ISOLAMENTO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS Raízes (308 g) foram extraídas exaustivamente sob infusão metanólica (2 L) por 12 h, fornecendo 6,98 g de resíduo esverdeado. Uma alíquota deste (2,5 g) foi dissolvida em MeOH, acrescentado-se o dobro de gel de sílica Merck pra coluna (Gel de Sílica 60 para coluna cromatográfica), e após eliminação do solvente a vácuo (40 °C) a mistura foi cromatografada em coluna utilizando-se gel de sílica (Gel de Sílica 60 para coluna cromatográfica). Sendo esta iniciada com AcOEt como fase móvel, aumentando a polaridade gradativamente até AcOEt : MeOH. (4 : 1), obtendo-se 132 frações (25 mL) (Figura 12). Todas as frações foram monitoradas por cromatografia em camada delgada (placas prontas de gel de sílica Merck, Art. 105553). As frações 60-77 (figuras 12), contendo duas subtâncias, codificadas como Lp2 e Lp3 foram reunidas e após eliminação do solvente forneceram 15 mg. As frações 95-110 foram concentradas e recromatografadas em Sephadex LH-20 (Pharmacia Chemicals) empregando-se EtOH como fase móvel, obtendo-se 20 frações. As frações 13-18 apresentaram uma única substância quando analisadas por cromatografia em camada delgada (CCD), após concentração a vácuo apresentou material cristalino de etanol (55 mg) sendo codificada como Lp 1. ∗. ∗. As frações oriundas das colunas cromatográficas foram sempre monitoradas por CCD nas seguintes condições: fase estacionária (placas prontas de gel de sílica Merck, art. 105553; fase móvel: AcOEt – v:v). HCOOH – AcOH – H2O (100 : 11 : 11 : 26,.

(37) 35. Lp3. 59. 60. 61. 62. 63. 66. 64 65. 67. 68. 69. Lp2. 70. 71. 72. 73. 74. 76 77 78. 75. 79. 80 81. Lp1 88. 89. 90. 91. 92 93. 94. 95. Figura 12: Cromatogramas de frações da coluna em Sílica, utilizando AcOEt e MeOH (80:20) como eluente..

(38) 36. Mussaenosídeo Gardosídeo Theviridosídeo. Figura 13 - Cromatograma contendo os 3 iridóides isolados. 1. 2. Figura 14: Theviridoside (1) e padrão de rhamnose e galactose (2).

(39) 37. 3.9 ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS. 3.9.1 Estrutura do Composto Lp1, Lp2 e Lp3 As estruturas dos compostos foram elucidadas, verificando-se suas caracteristicas cromatográficas e parâmetros espectrais descritos na literatura, (Phytochemistry v. 30, p. 2401, 1991; Journal of Natural Products v. 48, n.6, p. 957-961, 1985) notadamente os espectros de. 1D:. 13. C-RMN (125 MHz, Bruker DRX-500. espectrômetro), 1H-RMN (500 MHz, Bruker DRX-500 espectrômetro) e 2D: COSY, HMBC, HMQC, (Tabela 4 e 5), correspondentes as substâncias: Theviridosídeo (I), Gardosídeo (II) e Mussaenosídeo (III), aqui codificadas como LP1, LP2 e LP3 respectivamente. A primeira evidencia de que essas substâncias, tratavam-se de iridóides glicosilados foi a obtenção de cromatogramas com manchas de coloração característica, quando reveladas com. vanilina sulfúrica (HARBONE, 1998) e valores de Rf. correspondentes a substâncias polares (Figura 13). A definição de que se tratavam de glicosídeos foi efetuada analisando-se um cromatograma de Lp1 (substância disponível em maior quantidade), procedendo-se a revelação com metaperiodato de sódio – benzindina (DRYHURST, 1970), reagente que caracteriza essencialmente açúcares redutores e não redutores, ou polióis contendo hidroxilas vicinais (Figura 14)..

(40) 38. O 6. OH. 8. H. 10. OMe. 4 3. 5 9. 7. HO. 11. O2 1. 6'. O. O 1'. HO. 5' 2'. OH 4' OH. 3'. OH. Figura 15 - Estrutura química do Theviridosídeo (I). Table 4: HMQC e HMBC do Theviridosídeo isolado em DMSO-d6 a 500 MHz HMQC. HMBC. δC. δH. 2JCH. 114.05 74.75 141.50 165.97. -. H-3 HO-5; H-9 H-9. HO-5 H-1; H-3 H-1; HO-10 H-3; MeO-11. 95.90 153.66 124.07 56.03. 5.29 (d, 6.3) 7.41 (s) 5.60 (dl) 2.77 (dl, 6.3). H-9. H-1’; H-3. 45.32 59.29. 2.69 (sl) 4.07 (dl, 14.7) 3.92 (dl, 14.7). MeO-11 HO-5 HO-10 CH-1’ CH-2’ CH-3’ CH-4’ CH-5’ CH2-6’. 50.85 98.26 73.13 76.25 69.95 77.31 60.91. 3.65 (s) 4.65 (s) 4.75 (t, 5.4) 4.46 (d, 7.8) 2.98 (m) 3.17 (m) 3.06 (m) 3.11 (m) 3.66 (m) 3.43 (m). HO-2’ HO-3’ HO-4’ HO-6’. -. 5.11 (d, 4.7) 4.90 (d, 5.1) 4.90 (d, 5.1) 4.51 (t, 5.9). C 4 5 8 11 CH 1 3 7 9 CH2 6 10. 3JCH. H-9 HO-5; H-7 HO-5 HO-10. GLICOSE. HO-2’; H-3’ H-2’; HO-3’ H-3’ H-4’ HO-6’. H-1; HO-2’ HO-3’ HO-2’; HO-4’ HO-4’ H-4’.

(41) 39. H. COOH. HO. O H2C. H. H. OH OH. O. O. OH HO. H. COOCH3. H. O. HO. H3C. H. OH. O. OH. O HO. Figura 16 - Estrutura química do Gardosídeo (II) e Mussaenosídeo (III). Tabela 5: HMBC do Gardosídeo e Mussaenosídeo Isolado Gardoside. Mussaenoside δΗ. δC. δΗ. δC. 110.00 151.93 166.70. -. 111.46 78.14 166.74. 94.55 151.68 29.63 71.43 43.27. 5.37 (d, 4.2) 7.39 (d, 1.0) 3.10 4.20 2.90. 93.54 150.25 30.33 50.47. 5.33 (d, 4.5) 7.35 (s) 3.02 (m) 2.05 (dd, 9.1, 4.5). 110.98. 5.24 (sl), 5.20 (s). 29.31 39.43 -. 2.14 (m), 1.29 (m) 1.59 (m), 1.53 (m) -. 50.94. 3.64 (s). 24.36 50.85. 1.18 (s) 3.62 (s). HO-5 HO-8 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’. 99.29 73.07 76.70 70.07 77.31 61.12. -. 98.05 73.11 76.70 70.07 77.30 61.16. HO-2’ HO-3’ HO-4’ HO-6’. -. 4.98 4.96 4.93 4.48. -. 4.63 (s) 4.48 (d, 7.8) 2.94 (m) 3.14 (m) 3.01 (m) 3.14 (m) 3.68 (m) 3.42 (m) 4.98 4.96 4.93 4.48. C 4 5 8 11 CH 1 3 5 7 9 CH2 6 7 10 CH3 10 MeO-11 GLICOSE. 29.31. OH.

(42) 40. 4 CAPÍTULO II AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50 DO EAQ 4.1 METODOLOGIA. A avaliação dos efeitos gerais da toxicidade aguda e a determinação da DL50 foram realizadas segundo a metodologia preconizada por Karber e Behrens (1964). Utilizou-se. fêmeas. de. camundongos. albinos. Swiss. (Mus. musculus),. com. aproximadamente 60 dias de nascidas e peso entre 25 e 35 g, divididas em grupos de seis animais (previamente marcadas e pesadas). Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno, em condições controladas de iluminação (ciclo 12 horas claro/escuro) e temperatura de 25 + 2oC, permanecendo sem alimento por um período de 12 horas antes do experimento e recebendo água ad libitum. O EAQ, isento de solvente, foi solubilizado em solução fisiológica 0,9% de NaCl (p/v). O ensaio foi efetuado em duas fases: uma preliminar e outra definitiva. Na fase preliminar, administraram-se doses crescentes de EAQ para definir a dose mais elevada isenta de letalidade (D1) e a menor dose capaz de determinar a morte em 100% dos animais (D2). Os dados obtidos na fase preliminar permitiram delinear a fase definitiva. Nesta, os animais receberam doses compreendidas entre D1 e D2, seguindo progressão geométrica de razão 1,2 com o objetivo de se determinar a DL50 (dose letal para 50% dos animais), todos permaneceram sob observação durante 48 horas. A administração de EAQ por via intraperitoneal, teve como parâmetros observados: sinais tóxicos de caráter geral, efeitos sobre a deambulação, reações comportamentais, alterações da freqüência respiratória, número de óbitos. O grupo controle recebeu o veículo utilizado na dissolução da substância testada. A partir dos dados encontrados nas fases preliminar e definitiva, calculou-se a DL50, empregando-se a fórmula:.

(43) 41. DL50 = Df - ∑(a . b) n. Onde: Df = dose mínima capaz de matar todos os animais. a = diferença entre duas doses consecutivas administradas b = média de animais mortos entre duas doses consecutivas n = número de camundongos por lote. 4.2 RESULTADOS. 4.2.1. Avaliação da Toxicidade Aguda e Determinação da DL50 do EAQ. Nas tabelas 6 e 7 estão relacionadas às doses que apresentaram efeitos mais significativos durante as fases preliminar e definitiva, respectivamente. As tabelas 8 e 9 demonstram a correlação entre letalidade e dose administrada nestas fases..

(44) 42. Tabela 6: Efeitos toxicológicos relacionados às doses administradas na fase preliminar da avaliação da toxicidade aguda e determinação da DL50. Ação/Parâmetros. Doses (mg.kg-1). 500 (D1). 750. 1625 (D2). 1750. ↑ Freqüência respiratória Agitação Piloereção Exoftalmia Movimentos estereotipados Movimentos circulares Movimentos de vibrissas Convulsão clônica Convulsão Tremores finos/grosseiros. +++ ++ + ++. +++ +++ +++ +++ ++. +++ +++ +++ ++. +++ +++ ++ ++. ++ ++ +. ++ +++ + ++. +++ +++. +++ +++ ++ +++. Ereção de cauda Postura de ataque Saltos Irritabilidade Levantamento de trem posterior Arrastamento de trem posterior Depressores Abaixamento de trem posterior Dispnéia Sonolência ↓Freqüência respiratória Prostração Alteração de marcha Outros Excreção fecal Contorções abdominais Reação de fuga Espasmos Elevação de trem anterior Diarréia Refluxo Palidez Distensão abdominal Agressividade Diurese Irritação da conjuntiva Espasticidade Cianose Edema de focinho Petéquias. +++ + -. +++ + -. +++ ++ -. +++ + -. -. -. -. -. +++. +. ++. -. + -. + ++ ++ +. + +++ + ++. + + -. +++ +++ +++ ++ +++ + + + ++ -. ++ +++ +++ +++ ++ ++ + ++ ++ + + ++. + +++ +++ +++ + ++ + +++. ++ ++ +++ +++ + + +++ + +++ -. Estimulantes.

(45) 43. - = sem efeito. + = efeito leve. ++ = efeito moderado. +++ = efeito acentuado. Tabela 7: Efeitos toxicológicos relacionados às doses administradas na fase definitiva da avaliação da toxicidade aguda e determinação da DL50. Doses (mg.kg-1). Ação/Parâmetros 750. 1000. 1250. 1375. 1500. +++ +++ + ++ +++. +++ +++ +++ + +++. +++ +++ +++ +++ +++. +++ +++ +++ ++ +++. +++ +++ ++ +++ +++. +++ +++ +++ +++ +. +++ +++ +++ +++ ++. +++ +++ ++ +++ +++ ++. +++ +++ + + +++ +++ +. +++ +++ ++ +++ ++. Saltos. +. +. -. -. +. Irritabilidade. -. -. -. -. +. Estimulantes ↑ Freqüência respiratória Agitação Piloereção Exoftalmia Movimentos estereotipados Movimentos circulares Movimentos de vibrissas Convulsão clônica Convulsão Tremores finos/grosseiros Ereção de cauda Postura de ataque. Levantamento de posterior Arrastamento de posterior Depressores. trem. -. -. -. -. -. trem. -. -. -. +. ++. Abaixamento posterior Dispnéia. trem. ++. -. ++. ++. -. +. +. -. +++. ++. de. Sonolência. +++. -. -. ++. -. ↓Freqüência respiratória. -. +++. -. -. ++. Prostração. -. +. -. -. ++. Alteração de marcha. -. +. ++. -. -. Outros Excreção fecal. +. ++. +. ++. +. Contorções abdominais. ++. +++. +++. +++. +++. Reação de fuga. +++. +++. +++. +++. +++. Espasmos. ++. +. +++. ++. ++. Elevação de trem anterior Diarréia. -. -. -. -. -. ++. +. -. +. -. Refluxo. +. -. -. -. +. Palidez. ++. ++. -. +. -. -. +++. +. -. -. Agressividade. +++. +++. +. +. ++. Diurese. +++. -. +. -. -. Distensão abdominal. Irritação da conjuntiva Espasticidade. -. -. -. +++. -. ++. -. -. ++. -.

(46) 44. Cianose. -. -. -. -. -. Edema de focinho. -. -. -. +. +. Petéquias. -. -. -. -. -. - = sem efeito. + = efeito leve. ++ = efeito moderado. +++ = efeito acentuado. Tabela 8: Relação letalidade e dose administrada na fase preliminar da avaliação da toxicidade aguda e determinação da DL50.. Doses (mg.kg-1). Mortes até 48 horas. 500. 0/6. 750. 1/6. 1625. 6/6. 1750. 6/6. Table 9: Relação letalidade e dose administrada na fase definitiva da avaliação da toxicidade aguda e determinação da DL50.. Doses (mg.kg-1). Mortes até 48 horas. 750. 1/6. 1000. 2/6. 1250. 3/6. 1375. 5/6. 1500. 5/6.

(47) 45. Com uma DL50 calculada em 1156,25 mg.kg-1 de peso do animal, a curva dose-resposta foi construída a partir dos resultados provenientes do ensaio realizado, utilizando-se as seguintes doses: 500; 750; 1000; 1250; 1375; 1500 e 1625 mg.kg-1 de peso do animal. A figura 17 correspondente à curva dose-resposta mostra que doses acima de 1625 mg.kg-1 foram capazes de matar 100% dos animais.. 110 3,210. 100. Letalidade (%). 90 3,176. 80 70 60 3,096. 50 40 3,000. 30 20 10 0 2,600. 2,875 2,698 2,700 2,800. 2,900 3,000. 3,100. 3,200. 3,300. Log da Dose Figura 17 - Curva dose-resposta da toxicidade do extrato aquoso de Lippia alba (Mill.) N.E. Brown..

(48) 46. 5 CAPÍTULO III ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS RAÍZES DE LIPPIA ALBA. 5.1 MATERIAIS E METODOS. 5.1.1 Microorganismos Utilizados. Sete espécies de microorganismos de coleção internacional foram analizadas: Escherichia coli (ATCC 9723), Klebsiella pneumonia (ATCC 10031), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Enterococus faecalis. (ATCC 33186), Salmonela sp (ATCC 8387) e Pseudomona aeruginosa (ATCC14502).. 5.1.2 Técnica de Difusão em poços. As culturas dos microorganismos foram crescidas em meio agar Müller Hinton (MH) a 37 ºC. Depois de 18 h de crescimento, cada microorganismo foi dissolvido em uma solução estéril NaCl 0,9%, até uma concentração de 0,5 na escala de MacFarland, foram inoculadas na superfície do agar (MH) placas (100 µL). A metodologia utilizada foi técnica de difusão em poços (IEVEN, 1979; CAETANO, 2002). As placas foram incubadas a 37 ºC por 24 h, durante esse período, as zonas de inibição dos crescimentos foram medidas. Tetraciclina foi utilizada com padrão positivo (1 mg/mL). Todas as determinações foram realizadas em duplicatas.. 5.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO.

(49) 47. Os extratos EEA e EME apresentaram uma discreta atividade contra Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e Klebsiella pneumonia (ATCC 10031) os resultados encontram-se na tabela 10. A concentração. inibitória mínima obtiveram valores em uma faixa de 0.5-2 mg/mL (tabela 11). O EEA apresentou-se como o melhor resulto o de 0,5 mg/mL contra Staphylococcus aureus (ATCC 6538). Em adição, o EAQ não apresentou nenhuma atividade, além disso, a Cromatografia em Camada Delgada (CCD) deste extrato apresentou a presença dos iridóides retirando a hipótese de atividade destes compostos. Por outro lado identificou-se a presença de Terpenóides no EEA, ratificando a atividade dessas moléculas através de ALEA et al., 1996. Tabela 10: Atividade Antimicrobiana dos Extratos Acetato de Etila, Metanol e Água de L. alba. Microorganismos. Escherichia coli (ATCC 9723) Klebsiella pneumonia (ATCC 10031) Staphylococcus aureus (ATCC 6538) Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) Enterococcus faecalis (ATCC 33186) Salmonela sp. Extratos. (mg/Ml). EEA 50 100. EME 50 100. EAQ 50 100. Controle positivo Tetraciclina. -. -. -. -. -. -. 25. -. 12. -. -. -. -. 25. 11. 13. -. 12. -. -. 25. 12. 13. -. 13. -. -. 25. -. -. -. -. -. -. 28. (ATCC 8387) Pseudomona NT NT NT NT aeruginosa (ATCC14502) Diâmetro de zona (mm), (-) negativo; NT: não testadas. 23. 19.

(50) 48. Tabela 11:Concentração Inibitória Mínima (MIC) exibida pelos extratos EEA e EME.. Microorganismos Klebsiella pneumonia (ATCC 10031) Staphylococcus aureus (ATCC 6538) Staphylococcus aureus (ATCC 6538P). EAA >2. MIC (mg/mL) EME >2. 0,5. 2. 1. >2.

(51) 49. 6 CAPÍTULO IV AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA E IMUNORREGULADORA. 6.1 INTRODUÇÃO. O processo inflamatório envolve uma série de eventos caracterizado-se por inúmeros estímulos (agente infeccioso, isquemia, interação antigeno-anticorpo, injuria fisica, etc.). A resposta inflamatória ocorre em três fases distintas, cada uma mediada por mecanismos diferentes. A primeira chamada de fase aguda (fase I) - caracterizada pela vasodilatação local e aumento na permeabilidade dos capilares, a segunda sub-aguda (fase II) - caracterizada pela infiltração de leucócitos e células fagocitárias e a terceira crônica (fase III) – onde ocorre degeneração tissular e fibrose. (ROBERTS & MORROW, 2002). Ciclooxigenases (enzima contitutiva COX-1 e Indutiva COX-2) e 5Lipoxigenase (5-LOX) estão envolvidas no metabolismo oxidativo do ácido araquidonico (AA), resultando em importantes produtos biosintéticos como as prostaglandinas (PGs), prostaciclinas (PCs), tromboxanos (TXs) e leucotrienos (LTs). Todos esses metabólitos do AA são mediadores da inflamação ( BENITO, 2000) A Imunologia é o estudo da imunidade desde os eventos celulares e moleculares que ocorrem após o organismos encontrar microorganismos ou moléculas estranhas. As citocinas são proteinas produzidas em reposta aos micróbios e a outros antígenos, as mesmas estimulam diversas respostas célulares envolvidas na imunidade e na inflamação (ABBAS et al., 2002).. 6.2 METODOLOGIA. 6.2.1. Animais.

(52) 50. Foram utilizados ratos Wistar, Rattus norvegicus, com três meses de idade, de ambos os sexos, provenientes do Biotério do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. Camundongos Balb/c machos com 8 semanas de idade, provenientes do Biotério do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami. Os animais receberam água e ração ad libitum e foram mantidos em condições controles (ciclo 12 h claro/escuro) e temperatura (25 ± 2 °C).. 6.2.2 Edema de pata induzido por carragenina. O edema foi induzido de acordo com o modelo descrito por Winter e cols. 1962. A inflamação aguda foi obtida por administração subplantar de 0,1 mL de solucão de carragenina (0,1% p/v) na pata posterior esquerda. O volume (mL) do edema induzido foi medido com auxílio de um pletismômetro (Ugo Basile Italia Modelo 7150). A medicão foi realizada no momento anterior à indução e trinta minutos depois. Após a adminstração das drogas, o volume da pata de cada animal continuou sendo medido em intervalos constantes de uma hora por um período de seis horas.. 6.2.3 Tratamento dos animais. Cinco grupos de RATOS animais (n=5/5 machos) foram privados de ração por doze horas, em seguida tratados por via intraperitonial com 200 mg/kg do EAQ e 100 mg/kg do theviridosídeo isolado previamente. As doses foram estabelecidas com base na DL50 do extrato. Os grupos controle e padrão receberam solução fisiológica (0,9%) e indometacina (10 mg/kg, IP).. 6.2.4 Procedimentos para Preparação dos produtos de peroxidação do iridóide. O procedimento empregado foi aquele adotado por Ishiguro et al. (1988), compreendendo o tratamento do iridóide glicosilado com quantidade estequiométrica de metaperiodato de sódio a temperatura ambiente, durante 1 h com agitação constante, sendo a reação monitorada por CCD. O produto da reação foi passada através de uma.

(53) 51. coluna de carvão ativo, eluindo-se inicialmente com água, para remoção do iodato, logo após acetona, para obtenção do produto peroxidado (Figura 18).. Figura 18: Tratamento com o Metaperiodato: o ponto 1 theviridosideo isolado, o ponto 2 corresponde a fração acetônica e o ponto 3 a fração aquosa da coluna em carvão ativado. 6.2.5 Obtenção de sobrenadantes de culturas de células de baço para dosagem de citocinas e óxido nítrico. Os baços dos camundongos Balb/c foram retirados com o auxílio de homogeneizador estéril, as suspensões celulares foram preparadas em meio de cultura RPMI 1640 (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.,USA). Estas foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos a 4°C e o sobrenadante desprezados. As hemácias, presentes no sedimento celular, foram lisadas com água Milli-Q estéril num volume de 1 mL/baço e imediatamente foi adicionado RPMI em excesso. As suspensões celulares foram mantidas em repouso no gelo, por 5 minutos, para deposição dos grumos. Após este período, as células foram trasferidas para outro tubo e, após centrifugação, ressuspendidas em RPMI-S. A contagem das células e o teste de viabilidade foram realizados utilizando o corante Azul de Trypan. As células foram distribuídas em placas de 24 poços, numa concentração de 5 x 106 células/mL e estimuladas com Con A (5 μg/poço), LP1 e LP1 modificada na concentração de 100 μg/poço por 72 horas, em estufa de CO2 umidificada..

(54) 52. Após a incubação, as células foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos a 4 °C e os sobrenadantes coletados, aliquotados e congelados a -20 °C, para posterior dosagem das citocinas e NO.. 6.2.6 Ensaios para dosagem de citocinas e óxido nítrico. Placas de Elisa (Costar Cambridge, MA, USA) foram sensibilizadas com 50 μL/poços de anticorpo monoclonal de captura diluído em tampão carbonato pH 9,6, incubadas por 3 horas à temperatura ambiente e bloqueadas com 150 μL/poços de uma solução de PBST + 1% de soro albumina bovina (SAB-Sigma Chemical, St; Louis, Mo). Após o bloqueio, as placas foram lavadas 3 vezes em PBS + 0,05% de tween 20 (PBST) e, em seguida, adicionos 50 μL/poços de meio RPMI + 2% nas duas primeiras fileiras, onde foram diluídas, na razão 1:2, os padrões de IL-2, IFN-γ, IL-10 eIL-4. Nas fileiras seguintes, as amostras foram distribuídas e diluídas. As placas foram incubadas por 18 horas, a 4 °C; após a incubação, foram lavadas 3 vezes em PBST e 50 μL/poços do segundo anticorpo diluído em PBST + 0,1% de SAB foram adicionados, seguido de incubação por 1 hora, à temperatura ambiente. Foram feitas mais 3 lavagens em PBST e 75 μL/poços do conjugado enzimático diluído em PBST + 0,1% de SAB, foram adicionados às placas. Em seguida, elas foram incubadas por 1 hora. A reação foi revelada, após novo ciclo de lavagens, com 100 μL/poços do substrato contendo ácido cítrico 0,1M, fosfato de sódio 0,2M, água destilada, cromógeno ABTS (-2,2 azino-bis(3ethylbenzethiazoline-6 sulfonic acid) Sigma) e água oxigenada 30% (Sigma). A reação foi bloqueada com ácido cítrico 0,2M e a leitura feita em leitor de ELISA (Dynatech MR 5000) a 410 nm. Para dosagem de IL-2, as placas foram sensibilizadas com 4 ng/mL do anticorpo monoclonal anti-IL-2 (1 A 12) e o 2° anticorpo monoclonal biotinilado anti-IL2 (5H4) a 2 μg/ mL foi adicionado, após a incubação das amostras e padrão. Para dosagem de IFN-γ, o primeiro anticorpo monoclonal anti-IFN- γ (XMG 1.2) foi utilizado na concentração de 4 μg/mL e o 2° anticorpo monoclonal biotinilado (AN18) na concentração de 2 μg/mL. Para dosagens de IL-10, o primeiro anticorpo monoclonal anti-IL-10 (C252-2 A5) foi utilizado na concentração de 8 μg/mL e o 2° anticorpo monoclonal biotinilado (SXC-1) na concentração de 0,5 μg/mL..

(55) 53. As curvas padrão usadas para calcular as quantidades das citocinas foram obtidas com concentração de 0,44 a 14 ng de IL-2 recombinante/mL; 0,78 a 25 ng de IFN-γ recombinante/mL e 0,156 a 5 ng de IL-10 recombinate/mL. Para dosagem de óxido nítrico foi utilizado o método colorimétrico de Griess, mede indiretamente a produção de NO pela determinação de nitrito acumulado no. Volume do Edema (mL). sobrenadante de cultura. Limiar de sensibilidade do teste 1,56 μM/mL.. 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1. 2. 3. 4. 5. 6. Tempo (h) controle. Theviridosídeo (100 mg/kg). Extrato Aquoso (200 mg/kg). Gráfico 1 - Ensaio de teste in vivo, através de edema de pata de rato, por carragenina 1% IP, com p< 0,05 quando comparados ao grupo controle..

(56) 54. 6.3 RESULTADOS. O. theviridosídeo. (100. mg/kg). apresentou. atividade. anti-edematogênica. estatisticamente significativa, entre 5 e 6 horas nas condições utilizadas, administrado posteriormente ao agente flogístico com 77, 90% de inibição com um intervalo de 95% de confiança (cf. Gráfico 1). Na dose de 100 µg/mL, nem o theviridoside nem seu derivado peroxidado foram capazes de estimular as citocinas (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN), bem como o Óxido Nítrico..

(57) 55. 7 CONCLUSÃO Das raízes de L. alba forneceram 3 iridóides (theviridosídeo, mussaenosídeo e gardosídeo), que foram caracterizados por bases químicas, estudos espectroscópicos e comparação com dados da literatura. O theviridosídeo e o mussaenosídeo são aqui descrito pela primeira vez nas raízes da espécie e o gardosídeo ainda inédito no gênero. A quimiotipia do vegetal em estudo pode ser considerada citralífera de acordo com Julião et al., 2003, porém devido a considerável quantidade de cis-verbenol, como segundo grupo majoritário, induz a se pensar em uma nova variante para esse quimiotipo. Devido à pequena aromaticidade das raízes, os compostos voláteis apresentaram-se discretos em relação aos das folhas, porém não foi observado em nenhuma base de dados os compostos voláteis das raízes de Lippia alba. Carvona, éster metílico do ácido hexadecanóico, patchoulano e limoneno foram os compostos evidenciados nas raízes. Quanto a toxicidade do EAQ apresentou-se moderadamente tóxico, com uma DL50 de 1156,25 mg/kg. Os animais apresentaram durante o ensaio intensas contorções abdominais, excreção fecal, movimentos circulares, piloerecao, movimento estereotipado, ereção de cauda e espasmos. O extrato aquoso não apresentou atividade frente os microorganismos testados. O theviridosídeo apresentou uma atividade antiinflamatória de 77,90% através de Indução do Edema de pata de rato por carragenina 1% com intervalo de confiança de 95% (p < 0,05). O teste in vitro de estimulação das citocinas (IL-2, IL-4, IL-10 e IFN- γ). Na dose de 100 µg/mL, nem o theviridoside nem seu derivado peroxidado foram capazes de estimular as citocinas, bem como o Óxido Nítrico (NO). Mediadores (prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos), estão possivelmente envolvidos com as atividades constatadas..

(58) 56. 8 REFERÊNCIAS ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J.S. Imunologia Celular e Molecular, 4 ed. Revinter, 2002. 529 p. AKDEMIR, Z.; ÇALIS, I.; JUNIOR, P. Iridoid and Phenylpropanoid Glycosides from Pedicularis condensate. Phytochemistry, Amsterdam, v. 30, n. 7, p. 2401-2402, 1991.. ALEA, J.A.P.; LUIS, A. G. O.; PÉREZ, A. R.; JORGE, M. R.; BALUJA, R. Composición y propiedades antibacterianas del aceite essencial de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown, Rev. Cubana de Farmacia, Ciudad de la Habana, v. 30, n. 1, p. 1-8, 1996. ARSLANIAN, R. L.; HARRIS, G. H.; STERMITZ, F. R. Chemistry of the Scrophulariaceae. 7. Some Iridoid glucosides, including the new 6-deoxycatalpol, from indian painbrush species related to Castilleja miniata. Journal of Natural Products, Columbus, v. 48, n. 6, p. 957-961, 1985. BEAUPIN, C. Iridoïdes de I’ Essence de Teucrium marium L. determinations structurales et syntheses. 1978, 214 f. These (Docteur), Universite de Montpellier,. 1978. BENITO, P. B.; LANZA, A. M. D.; SEN, A. M. S.; GALINDEZ, J. D. S.; METELLANO, L. F.; GOMEZ, A. S.; MARTINEZ, M. J. A. Effects of Some Iridoids from Plant Origin on Arachidonic Acid Metabolism in Cellular Systems. Planta Medica, Stuttgart, v. 66, p. 324-328, 2000. BERMEJO, P.; ABAD, M. J.; DÍAZ, A. M.; FERNANDEZ, L.; DE SANTOS, J.; SANCHEZ, S.; VILLAESCUSA, L.; CARRASCO, L.; IRURZUN, A. Antiviral Activity of Seven Iridoids, Three Saikosaponins and One Phenylpropanoid Glycoiside Extracted from Bupleurum rigidum and Scrophularia scorodonia. Planta Medica, Stuttgart, v. 68, p. 106-110, 2002..

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