2.5.1.1 Celulase
A celulase é uma enzima utilizada na degradação da celulose e que possui vasto potencial de aplicações, dentre as quais: (1) agente no branqueamento de papel e celulose e (2) aditivo alimentar e de bebida.
O complexo enzimático das celulases é constituído por endoglucanases (EG) (EC 3.2.1.4), exoglucanases (EXG) ou celobiohidrolase (CBH) (EC 3.2.1.91), e β-glucosidases (BGL) (EC 3.2.1.21). As endoglucanases atuam na quebra da molécula de celulose na região amorfa, liberando celo- oligossacarídeos com diferentes graus de polimerização. A exoglucanase quebra os celo- oligossacarídeos em regiões sequenciais da segunda ligação glicosídica a partir da região não redutora da molécula de celulose, liberando celobiose, que é hidrolisada pela β-glucosidase liberando moléculas de glicose, como apresentado na Figura 9.
Os fungos e as bactérias são considerados bons produtores de celulase. No entanto, em alguns casos, essa produção é heterogênea uma vez que as enzimas exoglucanase, endoglucanase e β- glucosidase podem individualmente apresentar quantidades diferentes ou mesmo haver carência de alguma dessas enzimas específicas, prejudicando, assim, a hidrólise da celulose (PEIXOTO, 2006).
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Figura 9. Mecanismo de ação das enzimas celulolíticas (ARO et al.,2005).
2.5.1.2 Xilanases
As xilanases são enzimas extracelulares produzidas principalmente por fungos e bactérias. São glicosidases responsáveis principalmente pela hidrólise das ligações β-1,4 presentes na xilana vegetal (principal componente da hemicelulose). Tendo em vista que as hemiceluloses são constituídas por vários polímeros, formados por diferentes resíduos de açúcares, a sua degradação completa necessita da ação cooperativa de um conjunto de enzimas específicas. A principal enzima responsável pela despolimerização da xilana é a endo-β-1,4 xilanase (COUGHLAN; HAZLEWOOD, 1993).
As xilanases são classificadas em duas famílias principais (F ou 10 e G ou 11) das glicosil hidrolases. As xilanases da família 10 são maiores, mais complexas e produzem oligossacarídeos menores; as xilanases da família 11 são mais específicas para a xilana (JEFFRIES, 1996).
A endo-β-1,4 xilanase (EC 3.2.1.8) forma o principal grupo de enzimas envolvidas na degradação da xilana. Trata-se de uma endo-enzima que hidrolisa aleatoriamente ligações glicosídicas do tipo β-1,4 dentro da cadeia de hemicelulose (na cadeia principal de xilana) liberando xilo- oligossacarídeos (HALTRICH et al., 1996). A degradação completa desta cadeia principal ocorre por uma ação sinergística entre endo e exo-xilanases (β-xilosidases) e xilohidrolases (EC 3.2.1.37), que hidrolisam os xilo-oligômeros de baixa massa molecular resultantes. De acordo com Biely (1985), para a hidrólise completa dos heteroxilo-oligômeros, são necessárias, ainda, enzimas que hidrolisem os grupos substituintes, tais como a α-glucuronidase, α-L-arabinofuranosidase e acetilesterase (hidrolisam o ácido glucupiranosídeo, arabinofuranosil e grupos acetil, respectivamente). Portanto, as enzimas do
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complexo xilanolítico podem ser divididas naquelas que degradam a cadeia principal (endo-β-1,4 xilanase e β- xilosidase) e as que degradam as cadeias laterais (BAKIR, 2002).Na Figura 10 encontra- se um esquema da ação das enzimas do complexo xilanolítico.
FIGURA 10. Representação teórica da estrutura da xilana vegetal e pontos onde as enzimas atuam (ARO, 2005).
Xilanases microbianas são proteínas mais estáveis entre pH 3 e 10 e seu pH ótimo apresenta-se no intervalo de 4 a 7 (ITO et al., 1992). Possuem apenas uma cadeia polipeptídica com massa molar entre 8 e 145 kDa (SUNNA; ANTRANIKIAN, 1997). A temperatura ótima das endoxinalases varia entre 40 e 60°C. As xilanases da família 11 são específicas e hidrolisam apenas xilana, enquanto que as da família 10 hidrolisam celulose além da xilana (WARREN, 1996).
Diversos estudos têm demonstrado que as xilanases são enzimas induzíveis (BEG et al., 2001) e, assim, diferentes fontes de carbono foram analisadas para descobrir a influência de alguns substratos na produção dessas enzimas. De acordo com Kulkarni et al., (1999), Kumar et al. (2008) e Polizeli et al. (2005), a biossíntese de xilanase foi induzida por xilana, xilose, xilobiose ou resíduos de β-D- xilopiranosil adicionados ao meio e cultura. Em contrapartida, também há relatos de ocorrência de repressão catabólica da biossíntese de xilanase por glicose (KULKARNI et al., 1999).
Apesar da predominância de xilana na hemicelulose, apenas cerca de 20-25% desta pode ser hidrolisada por xilanases, devido ao tamanho relativo dos poros existentes. Tem sido também sugerido
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que a distribuição heterogênea da hemicelulose pode limitar a acessibilidade da enzima à xilana. Outras razões possíveis incluem baixa suscetibilidade da xilana à hidrólise devido à sua natureza, instabilidade térmica da enzima e inibição pelo produto final (ONYSKO, 1993). Xilanases já foram purificadas de numerosos microrganismos como bactérias, leveduras e fungos. Endo-xilanases de fungos têm pesos moleculares na faixa de 7 a 60 kDa e são geralmente mais ativas em pH entre 3,5 e 6,0 e temperatura de 40-60ºC (TAN et al., 1987; BISWAS et al., 1990; BAILEY et al., 1991).
As endo-xilanases bacterianas apresentam pesos moleculares na faixa de 15 a 85 kDa, geralmente são mais ativas em meios levemente alcalinos ou neutros (pH 5,0-8,0) e em temperaturas mais elevadas (50-90ºC) (UCHINO; NAKANE, 1981; ESTEBAN et al., 1983; NISHITANI; NEVINS, 1991; DAHLBERG et al., 1993, ZHENG, 2000).
A inibição de endo-xilanases por diferentes compostos químicos específicos fornece informações sobre seu sítio ativo e sobre o mecanismo de catálise. Os íons metálicos Hg+2, Cu+2, Fe+3, Pb+2, Zn+2 e Ag+ podem inibir alguns tipos de xilanases. O íon mercúrio, por ser o inibidor mais eficaz, sugeriu a presença de grupos tiol no sítio ativo da enzima (BASTAWDE, 1992). Efeito contrário foi mostrado pelos íons cálcio, manganês e zinco para uma endoxilanase clonada em Streptomyces sp (KLUEPFEL et al., 1992).
Estudos com reagentes alquilantes como p-cloromercuribenzoato, bromosuccinamida, iodo e ácido iodoacético mostraram inibição da atividade enzimática, sugerindo que a enzima requer grupos sulfidrila (-SH).
Ensaios realizados com xilanases de Streptomyces e Bacillus (KESKAR et al., 1989; DESPHANDE et al., 1990), determinaram o envolvimento de resíduos de triptofano e cisteína nos sítios ativos. Foi demonstrado também que a adição de xilana juntamente com N-bromosuccinamida protege a xilanase de Bacillus stearothermophilus de inativação, indicando que o resíduo de triptofano estaria presente no sítio ativo da enzima, e não em outro sítio de ligação (KHASIN et al., 1993). O envolvimento de grupos carboxílicos no mecanismo de catálise de endoxilanases também foi comprovado nos estudos com Schizophyllum commune (BRAY; CLARKE, 1990) e Streptomyces sp. (MARUI et al., 1993).
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3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
O objetivo deste trabalho foi comparar a produção de celulases e xilanases por fungos filamentosos previamente isolados de resíduos lignocelulósicos em fermentação submersa e em estado sólido utilizando resíduos agroindustriais como única fonte carbono.
3.2 Objetivos específicos
1) Comparar a eficiência de produção de enzimas celulases, CMCase (endoglucanase) e Avicelase (celulose microcristalina - exoglucanase) e xilanases (xilanase e β-xilosidase) por fungos filamentosos em fermentação submersa e estado sólido;
2) Comparar o efeito do substrato usado na fermentação em estado sólido na produção de celulases e xilanases, utilizando-se apenas bagaço de cana ou este adicionado de farelo de trigo;
3) Caracterizar as enzimas obtidas quanto ao pH e temperatura ótimos de atividade e analisar sua estabilidade frente às variações de pH e temperatura.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Microrganismos utilizados
Nos experimentos foram utilizadas seis linhagens fúngicas, sendo que três delas (U2370, U19 e 100P) pertencem à coleção de culturas do Laboratório de Bioaromas da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA - UNICAMP), e as demais (FS09, N51 e Aspergillus fumigatus M51) foram previamente selecionadas por Lobello (2009) e pertencem à coleção de culturas do Laboratório de Biotecnologia Industrial (UNESP/Assis). Também foi utilizada a cepa Trichoderma reesei CCT 2768, depositada junto à coleção de culturas da Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia “André Tosello” (Campinas-SP).
4.2 Meios de cultivo
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O bagaço de cana foi utilizado como única fonte de carbono na fermentação submersa. Esse material foi lavado em água corrente, seco a 65°C, moído e peneirado para seleção de partículas menores que 80 mesh. Foi utilizada a seguinte formulação (m/v): 3% de bagaço de cana moído, 0,4% (NH4)2SO4, 0,01% MgSO4.7H2O, 0,1% K2HPO4, 0,1% KH2PO4 e 0,1% de solução de micronutrientes (0,1% FeSO4.7H2O; 0,005% MnSO4. H2O; 0,02% ZnSO4). O pH foi ajustado a 5,0 e o material esterilizado a 121°C por 20 min.
4.2.2 Meio para a fermentação em estado sólido
Para a fermentação em estado sólido foram preparados dois tipos de meio. O primeiro continha apenas bagaço de cana-de-açúcar (1,5g) com 80% de umidade obtida através da adição de uma solução nutriente aquosa formulada com: 0,4%(NH4)2SO4, 0,01% MgSO4.7H2O, 0,1% K2HPO4, 0,1% KH2PO4 e 0,1% de solução de micronutrientes (descrita no item 4.2.1). O outro meio continha 70% de bagaço de cana adicionado de 30% de farelo de trigo, e 80% de umidade atingida através da adição de solução nutriente já descrita anteriormente. O pH foi ajustado a 5,0 e o material esterilizado a 121°C por 20 min.