UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, LETRAS E
CIÊNCIAS EXATAS
DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA
Comparação da Produção de Celulases e Xilanases por
Fungos Filamentosos em Fermentação Submersa e Estado
Sólido
MARIANA ALBANO
Mariana Albano
Bióloga
Comparação da Produção de Celulases e Xilanases por Fungos Filamentosos
em Fermentação Submersa e Estado Sólido
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Microbiologia junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Área de Concentração - Microbiologia Industrial, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
Orientador: Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto
Co-orientadora: Dra. Ana Flávia Azevedo Carvalho
Albano, Mariana.
Comparação da produção de celulases e xilanases por fungos
filamentosos em fermentação submersa e estado sólido / Mariana Albano. - São José do Rio Preto : [s.n.], 2012.
64 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Pedro de Oliva Neto
Coorientador: Ana Flávia Azevedo Carvalho
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1.Microbiologia industrial. 2. Fermentação. 3. Celulase. 4. Fungos filamentosos. 5. Trichoderma. I. Oliva Neto, Pedro de. II. Carvalho, Ana Flávia Azevedo. III. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Título.
CDU – 663.15
Mariana Albano
Comparação da Produção de Celulases e Xilanases por Fungos
Filamentosos em Fermentação Submersa e Estado Sólido
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Microbiologia junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Área de Concentração - Microbiologia Industrial, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José
do Rio Preto.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto
Professor Adjunto Doutor
UNESP
–
Assis
Orientador
Profª. Drª. Lucinéia dos Santos
Professora Assistente
Doutora
UNESP - Assis
Prof. Dr. Ary Fernandes Júnior
Professor Assistente
Doutor
UNESP
–
Botucatu
À Deus que nos conduz passo a passo e me deu coragem para concluir este projeto.
Aos meus queridos pais a quem devo todas as conquistas da minha vida.
Ao prof. Dr. Pedro Oliva e profª. Drª. Ana Fávia pela dedicada orientação e por proporcionarem-me a oportunidade de ampliar meus conhecimentos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus em primeiro lugar por ter me dado tantas oportunidades boas e por me permitir concluir mais esta etapa da minha vida.
Aos meus pais Valdomiro e Marisa que nunca mediram esforços para me ver crescer cada vez mais como pessoa. Agradeço pelo amor incondicional, constante incentivo, confortável força...vocês são meu maior exemplo de vida!
À minha irmã Aline a quem tento ser amiga, companheira e um exemplo de profissional.
Aos meus tios Rosa e Valdir por também estarem sempre ao meu lado tanto nos momento de alegria e outros nem tão felizes.
Ao meu orientador Prof. Pedro de Oliva Neto pela confiança no meu trabalho, compreensão e sábia orientação.
À minha co-orientadora Ana Fávia Azevedo Carvalho pela ajuda na elaboração deste projeto, pelos ensinamentos e pela paciência sempre que eu aparecia com alguma dúvida.
À professora Valéria que também está sempre pronta para ajudar e sanar nossas dúvidas.
Aos professores Ary Fernandes e Eduardo Bagagli que me acolheram prontamente no Departamento de Imunologia e Microbiologia da Unesp/Botucatu. Apesar do pouco tempo, pude aprender muita coisa com estes dois mestres!
A todos os colegas do Laboratório de Biotecnologia Industrial (LABI) por todos os momentos de desabafo, companheirismo e confraternizações!
Aos técnicos José Gilberto Milani e Sérgio Moraes por todo apoio.
Agradeço imensamente à Cristiane Gargel e Laís Paulino por me acolherem em sua casa todas as vezes que fui a São José do Rio Preto. Vocês tornaram a caminhada menos pesada!
Às minhas irmãs do coração, Thais Shinya (Caçula), Thais Riolfi (Gonza) e Kassandra Sussi que me acolheram em Assis e me deram a oportunidade de saber como é bom compartilhar momentos bons e ruins com quem a gente pode confiar. Vocês também foram essenciais pra que eu continuasse lutando!
Ao meu namorado Bruno Crulhas pelo companheirismo incondicional e total solicitude, não hesitando nunca a um pedido de ajuda! Você é uma pessoa iluminada!
À CAPES pela bolsa de estudos.
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para
que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas
graças Deus não sou o que era antes”.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ... i
LISTA DE TABELAS ... iii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ... iv
RESUMO ... vi
ABSTRACT ... viii
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 3
2.1 Material lignocelulósico ... 3
2.1.1 Celulose ... 4
2.1.1.1 Hidrólise da celulose ... 6
2.1.2 Hemicelulose ... 7
2.1.3 Lignina ... 8
2.2 Microrganismos produtores de enzimas ... 9
2.2.1 Fungos de degradação branca ... 10
2.2.2 Fungos de degradação marrom ... 10
2..2.3 Fungos de degradação branda ... 11
2.2.4 O Gênero Trichoderma ... 11
2.3 TIPOS DE PROCESSOS FERMENTATIVOS ... 13
2.3.1 Fermentação submersa (FSm) e Fermentação em estado sólido (FES) ... 13
2.4 FATORES QUE INFLUENCIAM A FERMENTAÇÃO ... 17
2.4.1 Umidade e atividade de água (Aw) ... 17
2.4.2 pH ... 18
2.4.4 Aeração ... 18
2.5 ENZIMAS CELULOLÍTICAS E XILANOLÍTICAS ... 19
2.5.1 Tipos e Características ... 19
2.5.1.1 Celulase ... 19
2.5.1.2 Xilanases ... 20
3. OBJETIVO ... 23
3.1 Objetivo geral ... 23
3.2 Objetivos específicos... 23
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 23
4.1. Microrganismos utilizados ... 23
4.2 Meios de cultivo ... 23
4.2.1 Meio para a fermentação submersa ... 23
4.2.2 Meio para a fermentação em estado sólido ... 24
4.3. Produção de celulases e xilanases por fermentação submersa ... 24
4.4. Produção de celulases e xilanases por fermentação em estado sólido ... 24
4.5. Testes de atividades enzimáticas ... 25
4.5.1. Atividade de xilanase ... 25
4.5.2. Atividade β-xilosidase ... 25
4.5.3 Atividades do complexo celulolítico (CMCase e Avicelase) ... 25
4.6 Caracterização parcial das enzimas ... 26
4.6.1 Efeito do pH e da temperatura sobre a atividade enzimática através de Planejamento Experimental. ... 26
4.6.2 Estabilidade da enzima frente às variações de pH e temperatura em ausência de substrato ... 27
4.7. Análises estatísticas ... 27
5.1. Produção enzimática ... 28
5.1.1 Produção de CMCase ... 28
5.1.2. Produção de Avicelase ... 30
5.1.3 Produção de Xilanase ... 31
5.1.4 Produção de β-xilosidase ... 33
5.2 Caracterização parcial das enzimas ... 35
5.2.1. Otimização dos parâmetros pH e temperatura através de Planejamento Experimental. ... 36
5.2.1.1 Planejamento Experimental para xilanases ... 36
5.2.1.2 Planejamento Experimental para CMCases ... 40
5.2.1.3 Planejamento Experimental para exoglucanases (Avicelase) ... 43
5.5.2 Estabilidade das enzimas frente às variações de pH e temperatura ... 47
5.5.2.1 Estabilidade da xilanase produzida por Aspergillus fumigatus M51 . 47 5.5.2.2 Estabilidade da CMCase produzida pela linhagem U19 ... 48
5.5.2.3 Estabilidade da avicelase produzida por Trichoderma reesei CCT 2768 ... 49
6. CONCLUSÃO ... 51
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Receita global do mercado de enzimas industriais de 2009 a 2016 . ... 1
Figura 2. Modelo da parede celular elucidando o complexo lignocelulolítico. ... 4
Figura 3. a) unidade de D-glicose; b) celobiose; c) estrutura linear de celulose. ... 4
Figura 4. a) Estrutura esquemática de uma fibrila de celulose mostrando regiões cristalinas e amorfas; b) Disposição das hidroxilas na estrutura cristalina da celulose. ... 5
Figura 5. Açúcares que compõem a hemicelulose. ... 8
Figura 6. Estrutura da lignina. ... 9
Figura 7. Esquema da estrutura de parede celular de fungos. ... 12
Figura 8. Esquema de representação do crescimento de fungos em substratos sólidos. ... 15
Figura 9. Mecanismo de ação das enzimas celulolíticas. ... 20
Figura 10. Representação teórica da estrutura da xilana vegetal e onde as enzimas atuam ... 21
Figura 11. Sistemas de FES utilizando bagaço de cana-de-açúcar como substrato. a) U19; b) Trichoderma reesei CCT 2768; c) FS09; d) Aspergillus fumigatus M51. ... 28
Figura 12. Comparação da produção de enzima CMCase entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm). ... 30
Figura 13. Comparação da produção de enzima avicelase entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm). . ... 31
Figura 14. Comparação da produção de enzima xilanase entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm). ... 33
Figura 15. Comparação da produção de enzima β-xilosidase entre fermentação em estado sólido (FES) e fermentação submersa (FSm). ... 345
Figura 16. Gráfico de superfície de resposta que representa a atividade de xilanase (U/mL) produzida em FSm como função do pH e temperatura de incubação e curva de contorno. ... 38
Figura 17. Gráfico de superfície de resposta que representa a atividade de xilanase (U/mL) produzida em FES como função do pH e temperatura de incubação e curva de contorno. ... 40
Figura 18. Gráfico de superfície de resposta que representa a atividade de CMCase (U/mL) produzida em FSm como função do pH e temperatura de incubação e curva de contorno. ... 34
ii
Figura 23. Efeito da temperatura (a) e pH (b) sobre a atividade da avicelase produzida por
iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Comparação entre vários estudos com microrganismos produtores de celulase ... 16
Tabela 2. Valores das variáveis independentes em cada nível do planejamento experimental. .. 26
Tabela 3. Valores das variáveis independentes em cada nível do planejamento experimental. .. 27
Tabela 4.
Comparação estatística entre as melhores produções enzimáticas de CMCase,avicelase e xilanase...35
Tabela 5. Matriz do Planejamento experimental (DCCR 22) com valores originais e codificados das variáveis de estudo (pH e temperatura) e atividade enzimática da xilanase produzida por FSm com bagaço de cana como substrato pela linhagem A. fumigatus M51. ... 366
Tabela 6. Análise de variância (ANOVA) para o modelo de regressão da produção de xilanase obtida por FSm. ... 377
Tabela 7. Matriz do Planejamento experimental (DCCR 22) com valores originais e codificados das variáveis de estudo (pH e temperatura) e atividade enzimática da xilanase produzida por FES pela linhagem A. fumigatus M51. ... 399
Tabela 8. Análise de variância (ANOVA) para o modelo de regressão da produção de xilanase obtida por FES. ... 399
Tabela 9. Matriz do Planejamento Experimental (DCCR 22) com valores originais e codificados
das variáveis de estudo (pH e temperatura) e atividade enzimática da CMCase produzida por FES com bagaço de cana como substrato pela linhagem U19. ... 411
Tabela 10. Análise de variância (ANOVA) para o modelo de regressão da produção de CMCase obtida por FES. ... 422
Tabela 11. Matriz do Planejamento experimental (DCCR 22) com valores originais e codificados das variáveis de estudo (pH e temperatura) e atividade enzimática da exoglucanase (avicelase) produzida por FES pela linhagem T. reesei CCT 2768. ... 433
Tabela 12. Análise de variância (ANOVA) para o modelo de regressão da avicelase obtida por FES. ... 444
Tabela 13. Matriz do Planejamento experimental (DCCR 22) com valores originais e codificados das variáveis de estudo (pH e temperatura) e atividade enzimática da exoglucanase (avicelase) produzida por FSm pela linhagem T. reesei CCT 2768. ... 455
iv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
MLC Material lignocelulósico
XOS Xilooligossacarídeos
FSm Fermentação submersa
FES Fermentação em estado sólido
DCCR CentralCompositeRotationalDesign (Planejamento Central Composto Rotacional)
CMC Carboximetilcelulose
CMCase Endoglucanase que hidrolisa carboximetilcelulose
MnP Manganês-peroxidase
EG Endoglucanase
pI Ponto isoelétrico
CBH Celobiohidrolase
BGL β-glicosidase
Aw Atividade de água
EXG Exoglucanases
kDa Quilodalton
-SH Grupo sulfidrila
FEA Faculdade de Engenharia de Alimentos
UNICAMP Universidade de Campinas
UNESP Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
rpm Rotações por minuto
μL Microlitros
p/v Relação peso por volume
μmol Micromol
рNPX p-nitrofenil β-D-xylanopiranosídeo
nm Nanômetro
v
U/mL Relação unidade enzimática por mililitro de solução
U/g Relação unidade enzimática por grama de substrato
M Molar
ANOVA Análise de variância
B Substrato composto por bagaço de cana-de-açúcar
B+F Substrato composto por bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo
R2 Coeficiente de determinação
x1 Código que representa pH no planejamento experimental
x2 Código que representa temperatura no planejamento experimental
vi
RESUMO
O interesse mundial pelo aproveitamento de resíduos agroindustriais como fonte renovável para produção de alimentos e biocombustíveis tem aumentado cada vez mais. Os materiais lignocelulósicos (MLCs) são uma fonte rica em polissacarídeos, celulose e hemicelulose, utilizados para o desenvolvimento de tecnologias na produção de álcool, xilose, xilitol, xilooligossacarídeos (XOS), entre outros. Fermentações submersas (FSm) e em estado sólido (FES) foram realizadas utilizando como substrato apenas bagaço de cana-de-açúcar ou suplementado com farelo de trigo, com o objetivo
de produzir celulases (CMCase e Avicelase) e xilanases (β-1,4-xilanase e β-xilosidase) por seis fungos
filamentosos isolados de bagaço de cana-de-açúcar em trabalhos anteriores. Dentre os estudados, a fermentação submersa (FSm) foi o melhor processo para a produção de xilanases e celulases. Para a
produção de β-xilosidase o processo mais eficiente foi a fermentação em estado sólido (FES) . Dentre
os microrganismos estudados para a produção de endoglucanases, destacaram-se os fungos filamentosos: U2370 (25,7 U/g), U19 (19,4 U/g) e Aspergillus fumigatus M51 (17,4 U/g), valores bem
superiores aos encontrados na FES, cujos maiores destaques foram FS09 e U19 com aproximadamente 13 U/g. Para a produção de avicelase, os destaques foram: U19 (4,6 U/g) em FSM, T. reesei (3,0 U/g) e
U2370 (3,8 U/g) todos em FSm. Para a produção de xilanase também os destaques foram todos em FSm: A. fumigatus M51 (1.263 U/g), N51 (1.247 U/g), FS 09 (1.133 U/g) e U 19 (1.129 U/g). Apenas
a linhagem 100P (1.000 U/g) foi expressiva em FES. Já a enzima β-xilosidase foi produzida de forma
bem mais expressiva apenas pela linhagem N51 (6,6 U/g) em FES. Nessa pesquisa apenas o fungo U19 se destacou para as três atividades (avicelase, xilanase e CMCase), o U2370 se destacou apenas
como celulolítico (avicelase e CMCase), já o N51 foi o melhor produtor de β-xilosidase e xilanase. O
T.reesei utilizado como referência nesse trabalho, foi grande produtor de apenas avicelase, e o A.
fumigatus M51, o maior produtor de xilanase. O estudo de temperatura e pH ótimos para a produção
enzimática foi feito para os fungos M51 (para xilanase), U19 (para CMCase) e T. reesei (para
vii
para FES e pHs de 6 a 8 para FSm. Pode-se concluir que neste trabalho foram selecionados microrganismos com grande potencial para produção industrial de enzimas xilanases e celulases, com destaque para os seguintes: Aspergillus fumigatus M51 para xilanases; U19 (fungo filamentoso ainda
não identificado) para CMCase e T. reesei 2768 para avicelase.
Palavras-chave: xilanases, celulases, fermentação submersa, fermentação em estado sólido,
viii
ABSTRACT
The worldwide interest in the use of agro-industrial residues as a renewable source for food and biofuels
production has increased even more. The lignocellulosic materials (MLCs) are a rich source of polysaccharides,
cellulose and hemicelluloses, used in developing technology for the production of alcohol, xylose, xylitol and
xilooligossacarids (XOS). Submerged fermentation (SmF) and solid state fermentation (SSF were performed
using only bagasse cane sugar or supplemented with wheat bran) as substrate, with the goal of producing
cellulases (CMCase and Avicelase) and xylanases (β-1, 4-xylanase and β-xylosidase) for six filamentous fungi isolated from crushed sugar cane in previous works. Among the studies, the submerged fermentation (SmF) was
the best method for the production of xylanases and cellulases. For the production of β-xylosidase the most efficient process was the solid state fermentation (SSF). Among the microorganisms studied for producing
endoglucanases, the most important filamentous fungi is: U2370 (25.7 U/ g), U19 (19.4 U/g) and Aspergillus
fumigatus M51 (17.4 U/g), values much higher than those found in FES, whose major activities were FS09 and
U19, with approximately 13 U/g. For the production of avicelase, activities were U19 (4.6 U/g) in FSm, T. reesei
CCT 2768 (3.0 U/g) and U2370 (3.8 U/g) all in SmF. For the production of xilanases, the best activities were
also all in SmF: A. fumigatus M51 (1263 U/g), N51 (1247 U/g), FS 09 (1133 U/g) and U19 (1,129 U/g). Only
the strain 100P (1000 U/g) was significant in FES. The enzyme β-xylosidase was produced in a much more expressive only by strain N51 (6.6 U / g) in FES. In this study only the fungus U19 stood out for all three
activities (avicelase, xylanase and CMCase), the U2370 is noted only as cellulolytic (avicelase and CMCase),
and the N51 was the best producer of β-xylosidase and xylanase. The T.reesei CCT 2768 used as reference in this work was a major producer of only avicelase, and A. fumigatus M51, the largest producer of xylanase. The
study of optimum temperature and pH for the enzyme production was made for fungi M51 (for xylanase), U19
(for CMCase) and T. reesei CCT 2768 (for avicelase) and used an experimental design CCRD 22. All enzymes
had its optimum temperature at 55°C, but the pH was varied for each one. CMCases (SSF and SmF) and
xylanase produced by SSF had optimum pH of 3.5. Avicelases and xylanase produced by SmF, 5.5. Finally, we
tested the stability of enzymes in the absence of substrate, varying pH and temperature. The CMCases were
stable in the temperatures range of 25°C to 40°C and pH 3 to 7 (SmF), and 40°C to 60°C to pH 4 to 8 (SSF).
For avicelases the stability results were: 25°C to 70°C and pH 3 to 5 (FES), and 40°C to 50°C and pH 4 to 7
(SmF). The xylanases showed the same range of stability for temperature (25°C to 50°C), and highest activity
between pH 3 to 6 for FES, and 6 to 8 for SmF. It can be concluded that in this study were selected
microorganisms with potencial for industrial production of cellulases and xylanases, especially following:
Aspergillus fumigatus M51 for xylanase, U19 (unidentified filamentous fungi) for CMCase and Trichoderma
reesei CCT 2768 for avicelase
1
1. INTRODUÇÃO
A produção de enzimas possui grande importância no cenário industrial, visto que o seu uso facilita o beneficiamento de produtos têxteis, papéis, farmacêuticos, alimentícios, entre outros. A produção de enzimas em escala industrial surgiu no início do século XX e, atualmente, sabe-se que mais de 500 tipos de enzimas garantem diversas aplicações biotecnológicas, e que seu uso proporciona o aumento da especificidade e eficiência de processos na indústria farmacêutica, melhoramento da pureza de produtos e redução dos gastos com compostos químicos; melhoram as qualidades sensoriais do produto na indústria alimentícia, como cor, sabor, textura e elevação de seu valor nutricional, além de participarem da transformação de suco de uva em vinho; na indústria química, estão presentes em detergentes e são utilizadas no curtimento de couro, entre outros benefícios nos ramos industriais. É vantajoso usar enzimas na indústria porque elas são naturais, não tóxicas e específicas para determinadas ações.
A produção de enzimas é um mercado promissor que vem crescendo a cada ano. No entanto, o número de empresas que utilizam enzimas é muito superior ao número de produtores, demonstrando carência de competidores nesse mercado dominado por empresas dos Estados Unidos e Europa (BAJPAI; BAJPAI, 1996). Em 2010, o mercado mundial de enzimas alcançou em torno de 3,6 bilhões de dólares. A projeção deste mercado é que se atinja US$ 6 bilhões até 2016 (BCC, 2012) (Figura 1).
Figura1. Receita global do mercado de enzimas industriais de 2009 a 2016 (projeção) (BCC, 2012).
2
O mercado brasileiro de enzimas, embora ainda pouco representativo, cerca de 2,4% do total mundial (BRASIL, 2009), revela grande potencial, devido à biodiversidade de microrganismos, à enorme geração de resíduos agroindustriais e ao dinamismo das indústrias de alimentos, medicamentos, tecidos e celulose/papel. A redução do custo da produção de enzimas é favorecida no país pela possibilidade de bioconversão de subprodutos agrícolas como bagaço de cana-de-açúcar, farelo de trigo, farelo de algodão, casca de soja e outros.
Pesquisas que visam à produção de enzimas e a redução dos custos de produção têm sido cada vez mais frequentes na literatura. Os estudos buscam: prospectar microrganismos com alta produtividade; determinar substratos adequados para o processo fermentativo que possuam baixo valor agregado, que estejam em grande quantidade e que sejam de fácil disponibilidade; determinar condições ótimas para o desenvolvimento do microrganismo (temperatura, substrato, umidade, pH); produzir as enzimas em larga escala.
As celulases e xilanases são enzimas muito importantes para a degradação dos resíduos lignocelulósicos, o que abre espaço para a produção de vários compostos biotecnológicos, como etanol de segunda geração, xilitol, xilooligossacarídeos (XOS) e outros.
O uso do processo de fermentação em estado sólido (FES) tem se mostrado promissor quando comparado à fermentação submersa (FSm). Algumas pesquisas demonstram maior produtividade enzimática com o uso da FES, (MARTIN et al., 2007), pois esse processo é capaz de reproduzir o
habitat natural de alguns microrganismos, como os fungos filamentosos, e possibilita o uso de resíduos lignocelulósicos (PANDEY, 2003).
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Material lignocelulósico
O aumento das necessidades energéticas em todo o mundo e a maior demanda por alimento, advindas do elevado crescimento populacional e econômico vem resultando em grande pressão sobre os recursos naturais do planeta. Todo esse processo tem acelerado a busca por energias renováveis, assim como o desenvolvimento de tecnologias menos poluentes. O principal objetivo é buscar alternativas energéticas que possam substituir ou reduzir o uso de combustíveis fósseis, como por exemplo, o etanol. Com o intuito de diminuir o impacto gerado pelo acúmulo de resíduos sólidos provenientes das atividades agroindustriais, como bagaço de cana-de-açúcar, palha de arroz, farelo de trigo, bagaços de frutas, muitas pesquisas científicas vem sendo realizadas com esses materiais lignocelulósicos (MLCs) como substrato para produção de enzimas.
Os MLCs são formados por celulose, lignina e hemicelulose (GARROTE et al., 1999). A composição do bagaço de cana consiste de aproximadamente: 40-50% celulose, 25% lignina e 25% hemicelulose, representada por L-arabino-(4-0-metil-D-glucurono)-D-xilana; além disso, também são compostos por minerais, ceras (parafina) e outros compostos (BRIENZO et al., 2009; NEUREITER et al., 2002; PANDEY et al., 2000). As paredes celulares das plantas são compostas por diferentes camadas, que diferem uma da outra em respeito à estrutura e a composição química. A parede celular é um complexo composto por substâncias estruturais (hemicelulose) e envoltórias (lignina). Essas substâncias estão fortemente associadas e ligadas covalentemente (FENGEL; WAGENER, 1989). Sabe-se que as moléculas de hemicelulose estão quase paralelas às fibrilas de celulose, enquanto a lignina apresenta-se em uma forma aleatória, conferindo maior estabilidade à parede (Figura 2).
4
Figura 2. Modelo da parede celular elucidando o complexo lignocelulolítico (STICKLEN, 2008).
2.1.1 Celulose
A celulose é o polímero mais abundante existente na Terra. A cada ano mais de 1011 toneladas de gás carbônico são fixadas por meio da fotossíntese derivada de material vegetal, e metade desse material consiste em celulose (LESCHINE, 1995). É o componente em maior proporção da madeira, sendo um polímero linear formado exclusivamente por unidades de D-glicose unidas através de
ligações glicosídicas β-(1,4). A celulose é insolúvel em água e de massa molecular que varia entre 50
mil e 2,5 milhões de Dalton dependente da origem da amostra. É composta por unidades monoméricas de celobiose, a qual é formada pela junção de duas moléculas de glicose seguida da eliminação da água através das hidroxilas ligadas ao carbono 1 e 4 (FENGEL; WEGENER, 1989).
Figura 3. a) unidade de D-glicose; b) celobiose; c) estrutura linear de celulose.
a) b)
5
As cadeias de celulose são longas, paralelas e as fibrilas estão densamente empacotadas. No estado sólido, existem pontes de hidrogênio entre as moléculas de celulose que levam à formação de estruturas supramoleculares arranjadas em um sistema ordenado parecidas às de cristais. No entanto, certa porção de celulose apresenta-se em forma de cadeias interligadas de maneira caótica, formando a celulose amorfa, como demonstrada na Figura 3. A porcentagem de cristalidade da celulose em forma nativa é de 60-90%, podendo apresentar formas diferentes, numeradas de I a IV, sendo a forma nativa
denominada “celulose I”. A porcentagem e a forma cristalina da celulose na parede celular variam de
acordo com o estágio de desenvolvimento e o tipo da célula em questão (FENGEL; WEGNER, 1989; LESCHINE, 1995).
Figura 4. a) Estrutura esquemática de uma fibrila de celulose mostrando regiões cristalinas e amorfas; b) Disposição das hidroxilas na estrutura cristalina da celulose (RABELO, 2007).
6
As principais enzimas responsáveis pela quebra das ligações β-1,4 da celulose são encontradas
em fungos: as endoglucanases (β-1,4-D-glucanohidrolase), as exoglucanases (β
-1,4-D-glucanocelobiohidrolase) e as β-glucosidases. As endoglucanases são responsáveis pela quebra das
ligações β-1,4 da celulose, deixando, assim, as pontas das regiões amorfas abertas para hidrólise pelas
celobiohidrolases, formando fragmentos menores. Finalmente, as β-glucosidases hidrolisam celobiose
de baixo peso molecular resultando em glicose (LESCHINE, 1995; BOISSET et al., 2000).
O sistema celulose-celulase é muito heterogêneo e a reação de hidrólise da celulose requer vários passos. Um dos mais importantes consiste em um pré-requisito para as reações catalíticas subsequentes: a adsorção das moléculas de celulase sob pertinentes sítios da superfície da celulose (LEE et al., 1982). O poder de adsorção da endoglucanase é um fator catalítico na hidrólise da celulose
amorfa e cristalina (KLYOSOV, 1990). Algumas celulases difundem muito lentamente dentro dos pequenos espaços entre as microfibras, adsorvem especificamente sobre a superfície interna dos feixes de microfibras e apresentam baixa ação catalítica, diferentemente das proteínas adsorvidas sob a superfície das fibras (TANAKA et al., 1986). O mecanismo de adsorção da celulase depende da ação sinérgica entre: 1) o componente da celulase e sua relativa adsorvibilidade; 2) a cristalinidade, heterogeneidade e volume do poro do substrato; e 3) temperatura (NIDETZK et al., 1994).
2.1.1.1 Hidrólise da celulose
A hidrólise enzimática da celulose é comumente um processo incompleto e lento, embora existam exemplos satisfatórios como o da microbiota do rúmen bovino que hidrolisa de 60 a 65% da celulose disponível e também de cupins capazes de assimilar até 90% de celulose da madeira (BREZNAK; BRUNE, 1994). Enquanto isso, em sistemas mais complexos, como o apodrecimento de uma árvore no solo, essa degradação pode levar meses para ser completada.
A hidrólise enzimática é bastante dependente da natureza do material celulolítico. A principal vantagem da hidrólise enzimática é que a reação pode ser realizada em condições favoráveis não sendo necessárias altas temperaturas e pressões ou pHs extremos (ENARI, 1983).
De acordo com Ferraz et al. (2000) essa hidrólise das pontes glicosídicas ocorre através da
7
respectivamente, da configuração anomérica do átomo de carbono do glicosídio hidrolisado (KLYOSOV, 1990; NIDETZK et al., 1994; LESCHINE, 1995).
Segundo estudos de Zhang e Lynd (2006), as características amorfas e de cristalinidade da celulose interferem no complexo enzimático. Esses estudos demonstram que as hidrólises de celulases fúngicas são de 3 a 30 vezes mais eficazes na forma amorfa. Com isso a acessibilidade a essa parte da celulose torna-se um fator de grande importância na eficiência da hidrólise da celulose. Isso também é demonstrado por pré-tratamentos realizados nos substratos para disponibilizar o acesso a essas regiões.
O fator limitante para o desenvolvimento de um processo enzimático de hidrólise é o custo, sendo necessária uma otimização no processo, com o desenvolvimento de cepas microbianas de alta produtividade, melhoramento da produção e reciclagem das enzimas para um melhor aproveitamento do processo (ENARI, 1983; TANAKA, 1981).
Celulases de uma variedade de microrganismos têm sido isoladas, clonadas e caracterizadas
bioquimicamente. Todas essas enzimas hidrolisam ligações β-1,4-glicosídicas por meio de catálise
ácida simples, com a adoção de um próton e uma base nucleofílica, liberando produtos pela inversão ou pela retenção das configurações anoméricas no carbono 1 (SCHWARZ, 2001).
2.1.2 Hemicelulose
8
Figura 5. Açúcares que compõem a hemicelulose.
2.1.3 Lignina
A lignina é o segundo polímero natural mais abundante entre os materiais lignocelulósicos, sendo uma molécula complexa responsável por manter unidas as fibras desses materiais. É um heteropolímero constituído por unidades de fenilpropano, possui estrutura tridimensional amorfa sem repetição na composição estrutural dos blocos monômeros. Possui ligações carbono-oxigênio-carbono que unem pequenas cadeias de hidrocarbonos, como apresentado na Figura 6 (RABELO, 2007).
Com isso, cria-se uma proteção física que protege a planta da ação de enzimas liberadas pelos microrganismos. Dessa forma, a presença da lignina na parede celular dificulta a hidrólise enzimática dos carboidratos. A quebra da lignina dá-se pela ruptura das ligações CO-C, liberando os hidrocarbonos menores, que podem ser tratados para a produção de álcool (RABELO, 2007).
As funções biológicas da lignina são: (1) fornecer suporte estrutural à parede secundária de plantas vasculares. A parede celular lignificada pode ser vista como um complexo, com microfibrilas
de celulose e hemicelulose, e a lignina como uma “matriz plástica” conferindo resistência ao material
9
Figura 6. Estrutura da lignina (RABELO 2007).
2.2 Microrganismos produtores de enzimas
10
As reações catalisadas por enzimas oxidativas têm um papel significante na completa degradação da biomassa lignocelulolítica. Entretanto, apenas alguns microrganismos, pertencentes à classe dos fungos de degradação branca, possuem sistemas capazes de degradar a lignina com eficiência (HATAKKA, 1994).
Os fungos degradadores de madeira se dividem em três grupos distintos: fungos de degradação branca, degradação marrom e degradação branda ou macia, de acordo com a morfologia da degradação. Esses fungos degradadores são taxonomicamente variados e pertencem principalmente ao Filo Basidiomycota (MELLO; AZEVEDO, 2008).
2.2.1 Fungos de degradação branca
Os fungos responsáveis pela degradação branca da madeira selecionam a lignina presente na parede celular, deixando a celulose praticamente intacta (KIRK, 1998). Esses fungos são classificados dessa maneira baseando-se em características morfológicas e fisiológicas das hifas. A maioria tem hifas dicarióticas com conexões específicas entre os septos do micélio (MELLO, 2008). Esses basidiomicetos oxidam compostos fenólicos, relacionados à lignina, que está principalmente associada a enzimas extracelulares lignocelulolíticas (KIRK, 1986; JØRGENSEN, 2005).
Fungos de degradação branca como Pleurotus spp. são caracterizados pela habilidade de
degradar os polímeros de lignina em tecidos vegetais. O ataque inicial do fungo precisa ser extracelular, não-específico e oxidativo (KIRK, 1986; KLYOSOV, 1990). Essa biodegradação lignolítica envolve a ação de enzimas como a lignina peroxidase, manganês-peroxidase (MnP) e lacases (ERIKSSON; PETTERSSON, 1988; KIRK, 1986; HATAKKA, 1994; LEE; MOON, 2003; FERRAZ, 2004; JØRGENSEN et al., 2005). Os fungos do gênero Pleurotus produzem MnP-peroxidases, lacases,
mas não produzem ligninas peroxidases (COHEN, 2002).
2.2.2 Fungos de degradação marrom
Os fungos de degradação marrom promovem a hidrólise dos polissacarídeos celulose e hemicelulose e deixam a lignina intacta. Com essa característica, o material restante desse processo tem uma coloração amarronzada e de aparência frágil (LEE, 2003). Esses fungos representam somente 6% do Filo Basidiomycota (DURÁN; ESPOSITO, 1977).
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parede celular da madeira e as que degradam a celulose e a hemicelulose enquanto a lignina é apenas modificada (LEE, 2003; MELLO; AZEVEDO, 2008).
2.2.3 Fungos de degradação branda ou macia
Esses fungos geralmente pertencem às classes Ascomycota e Deuteromycota e promovem uma degradação de forma suave e aparência úmida (JØRGENSEN, 2005). Essa degradação ocorre através da penetração das hifas nas camadas da parede celular.
Os fungos de degradação branda colonizam e degradam madeiras duras, de alta umidade, mas também degradam madeiras moles, porém, com uma taxa de hidrólise mais lenta quando comparada com fungos de degradação branca ou marrom. Esses fungos são mais eficientes na despolimerização de compostos sintéticos de lignina (MELLO; AZEVEDO, 2008).
2.2.4 O Gênero Trichoderma
O gênero Trichoderma (Ascomycetes, Hypocreales) foi descrito por Persoon há mais de 200
anos atrás (RIFAI, 1969) e consiste de fungos anamórficos que habitam principalmente o solo e matéria orgânica em decomposição (SAMUELS, 1996; GAMS; BISSET, 1998). Espécies de Trichoderma
estão dentre os fungos mais comumente distribuídos na natureza e podem ser encontrados em ecossistemas que variam desde tundra até o tropical (SAMUELS, 1996). Essa capacidade de sobrevivência em regiões tão diferentes pode ser atribuída a sua capacidade metabólica diversificada e sua agressividade natural competitiva (KLEIN; EVELEIGH, 1998). Isolados de Trichoderma podem
ser reconhecidos por suas características, tais como: rápido crescimento em cultura, micélio aéreo e produção de numerosos esporos (conídios), os quais, normalmente, são verdes (BISSETT, 1991).
Trichoderma spp. produzem uma série de enzimas para degradação de homo e
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Figura 7. Esquema da estrutura de parede celular de fungos (RUIZHERRERA, 1992).
Espécies de fungos do gênero Trichoderma são saprófitas. Na natureza estes fungos encontram
uma grande variedade de polissacarídeos naturais, dentre os quais a celulose e a hemicelulose. O
Trichoderma reesei é o degradador mais proeminente do gênero Trichoderma. Foi isolado
originalmente nas Ilhas Salomão (Pacífico Sul) durante a Segunda Guerra Mundial, onde foi observada a degradação de tecidos de algodão e barracas por esses fungos. Desde então, o T. reesei é considerado
um produtor potencial de celulases.
O T. reesei secreta seis tipos de endoglucanases (EGI, EGII, EGIII, EGIV, EGV, EGVI) que
diferem em massa molecular e ponto isoelétrico (pI). A EG I é a endoglucanase produzida em maior quantidade pelo T. reesei, chegando a cerca de 5% do total de proteínas liberadas no meio de cultura,
enquanto a EG II chega a 0,5% e as endoglucanases restantes (EG III, IV, V) apresentam-se como componentes minoritários (SALOHEIMO et al., 2002). Dois tipos de celobiohidrolases (CBH I E CBH II) já foram identificados no complexo celulolítico secretado por T. reesei (TERRI, 1997). Estas
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complexo. A CBH I responde por cerca de 60% do total de proteínas liberadas, enquanto que a CBHII chega a 20% (MIETTINEN-OINONEN, 2004). Quanto às β-glicosidases, em T. reesei já foram
descritas duas (BGLI e BGLII), sendo que a BGLII além de hidrolizar celobiose, também possui ação de transglicosilação (SALOHEIMO et al., 2002).
2.3 TIPOS DE PROCESSOS FERMENTATIVOS
2.3.1 Fermentação submersa (FSm) e Fermentação em estado sólido (FES)
A fermentação pode ser basicamente de dois tipos: (1) com fase aquosa abundante, conhecida como fermentação submersa (FSm) e (2) com fase não-aquosa predominante, conhecida como fermentação em estado sólido (FES).
As enzimas são tradicionalmente obtidas por processos de FSm. Neste tipo de fermentação, além de um melhor controle do processo, a recuperação de enzimas extracelulares e a determinação de biomassa são facilitadas, sendo realizadas por filtração simples ou centrifugação para a remoção das células. O sobrenadante da cultura é utilizado para os estudos enzimáticos e o crescimento microbiano é quantificado após secagem da biomassa, por gravimetria, podendo ainda ser realizado por densidade ótica no caso de cultivos com bactérias (LIMA et al., 2003).
A fermentação no estado sólido (FES) pode ser definida como o crescimento de microrganismos em materiais sólidos na ausência de água livre, no entanto, o substrato deve conter umidade suficiente, existente na forma adsorvida na matriz sólida (PANDEY, 1992; SOCCOL; VANDENBERGHE, 2003). Outros autores a descrevem como sendo o crescimento e o metabolismo de organismos em materiais sólidos como uma estrutura organizada na ausência total de líquido na forma livre (RAIMBAULT; ALAZARD, 1980).
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A FES, comparada com a FSm, é preferida devido às vantagens que oferece, tais como: fácil manejo e manutenção, menor custo de operação, maior concentração de produtos formados, facilidade na extração do produto com a utilização de solventes apropriados (geralmente água) e espaço físico reduzido.
A FES deve ter a capacidade de proporcionar ambiente com umidade adequada ao crescimento microbiano, sendo, portanto, a condição natural de fungos filamentosos, que produzem várias enzimas extracelulares em altas concentrações para hidrolisar os nutrientes da fase sólida (DALSENTER et al., 2005).
Outra vantagem da FES é a possibilidade de se usar resíduos agroindustriais como bagaços de cana-de-açúcar e de laranja, cascas de frutas, farelos de trigo e de mandioca, entre outros, como substratos para obtenção de produtos com alto valor agregado. Com isso a utilização desses resíduos na FES tem se tornado um método alternativo, visto que esses substratos são de baixo custo, existem em abundância e podem representar um problema ambiental se forem descartados de forma inadequada. A escolha do tipo de substrato a ser utilizado na fermentação está relacionada às condições de adequação do microrganismo ao seu ambiente, pois cada substrato possui características próprias de retenção de umidade e disponibilidade de nutrientes. Esses materiais sólidos são, geralmente, fragmentados e de natureza granular ou fibrosa, que permitem a retenção de água por higroscopicidade ou capilaridade.
Além disso, os substratos sólidos úmidos possuem característica polimérica e de baixa solubilidade em água, e agem como fonte de carbono, nitrogênio, minerais, água e outros nutrientes. O uso de substratos que contenham macromoléculas é importante como fonte de nutrientes, pois podem ser hidrolisadas por enzimas hidrolíticas que são secretadas pelos microrganismos, liberando pequenas moléculas solúveis, podendo ser utilizadas para o crescimento desse microrganismo (LAURENTINO, 2007). Em geral, tais enzimas são alvo de interesse industrial. Dessa forma, encontrar substrato que reproduza as condições do habitat natural dos microrganismos (alta atividade de água, alta transferência de oxigênio e boa fonte de nutrientes) é alvo de análise em diversas pesquisas.
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Figura 8. Esquema de representação do crescimento de fungos em substratos sólidos (HOLKER e LENZ, 2005).
O substrato pode variar em composição e concentração de carboidratos, proteínas e fibras. Com isso, durante o processo hidrolítico, o microrganismo pode liberar várias enzimas extracelulares como pectinases, celulases, hemicelulases, proteases, amilases e ligninases, entre outras. Essa produção é regulada por mecanismos fisiológicos, como o processo de repressão catabólica pela glicose.
Observa-se que há diversos tipos de resíduos agrícolas ou subprodutos de agroindústrias que podem ser empregados como os substratos sólidos na FES, tais como: resíduos de arroz, bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de laranja, palha de trigo, sementes de uva e farelo de mandioca, entre outros.
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diversos substratos, como apresentado na Tabela 1. Encontra-se na literatura vários trabalhos com fungos mesofílicos, embora o uso de fungos termofílicos para a produção de metabólitos por FES tenha crescido recentemente. Isso se deve ao fato desses fungos trabalharem em temperaturas mais elevadas, reduzindo o risco de contaminação por microrganismos mesofílicos, e produzindo enzimas termoestáveis (GOMES et al., 2007).
Tabela 1. Comparação entre vários estudos com microrganismos produtores de celulase (ZANELATO, 2011).
Microrganismo Tipo de fermentação Substrato enzimática Atividade Referência
Aspergillus niger 3T5B8 FES (32ºC/78h) Farelo de trigo 3,5 U/mL Couri et al. (2000)
Aspergillus niger MTCC
7956
FES (30ºC/96h) Farelo de trigo 6,8 U/mL Sukumaran et al. (2009)
Bacillus sp FES (37ºC/72h) Farelo de trigo 12,5 U/g Gessesse e Mamo
(1999) Trichoderma citrinoviride FSm (28ºC/144h/180rpm) Resíduos de
citronela 97,6 U/g
Chandra et al. (2009)
Aspergillus terreus M11 FES (45ºC/96h) Palha de milho 267 U/g Gao et al. (2008)
Thermoascus aurantiacus
miehe FES (50ºC/96h) Bagaço de cana 3 U/mL Silva et al. (2005)
Thermoascus aurantiacus
miehe FES (50ºC/96h) Farelo de trigo 30 U/mL Silva et al. (2005)
Thermomucor
indicaeseudaticae FES (45ºC/144h)
Bagaço de cana, de laranja e farelo de trigo
12,3 U/g Umsza-Guez (2009)
Trichoderma spp. FSm
(28ºC/144h/180rpm)
Resíduos de
citronela 94,13 U/g
Chandra et al. (2009)
Trichoderma reeseiRUT
C30 FES (30ºC/96h) Farelo de trigo 15 U/mL
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2.4 FATORES QUE INFLUENCIAM A FERMENTAÇÃO
Há diversos fatores que influenciam a fermentação. Entre os mais importantes estão: as condições ambientais como temperatura, pH, atividade de água, nível de oxigênio e concentração de nutrientes, e produtos que afetam significativamente o crescimento celular e a formação de produtos. Segundo Del Bianchi et al. (2001) e Pandey (2002), o controle de determinadas variáveis é necessário para a obtenção de produtos com características constantes e uniformes. Dessa forma pode ser afirmado que a observação desses fatores e o trato correto em relação a cada um deles trará um melhor resultado ao processo de fermentação.
2.4.1 Umidade e atividade de água (Aw)
A umidade do meio é uma variável importante para o desenvolvimento do fungo, tendo como função o transporte e disponibilização de nutrientes e de metabólitos em sua forma dissolvida, bem como a manutenção do volume celular, devido ao fato da água ligar-se a moléculas como polióis, açúcares ou enzimas (CROWE et al., 1982).
A baixa atividade de água tende a aumentar a fase lag de crescimento, interferindo na quantidade de biomassa produzida (ORIOL et al., 1988). Geralmente, as bactérias se desenvolvem em atividades de água elevadas, entre 0,85 e 0,99; as leveduras crescem melhor entre 0,75 e 0,9 e os fungos filamentosos entre 0,6 e 0,8. A umidade varia entre os microrganismos empregados, produtos a serem gerados e tipo de substrato utilizado. Portanto, em geral, os tipos de microrganismos que podem se desenvolver em sistemas de FES são determinados pelo fator atividade de água (RAIMBAULT, 1998). A esporulação, disponibilidade de nutrientes, inibição de enzimas e permeabilidade da membrana celular podem ser afetadas pela alteração da atividade de água, podendo prejudicar o metabolismo do fungo (CHARLAN; HAROWITZ, 1974). Dessa forma, o controle da atividade de água é de grande interesse para otimizar a produção de metabólitos como aromas, antibióticos e enzimas.
Na FES, a água apresenta um papel fundamental, pois é responsável pela difusão de solutos, gases e metabólitos inibitórios. Para cada espécie de microrganismo existe um valor ótimo de umidade do substrato para que ocorra o crescimento celular, que pode não coincidir com o melhor valor para a expressão do produto que se pretende obter no processo, como por exemplo, enzimas. Narahara et al. (1982) estudaram o efeito da umidade do substrato sobre a atividade de proteases e amilases produzidas
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com o substrato mais úmido, condição que, no entanto, foi favorável ao crescimento celular. Dessa forma, o preparo e a seleção do substrato devem levar em conta os níveis de atividade de água e umidade ideais (CORREIA, 2004). A adição de água ou nutrientes ao meio pode ser utilizada de forma a alcançar os objetivos do cultivo.
2.4.2 pH
O valor de pH tende a variar em resposta às atividades metabólicas dos microrganismos, seja através da produção de ácidos durante a fermentação ou mesmo do consumo destes e a formação de compostos como uréia, que tendem a elevar o pH (BRAND, 2000).
2.4.3 Temperatura
A temperatura é um fator crítico em praticamente todas as fermentações. Altas temperaturas decorrentes da atividade metabólica dos microrganismos, especialmente com a respiração, durante o crescimento, afetam a germinação dos esporos, o crescimento celular e a formação de produtos, ao passo que temperaturas muito baixas são desfavoráveis ao crescimento dos microrganismos e a outras reações bioquímicas (HASAN et al., 1998).
Cada microrganismo apresenta uma faixa ótima de temperatura para produção de enzimas. No decorrer das fermentações a liberação de calor produzido durante as atividades metabólicas dos microrganismos provoca uma elevação significativa da temperatura (HESSELTINE, 1987).
2.4.4 Aeração
A aeração cumpre funções básicas como: manter condições aeróbicas; eliminar o dióxido de carbono formado; regular a temperatura do substrato; ajustar o nível de umidade (CORREIA, 2004). É importante que o oxigênio seja mantido em um nível que seja suficiente para evitar limitações ou diminuição da respiração normal dos microrganismos (GUSEK et al., 1991).
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estudos respirométricos são importantes para se determinar a relação entre a quantidade de oxigênio necessária durante o crescimento de determinado microrganismo e para a produção de enzimas.
Os sistemas de FES têm caráter heterogêneo e a transferência de oxigênio é limitada por um filme líquido na superfície do substrato. Como não existe água livre no meio, a área interfacial e a pressão parcial de oxigênio tornam-se fatores cruciais. O nível de oxigênio necessário para a FES é esperado ser menor do que na FSm. No entanto, de acordo com Lonsane et al. (1991), o problema com a difusão de oxigênio na FES resume-se à transferência do gás entre as partículas. Observa-se que a velocidade de transferência na FES é maior que na FSm (LONSANE et al., 1991).
2.5 ENZIMAS CELULOLÍTICAS E XILANOLÍTICAS
2.5.1 Tipos e Características
2.5.1.1 Celulase
A celulase é uma enzima utilizada na degradação da celulose e que possui vasto potencial de aplicações, dentre as quais: (1) agente no branqueamento de papel e celulose e (2) aditivo alimentar e de bebida.
O complexo enzimático das celulases é constituído por endoglucanases (EG) (EC 3.2.1.4), exoglucanases (EXG) ou celobiohidrolase (CBH) (EC 3.2.1.91), e β-glucosidases (BGL) (EC 3.2.1.21). As endoglucanases atuam na quebra da molécula de celulose na região amorfa, liberando oligossacarídeos com diferentes graus de polimerização. A exoglucanase quebra os celo-oligossacarídeos em regiões sequenciais da segunda ligação glicosídica a partir da região não redutora da molécula de celulose, liberando celobiose, que é hidrolisada pela β-glucosidase liberando moléculas de glicose, como apresentado na Figura 9.
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Figura 9. Mecanismo de ação das enzimas celulolíticas (ARO et al.,2005).
2.5.1.2 Xilanases
Asxilanases são enzimas extracelulares produzidas principalmente por fungos e bactérias. São glicosidases responsáveis principalmente pela hidrólise das ligações β-1,4 presentes na xilana vegetal (principal componente da hemicelulose). Tendo em vista que as hemiceluloses são constituídas por vários polímeros, formados por diferentes resíduos de açúcares, a sua degradação completa necessita da ação cooperativa de um conjunto de enzimas específicas. A principal enzima responsável pela despolimerização da xilana é a endo-β-1,4 xilanase (COUGHLAN; HAZLEWOOD, 1993).
As xilanases são classificadas em duas famílias principais (F ou 10 e G ou 11) das glicosil hidrolases. As xilanases da família 10 são maiores, mais complexas e produzem oligossacarídeos menores; as xilanases da família 11 são mais específicas para a xilana (JEFFRIES, 1996).
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complexo xilanolítico podem ser divididas naquelas que degradam a cadeia principal (endo-β-1,4 xilanase e β- xilosidase) e as que degradam as cadeias laterais (BAKIR, 2002).Na Figura 10 encontra-se um esquema da ação das enzimas do complexo xilanolítico.
FIGURA 10. Representação teórica da estrutura da xilana vegetal e pontos onde as enzimas atuam (ARO, 2005).
Xilanases microbianas são proteínas mais estáveis entre pH 3 e 10 e seu pH ótimo apresenta-se no intervalo de 4 a 7 (ITO et al., 1992). Possuem apenas uma cadeia polipeptídica com massa molar entre 8 e 145 kDa (SUNNA; ANTRANIKIAN, 1997). A temperatura ótima das endoxinalases varia entre 40 e 60°C. As xilanases da família 11 são específicas e hidrolisam apenas xilana, enquanto que as da família 10 hidrolisam celulose além da xilana (WARREN, 1996).
Diversos estudos têm demonstrado que as xilanases são enzimas induzíveis (BEG et al., 2001) e, assim,
diferentes fontes de carbono foram analisadas para descobrir a influência de alguns substratos na produção dessas enzimas. De acordo com Kulkarni et al., (1999), Kumar et al. (2008) e Polizeli et al.
(2005), a biossíntese de xilanase foi induzida por xilana, xilose, xilobiose ou resíduos de β -D-xilopiranosil adicionados ao meio e cultura. Em contrapartida, também há relatos de ocorrência de repressão catabólica da biossíntese de xilanase por glicose (KULKARNI et al., 1999).
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que a distribuição heterogênea da hemicelulose pode limitar a acessibilidade da enzima à xilana. Outras razões possíveis incluem baixa suscetibilidade da xilana à hidrólise devido à sua natureza, instabilidade térmica da enzima e inibição pelo produto final (ONYSKO, 1993). Xilanases já foram purificadas de numerosos microrganismos como bactérias, leveduras e fungos. Endo-xilanases de fungos têm pesos moleculares na faixa de 7 a 60 kDa e são geralmente mais ativas em pH entre 3,5 e 6,0 e temperatura de 40-60ºC (TAN et al., 1987; BISWAS et al., 1990; BAILEY et al., 1991).
As endo-xilanases bacterianas apresentam pesos moleculares na faixa de 15 a 85 kDa, geralmente são mais ativas em meios levemente alcalinos ou neutros (pH 5,0-8,0) e em temperaturas mais elevadas (50-90ºC) (UCHINO; NAKANE, 1981; ESTEBAN et al., 1983; NISHITANI; NEVINS,
1991; DAHLBERG et al., 1993, ZHENG, 2000).
A inibição de endo-xilanases por diferentes compostos químicos específicos fornece informações sobre seu sítio ativo e sobre o mecanismo de catálise. Os íons metálicos Hg+2, Cu+2, Fe+3, Pb+2, Zn+2 e Ag+ podem inibir alguns tipos de xilanases. O íon mercúrio, por ser o inibidor mais eficaz, sugeriu a presença de grupos tiol no sítio ativo da enzima (BASTAWDE, 1992). Efeito contrário foi mostrado pelos íons cálcio, manganês e zinco para uma endoxilanase clonada em Streptomyces sp
(KLUEPFEL et al., 1992).
Estudos com reagentes alquilantes como p-cloromercuribenzoato, bromosuccinamida, iodo e ácido iodoacético mostraram inibição da atividade enzimática, sugerindo que a enzima requer grupos sulfidrila (-SH).
Ensaios realizados com xilanases de Streptomyces e Bacillus (KESKAR et al., 1989;
DESPHANDE et al., 1990), determinaram o envolvimento de resíduos de triptofano e cisteína nos
sítios ativos. Foi demonstrado também que a adição de xilana juntamente com N-bromosuccinamida protege a xilanase de Bacillus stearothermophilus de inativação, indicando que o resíduo de triptofano
estaria presente no sítio ativo da enzima, e não em outro sítio de ligação (KHASIN et al., 1993). O
envolvimento de grupos carboxílicos no mecanismo de catálise de endoxilanases também foi comprovado nos estudos com Schizophyllum commune (BRAY; CLARKE, 1990) e Streptomyces sp.
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3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
O objetivo deste trabalho foi comparar a produção de celulases e xilanases por fungos filamentosos previamente isolados de resíduos lignocelulósicos em fermentação submersa e em estado sólido utilizando resíduos agroindustriais como única fonte carbono.
3.2 Objetivos específicos
1) Comparar a eficiência de produção de enzimas celulases, CMCase (endoglucanase) e Avicelase (celulose microcristalina - exoglucanase) e xilanases (xilanase e β-xilosidase) por fungos filamentosos
em fermentação submersa e estado sólido;
2) Comparar o efeito do substrato usado na fermentação em estado sólido na produção de celulases e xilanases, utilizando-se apenas bagaço de cana ou este adicionado de farelo de trigo;
3) Caracterizar as enzimas obtidas quanto ao pH e temperatura ótimos de atividade e analisar sua estabilidade frente às variações de pH e temperatura.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Microrganismos utilizados
Nos experimentos foram utilizadas seis linhagens fúngicas, sendo que três delas (U2370, U19 e 100P) pertencem à coleção de culturas do Laboratório de Bioaromas da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA - UNICAMP), e as demais (FS09, N51 e Aspergillus fumigatus M51) foram
previamente selecionadas por Lobello (2009) e pertencem à coleção de culturas do Laboratório de Biotecnologia Industrial (UNESP/Assis). Também foi utilizada a cepa Trichoderma reesei CCT 2768,
depositada junto à coleção de culturas da Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia “André Tosello”
(Campinas-SP).
4.2 Meios de cultivo
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O bagaço de cana foi utilizado como única fonte de carbono na fermentação submersa. Esse material foi lavado em água corrente, seco a 65°C, moído e peneirado para seleção de partículas menores que 80 mesh. Foi utilizada a seguinte formulação (m/v): 3% de bagaço de cana moído, 0,4% (NH4)2SO4, 0,01% MgSO4.7H2O, 0,1% K2HPO4, 0,1% KH2PO4 e 0,1% de solução de micronutrientes
(0,1% FeSO4.7H2O; 0,005% MnSO4. H2O; 0,02% ZnSO4). O pH foi ajustado a 5,0 e o material esterilizado a 121°C por 20 min.
4.2.2 Meio para a fermentação em estado sólido
Para a fermentação em estado sólido foram preparados dois tipos de meio. O primeiro continha apenas bagaço de cana-de-açúcar (1,5g) com 80% de umidade obtida através da adição de uma solução nutriente aquosa formulada com: 0,4%(NH4)2SO4, 0,01% MgSO4.7H2O, 0,1% K2HPO4, 0,1% KH2PO4
e 0,1% de solução de micronutrientes (descrita no item 4.2.1). O outro meio continha 70% de bagaço de cana adicionado de 30% de farelo de trigo, e 80% de umidade atingida através da adição de solução nutriente já descrita anteriormente. O pH foi ajustado a 5,0 e o material esterilizado a 121°C por 20 min.
4.3. Produção de celulases e xilanases por fermentação submersa
As linhagens foram cultivadas em Erlenmeyer de 250 mL, contendo 50 mL de meio descrito no item 4.2.1. O material foi inoculado com 106 células/esporos por mL contadas por microscopia em câmara de Neubauer. Os fungos M51, U19 e T. reesei foram incubados a 35°C, sendo os fungos N51 e
FS09 incubados a 28°C, sob agitação de 180 rpm, por 168 horas (parâmetros definidos em estudo anterior). O material foi filtrado a vácuo, utilizando papel filtro Whatman no1 e posteriormente centrifugado. O meio de cultivo livre de biomassa foi utilizado como extrato enzimático bruto para os testes de atividade xilanolítica e celulolítica (item 4.5).
4.4. Produção de celulases e xilanases por fermentação em estado sólido
25
foram adicionados em cada frasco 40 mL de água destilada, sendo posteriormente agitado por 20 minutos em shaker, a 100 rpm. O material foi filtrado e centrifugado e o sobrenadante utilizado como solução enzimática bruta.
4.5. Testes de atividades enzimáticas
4.5.1. Atividade de xilanase
Para os testes de determinação das atividades enzimáticas foi utilizada uma mistura constituída
de 100 μL de solução enzimática bruta e 650 μL de suspensão de xilana “birchwood” (Sigma) a 0,5%
(p/v) diluída em solução-tampão citrato 100 mM (pH 5,0). Essa mistura foi incubada a 50°C por 10 minutos, seguido por um resfriamento imediato no gelo por 5 minutos (BRIENZO et al., 2009). O açúcar redutor liberado foi quantificado pelo método de Miller (1959). Uma unidade de atividade
enzimática é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 μmol de açúcar redutor,
por minuto, nas condições de ensaio, utilizando curva padrão de xilose.
4.5.2. Atividade β-xilosidase
A atividade sobre os substratos sintéticos foi determinada com 50 μL da solução enzimática,
250 μL de solução-tampão acetato 100 mM (pH 5,0) e 250 μL de p-nitrofenil β-D-xylanopiranosídeo
(рNPX), reagindo em banho-maria por 10 minutos a 50°C. A reação foi paralisada com 2 mL de
solução carbonato de sódio 2M e o p-nitrofenol liberado foi quantificado por espectrofotometria a 410 nm utilizando uma curva padrão de p-nitrofenol (BRIENZO et al., 2009). Uma unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 Pmol de p-nitrofenol por minuto de reação (IEMBO et al., 2002).
4.5.3 Atividades do complexo celulolítico (CMCase e Avicelase)
O procedimento de hidrólise para os testes de determinação das atividades das enzimas celulases foi realizado através do método proposto por Ghose (1987). Foi utilizada uma mistura
constituída de 100 μL solução enzimática bruta e 650 μL de suspensão de carboximetilcelulose (CMC
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definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 μmol de açúcar redutor, por minuto,
nas condições de ensaio, utilizando curva padrão de glicose. O mesmo procedimento foi realizado para a determinação da enzima avicelase (Avicel®-Sigma), entretanto, o tempo de incubação desta reação foi de 30 minutos.
4.6 Caracterização parcial das enzimas
4.6.1 Efeito do pH e da temperatura sobre a atividade enzimática através de Planejamento Experimental.
Para avaliar o efeito do pH e da temperatura sobre a atividade das enzimas foi realizado um planejamento experimental do tipo Delineamento Composto Central Rotacional 22 (DCCR) com 12 ensaios, sendo 4 pontos axiais, 4 fatoriais e 4 repetições no ponto central. A variável dependente selecionada para este estudo foi a atividade enzimática, expressa em U/mL, e as variáveis independentes escolhidas foram o pH e temperatura de incubação. Para estes experimentos foram escolhidas aquelas enzimas produzidas por FES utilizando-se como substrato apenas bagaço de cana-de-açúcar, pelo fato das mesmas terem apresentado maiores atividades quando comparadas àquelas obtidas de FES com farelo de trigo como substrato. Também foram caracterizadas as enzimas produzidas por FSm pelos mesmos microrganismos.
O efeito da temperatura sobre a atividade da enzima foi determinado através da reação nas temperaturas entre 40qC a 70qC, no pH determinado como ótimo para a atividade da enzima. Inicialmente foram realizados os experimentos com valores de pH e temperatura de acordo com a Tabela 2 a seguir.
Tabela 2. Valores das variáveis independentes em cada nível do planejamento experimental 22.
Variáveis
Símbolo Níveis independentes
-1,41 -1 0 1 1,41
pH x1 4,0 4,4 5,5 6,6 7,0
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Entretanto, a fim de se obter os valores de pH e temperatura mais próximos do ótimo possível, os planejamentos experimentais foram repetidos utilizando valores de pH mais baixos, como se pode observar na Tabela 3.
4.6.2 Estabilidade da enzima frente às variações de pH e temperatura em ausência de substrato
Para determinar a estabilidade das enzimas, a atividade foi mensurada na temperatura ótima de cada enzima (obtida através do planejamento experimental) em tampões com pH variando de 2,0 a 10,0 (0,2M). Os seguintes tampões foram usados: tampão glicina-HCl para pH 2,0 e 3,0; tampão acetato de sódio para pH 4,0 e 5,0; tampão fosfato de sódio para pH 6,0 a 8,0 e tampão glicina-NaOH para pH 9,0 e 10,0. Uma alíquota de 0,5 mL de solução enzimática foi misturada a 0,5 mL de tampão em cada pH, e a mistura mantida a 25 qC por 24 horas.
O efeito da temperatura de incubação da enzima sobre a sua estabilidade, em ausência de substrato, foi avaliada em temperaturas de 25qC a 95qC por uma hora. O controle foi determinado como a atividade da enzima no início do ensaio. As atividades foram determinadas na temperatura e pH ótimos (obtidos através do planejamento experimental) de cada enzima, seguindo-se o descrito no item 4.5.
4.7. Análises estatísticas
Todas as fermentações foram realizadas em triplicata. Foram realizadas análises de variância do tipo one-way (ANOVA) e teste de Tukey para calcular as diferenças significativas entre os experimentos, com nível de significância 95%, utilizando o software Bioestat (versão 5.0). O planejamento experimental foi analisado em nível de significância de 90%, utilizando-se o software STATISTICA versão 8.0 para obtenção da regressão dos dados experimentais e gráficos de superfície de resposta e de contorno. Para as tabelas ANOVA foi utilizado o software MINITAB 15.
Tabela 3. Valores das variáveis independentes em cada nível do planejamento experimental 22.
Variáveis
Símbolo Níveis
independentes
-1,41 -1 0 1 1,41
pH x1 2,0 2,4 3,5 4,6 5,0
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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Produção enzimática
A produção de celulases e xilanases foi realizada cultivando-se microrganismos selecionados e alguns ainda não identificados (LOBELLO, 2009) em fermentação submersa (FSm) e em estado sólido (FES).A Figura 11 mostra fotos de alguns dos microrganismos cultivados em FES após 168 horas de fermentação.
5.1.1 Produção de CMCase
Os ensaios para determinação das atividades da enzima CMCase mostraram, de modo geral, que a produção foi maior em fermentação submersa (FSm) quando comparada com as fermentações em estado sólido (FES) (Figura 12).
Considerando a utilização apenas de bagaço de cana, a linhagem U2370 foi a melhor produtora de CMCase em FSm com 25,7 U/g de substrato, seguida pelas linhagens U19 (19,4 U/g), A. fumigatus
M51 (17,4 U/g), N51 (15,0 U/g), 100P (12,8 U/g), FS09 (10,8 U/g) e T. reesei (10,7 U/g). Em relação à
FES com bagaço de cana (B), o melhor microrganismo produtor de CMCase foi o U19, com atividade enzimática de 13 U/g. As demais linhagens (FS09, N51, U2370, T. reesei, 100P e A. fumigatus M51)
produziram 10,9; 9,5; 7,4; 7,2; 7,1 e 6,2 U/g, respectivamente.
b
a b
d c
Figura 11. Sistemas de FES utilizando bagaço de cana-de-açúcar como substrato. a) U19; b)
29
Ao utilizar o substrato contendo bagaço de cana-de-açúcar mais farelo de trigo (B+F), houve um pequeno aumento na produção de CMCase pelas linhagens A. fumigatus M51, N51 e FS09, embora
a diferença não tenha sido estatisticamente significativa. A máxima atividade obtida com B+F em FES foi de 13,6 U/g resultante do extrato produzido pela linhagem FS09, superando até mesmo o valor da FSm (10,8 U/g) para o mesmo microrganismo. Os resultados das demais linhagens foram: U19 (12,3 U/g); N51 (10,9 U/g); A. fumigatus M51 (9,1 U/g); U2370 (5,0 U/g), 100P (4,6 U/g) e T. reesei (3,7
U/g).
O uso de farelo de trigo justifica-se devido à alta produtividade de celulases e xilanases obtidas em fermentações realizadas com esse substrato (Tabela 1.) (GESSESSE e MAMO (1999); SILVA et al. (2005); COURI et al. (2000). Esse material apresenta-se como fonte de carbono e nitrogênio de fácil
acesso sendo, portanto, considerado na literatura como o substrato ideal. No entanto, segundo Nunes et al. (2001), o farelo de trigo tem cerca de 10% de fibras, quase que na sua totalidade celulose, quantidade aparentemente insuficiente para ser metabolizadas e se converterem a celulases, podendo ser por este motivo que neste trabalho os resultados com bagaço de cana foram melhores que os obtidos pela mistura bagaço de cana mais farelo de trigo.
Basso et al. (2010) compararam a produção de CMCase em FES com bagaço de cana (28ºC/15 dias) utilizando duas linhagens de T. reesei. A linhagem RUT C30 produziu 3,5 U/g, e a linhagem
QM9414, 5,7 U/g, valores inferiores aos obtidos no presente trabalho, principalmente quando comparados aos obtidos por FSm (17,4 U/g para a linhagem A. fumigatus M51, e 19,4 U/g para a U19).
Rodríguez-Zúñiga(2010) obteve atividade de CMCase de 5 U/g em bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor utilizando A. niger em 72h de FES a 32ºC, enquanto que neste trabalho foi obtido
