Enzimas hidrolíticas de componentes da parede celular

Uma das características físicas mais importantes em sucos de frutas é sua turbidez e, portanto, é um dos principais alvos dos tratamentos de conservação como o tratamento térmico que objetiva a inativação das enzimas hidrolíticas de componentes da parede celular (RIVAS et al., 2006). Enquanto, a PME catalisa a desesterificação da pectina liberando ácido péctico com menor grau de esterificação, a PG catalisa a clivagem hidrolítica das ligações 1- 4 do ácido péctico acarretando na perda de viscosidade e na separação de fases durante o armazenamento de sucos. Assim, essas enzimas atuam em conjunto, uma vez que o produto da reação da PME serve como substrato para a ação da PG (FACHIN et al., 2003).

5.2.1 Pectinametilesterase

A Figura 4 (A e B) mostra os resultados de atividade residual obtidos após os tratamentos térmicos aplicados em sucos de caju e graviola para pectinametilesterase. A PME de suco de caju mostrou-se termorresistente como pode ser observado pelo tratamento a 55 °C que aumentou a atividade da PME em até 10 vezes. As temperaturas de 65 e 85 °C também resultaram em aumento no primeiro minuto de exposição e então decaindo até o final do experimento quando voltaram a aumentar. Os demais tratamentos não provocaram alterações significativas na atividade da PME em relação a sua atividade no suco não tratado. Esses resultados sugerem que a PME do suco de caju apresenta uma elevada temperatura ótima de atividade. Em goiabas, a temperatura ótima de atividade dessa enzima varia de 75 a 85 °C (LEITE et al., 2006).

Figura 4. Atividade residual da PME nos sucos de caju (A) e graviola (B) em relação ao tempo sob diferentes temperaturas.

A PME proveniente do suco de graviola se apresentou pouco susceptível ao aquecimento. Todas as temperaturas de tratamento reduziram a atividade da PME de graviola no primeiro minuto e depois se seguiu uma estabilidade pelos 30 min de exposição. Inicialmente, a 55 °C, a atividade residual dessa enzima decaiu em 15% enquanto a 85 e 95 °C, a atividade decaiu aproximadamente em 30%. O tratamento a 95 °C apresentou a maior redução na atividade da PME em suco de graviola atingindo quase 39% após 30 min.

Resultados semelhantes aos observados para o suco de caju foram encontrados por Leite et al. (2006) em um estudo com goiabas (Psidium guajava L., cv. Paluma), onde observou-se que a atividade da PME aumentou após 30 min de exposição a 75 °C e permaneceu significativamente alta mesmo após 8h a 90 °C. Segundo os autores, esse comportamento é possível devido à liberação de enzimas que poderiam formar complexos com substâncias reguladoras e/ou inibidoras. Além disso, a elevada atividade da PME sob altas temperaturas nessa espécie pode estar sendo promovida pela associação dessa enzima a outras biomoléculas que lhe conferem termoestabilidade.

Esses resultados mostram que a inativação da PME após o aquecimento dos sucos de caju, e mesmo o de graviola, está muito aquém da necessária em termos de conservação e manutenção de atributos de qualidade como viscosidade e turbidez esperados por esse tipo de tratamento, sugerindo que temperaturas mais elevadas ou por períodos mais longos seriam mais eficientes para esse intuito. Um estudo com a PME de cinco cultivares de tomate mostrou que uma delas tinha elevada estabilidade térmica e isso explicaria a perda de consistência de alguns produtos industriais derivados de tomate durante o armazenamento (LARATA et al., 1995). Macdonald et al. (1997) isolaram quatro isoformas de PME de limão e observaram que uma delas apresentava uma alta estabilidade térmica mantendo a sua atividade mesmo após ser mantida a 86 °C por 9 min. Os autores atribuíram a desestabilização do suco de limão à termoestabilidade desta isoforma. Já Cameron e Grohmann (1996), estudando isoformas de PME de suco cítrico, observaram que uma das isoformas era mais termoestável, mantendo 49,2% de sua atividade inicial após 1 min a 95 °C.

Outros resultados de atividade residual que se contrapõem aos encontrados nesse estudo foram observados com a PME de acerola (Malpighia emarginata DC.) reduzida em 90% após 2 min, a 106 °C (ASSIS et al., 2000). Javeri e Wicker (1991) também relataram que a PME de pêssego (Prunus pérsica L.) perde 77% de sua atividade quando incubada por 5 min a 65 °C e é completamente inativada após 5 min, a 70 °C. Rivas et al. (2006) observaram que a atividade da PME em um suco preparado com laranja e cenoura (80% e 20%,

respectivamente) decaiu para 2% após um tratamento a 98 °C por 21 s. Seymour et al. (1991) isolaram duas isoformas de PME de toranja (Citrus paradis) e verificaram que elas diferiam em relação à quantidade de carboidratos a elas associados. Com a remoção desses carboidratos, houve uma diminuição da estabilidade térmica, sugerindo que essas moléculas contribuem para a estabilidade térmica da PME. Isso poderia explicar as diversas variações citadas em relação à estabilidade térmica da PME.

Além das isoformas, outros fatores que podem fazer com que haja divergência de resultados é o pH e o grau de purificação das amostras contendo a enzima. Sentandreu et al. (2005) relataram atividade residual da PME de 1 a 4% em diversos sucos cítricos após um aquecimento contínuo a 85 ou 90 °C por 10 s. Uma redução no pH dos sucos pode levar a um aumento na sensibilidade térmica da PME, o que pode contribuir para uma variação em sua atividade (ROUSE et al., 1952). Em um estudo com tomates, Fachin et al. (2002) demonstraram que a PME purificada pode ser mais termoestável do que aquela proveniente de um extrato bruto. Porém, o uso dessa enzima na indústria de alimentos como indicador de tratamento térmico requer uma análise sem etapas prévias de purificação, uma vez que é o comportamento desses extratos brutos provenientes do suco processado que possuem maior relevância.

A Tabela 5 mostra os resultados obtidos para os parâmetros cinéticos da PME presente nos sucos de caju e graviola. Como já foi dito anteriormente (Figura 4A), a PME oriunda do suco de caju mostrou-se muito resistente ao tratamento térmico e isso também pôde ser comprovado pelos valores dos dados cinéticos encontrados. De acordo com a constante de inativação que foi inexistente, a PME não será inativada a 55 e 65 °C e a partir dessas temperaturas, a inativação pode ocorrer, porém lentamente. Os parâmetros cinéticos do suco de graviola também indicam que essa enzima foi pouco afetada pelo tratamento térmico aplicado, sendo necessários 109,6 min a 90 °C para reduzir em 90% sua atividade.

Tabela 5. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da pectinametilesterase de sucos de caju e graviola.

Temperatura (°C) Suco k (min-1) D (min)

55 Caju - - Graviola 0,012 191,91 65 Caju - - Graviola 0,013 177,15 75 Caju 0,018 127,94 Graviola 0,018 127,94 85 Caju 0,011 209,94 Graviola 0,016 143,93 95 Caju 0,019 106,84 Graviola 0,021 109,66

A cinética de inativação térmica da PME já foi bem estudada em produtos à base de tomate, havendo uma variação significativa na literatura entre os valores encontrados para esses parâmetros. Em análise de PME de suco de tomate submetido a tratamentos sob diversas temperaturas, Terefe et al. (2009) encontraram valores de constante de inativação entre 0,026 min-1 a 60 °C e 0,57 min-1 a 75 °C, os quais correspondem a valores D de 89 e 4,04 min, respectivamente. A inativação da PME alcançada para esse suco de tomate a 60 °C só é conseguida para o suco de graviola a 95 °C (k = 0,021 min-1), o que reflete a elevada estabilidade térmica dessa enzima em graviola. Raviyan et al. (2005) encontraram valores D que variaram de 1,5 a 36,4 min em estudos de inativação da PME a 70 °C, um valor muito mais baixo do que foi encontrado neste trabalho para os sucos de caju e graviola, o que reflete a alta estabilidade térmica dessa enzima nesses dois sucos. Anthon et al. (2002) relataram valores D de 7,2 e 10,4 min para a inativação térmica a 70 °C de PME em suco de tomate para as cultivares BOS 3155 e CXD-199, respectivamente. Nos sucos de caju e graviola aqui analisados, os valores a 75 °C foram maiores indicando que seria necessário um tempo dez vezes maior para atigir o mesmo nível de inativação.

Vários fatores podem ser responsáveis pelas discrepâncias observadas entre os valores cinéticos citados. Alguns estudos trataram da inativação da PME em sucos ou purês de frutas, enquanto que outros realizaram o experimento sob elevadas temperaturas utilizando extratos enzimáticos ou suspensões dessa enzima em tampões com diferentes valores de pH. Tajchakavit et al. (1997) constataram que a PME de suco de laranja é estabilizada contra a desnaturação pelo calor por um aumento nos valores de pH e teor de sólidos solúveis totais. Anthon et al. (2002) observaram que a redução do pH de suco de tomate de 4,36 para 4, promove um aumento de 4 vezes na constante de inativação da PME a 71,8 °C, ou seja,

quanto menor o valor do pH da solução, menor é a estabilidade térmica dessa enzima. A cinética de inativação da PME também já foi determinada em extratos purificados e parcialmente purificados. Em geral, uma enzima é mais estável em tecido intacto ou em um homogeneizado de tecido, onde é protegida pela presença de outros materiais, tais como proteínas, carboidroatos e pectinas, do que em sua forma purificada (WHITAKER, 1972). Lopez et al. (1997) mediram a inativação dessa enzima em uma preparação parcialmente purificada em tampão citrato a pH 4 e encontraram um valor D a 70 °C de 1,53 min, refletindo a alta sensibilidade térmica da PME nesse tipo de extrato.

5.2.2 Poligalacturonase

Os resultados do tratamento térmico sobre a atividade da poligalacturonase estão apresentados nas Figuras 5A e 5B para os sucos caju e graviola, respectivamente.

No suco de caju, as temperaturas de 55 e 65 °C promoveram um aumento na atividade da PG nos 3 e 1 min iniciais, respectivamente. Após esses picos as atividades decaíram continuamente. Acima de 75 oC, observa-se uma queda gradual e lenta na atividade da PG chegando a 40% após 30 min a 85 e 95 oC. Os resultados encontrados para a PG se assemelham aos encontrados para a PME de suco de caju (Figura 4A), quando as temperaturas mais baixas estimularam a atividade de modo geral.

Figura 5. Atividade residual da PG nos sucos de caju (A) e graviola (B) em relação ao tempo sob diferentes temperaturas.

A PG do suco de graviola apresentou um decréscimo na atividade residual logo no primeiro minuto de exposição a todas as temperaturas testadas, sendo esse efeito mais acentuado a 75 °C quando a atividade residual chegou a 20% seguido por um aumento. Após essa queda inicial, as atividades apresentavam uma constância na atividade até o final do período de 30 min quando voltavam a cair, com excessão das temperaturas de 55 e 65 °C que apresentavam oscilações. A 85 e 95 °C, a PG do suco de graviola mostrou uma maior sensibilidade apresentando atividade residual de 26 e 18% após 30 min, respectivamente,.

Fachin et al. (2003) analisaram a atividade da poligalacturonase em suco de tomate submetido a temperaturas entre 40 e 90 °C por 5 min e observaram duas fases de inativação, a primeira em torno de 55 °C e a segunda aos 65 °C. Isso sugere a presença de isoenzimas de PG com diferentes termoestabilidades. Segundo esses autores, entre 55 e 65 °C a atividade residual dessa enzima manteve-se entre 60 e 80% devido a presença da PG1, a qual é termoestável. Anthon et al. (2002) estudaram a cinética de inativação da PG em sucos de tomates CXD199 e observaram que a isoforma termoestável, PG1, mantinha-se ativa com 15% da atividade inicial quando o suco era exposto a 85 °C, enquanto que a PG2 foi completamente inativada a 75 °C. A presença dessas isoformas com diferentes estabilidades térmicas poderia explicar o efeito dos tratamento acima de 65 °C sobre a PG do suco de graviola, onde a queda na atividade da isoforma menos estável, PG2, seria responsável pela redução na atividade residual observada no primeiro minuto de tratamento. A isoforma PG1, mais resistente a elevadas temperaturas, seria responsável pela atividade remanescente até o fim do tratamento.

Resultados contrários e que sugerem a existência de isoformas menos resistentes ao calor foram encontrados por Hsu (2008) que analisou o efeito do processamento térmico em suco de tomate e observou que a PG manteve apenas 12% de sua atividade após 2 min a 60 °C. Já Crelier et al. (2001) observaram uma completa inativação da PG após 3 min de exposição a 93 °C.

A Tabela 6 mostra os resultados obtidos para os parâmetros cinéticos k e D da PG nos sucos de caju e graviola tratados termicamente. Os resultados mostram a estabilidade térmica da PG do suco de caju, a qual apresentou valores de constante de inativação baixos em todos os tratamentos aplicados. Aos 55 °C, a atividade da PG do suco de caju apresentou um valor de k de 0,010 min -1 e demoraria 230,3 min para reduzir em 90% sua atividade. Os valores de k e D encontrados mostram que nenhum dos tratamentos aplicados foi capaz de inativar

completamente a PG em ambos os sucos, ratificando os resultados obtidos na análise da atividade residual (Figura 5A e B).

Tabela 6. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da PG em sucos de caju e graviola.

Temperatura (°C) Suco k (min-1) D (min)

55 Caju 0,010 230,30 Graviola 0,057 40,40 65 Caju 0,041 56,17 Graviola 0,044 52,34 75 Caju 0,036 60,60 Graviola 0,059 39,03 85 Caju 0,035 65,80 Graviola 0,047 49,00 95 Caju 0,050 46,09 Graviola 0,065 35,43

Há uma grande variação na literatura para os dados cinéticos de inativação térmica da PG. Em relação àqueles encontrados para sucos de caju e graviola, valores de constante de inativação mais elevados e que sugerem uma maior sensibilidade térmica dessa enzima foram encontrados por Terefe et al. (2009). Esses autores avaliaram o suco de tomate da variedade „Heinz 3402‟ e observaram que a constante de inativação da PG variou de 0,085 min-1

a 60 °C para 0,57 min-1 a 75 °C com os valores de D variando de 11,7 a 1,75 min. Fachin et al. (2002), também estudando produtos à base de tomate, encontraram um valor D de 3,99 min em extrato parcialmente purificado em tampão acetato de sódio (pH 4,4) tratado a 70 °C, enquanto que no suco sob a mesma temperatura o D encontrado foi 0,78 min. Em outro estudo de inativação térmica da PG em suco de tomates da variedade Flandria Prince, Fachim et al. (2003) observaram que a constante de inativação para essa enzima aumentava com o aumento da temperatura, apresentando valores de 0,0003 min-1 a 55 °C e 0,0035 min-1 a 65 °C, chegando a 0,013 min-1 a 70 °C. Crelier et al. (2001), estudando a cinética de atividade da PG em suco de tomate da variedade Nema 1401, também encontraram valores de k que aumentaram com a temperatura de tratamento: 0,0004; 0,0012; 0,0019; 0,0031 e 0,0131 min-1 a 80, 85 90, 97 e 105 °C, respectivamente. A partir desses baixos valores de constante de inativação, podemos observar que a PG proveniente do suco de tomate da variedade Nema 1401 mostrou-se mais resistente à elevadas temperaturas do que àquelas estudadas nos sucos de graviola, caju e demais variedades de tomate citadas.

Esses resultados variáveis não são incomuns, uma vez que a estabilidade das enzimas depende de vários fatores, tais como a fonte, pH e a composição da solução onde está

inserida. Pressey (1986), analisando a atividade da PG em purê de tomate, o qual apresenta uma elevada quantidade de partículas sólidas em suspensão, encontrou uma constante de inativação de 0,0031 min-1 após um tratamento a 90 °C, a qual é aproximadamente três vezes menor que a observada por Lopez et al. (1997) (k = 0,009 min-1) após tratar um extrato parcialmente purificado em tampão citrato (pH 4) sob a mesma temperatura, indicando que a PG foi mais estável quando em contato com substâncias oriundas do tecido vegetal do que quando isolada.