Avaliar a ação da L-Arginina exógena nas estruturas da parede intestinal em ratos recém-nascidos submetidos a hipóxia e reoxigenação. Constatar através dos indicadores de lesão tecidual – alterações histopatológicas e imuno-histoquimica, peroxidação lipídica e concentração do óxido nítrico tecidual, a existência ou não, de um efeito protetor significativo em lesões intestinais.
3. MÉTODOS
O protocolo de pesquisa encaminhado para exame e avaliação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de São Paulo - Unifesp/EPM, sob n. 1662/05, foi aprovado em 06 de janeiro de 2006. (anexo 1)
3.1 Amostras:
Doze (12) ratas prenhas fornecidas pelo CEDEME / Unifesp da linhagem Wistar EPM-1 outbread (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia), foram separadas e mantidas em ambiente assistido: acomodação, higiene, temperatura (21 a 23°C), ciclo claro/escuro de 12 hs, ração própria para a espécie e água à vontade. Após 21 dias as ratas pariram noventa e três (93) crias com peso entre 3,8 e 7,0 g. Utilizando como fator de exclusão o peso (4,4 a 6,6 g), oitenta (80) filhotes recém-
nascidos de ambos os sexos foram sorteados e separados em três grupos de estudos.
Grupo 1: (n=32)
Animais recém-nascidos submetidos somente a hipóxia- reoxigenação
Grupo 2: (n=32)
Animais recém-nascidos recebendo um pré-tratamento de L- Arginina e submetidos a hipóxia-reoxigenação
Grupo 3: (n=16)
Animais recém-nascidos não submetidos a hipóxia-reoxigenação
Tabela 1: grupos de estudo
Grupo 1 grupo H/R Grupo 2 grupo ARG Grupo 3 grupo CTL
3.2 Experimento:
Os animais do grupo 3 (G3) não sofreram qualquer estimulo ou agressão artificial durante o experimento. Nos animais do grupo 2 (G2) foram infundidos via intraperitonial 0.2 ml de solução com L- Arginina (5%) 30 minutos antes dos eventos de hipóxia e reoxigenação (H/R). Numa câmara de acrílico transparente especial para inalação controlada de gases, medindo 32 cm de altura, 34 cm de largura e 50 cm de comprimento (modelo CGS CO2 G – marca Beira-Mar - Brasil), as ninhadas dos grupos 1 (G1) e 2 (G2) foram submetidas a uma atmosfera contendo CO2 a 100% por 5 minutos e a seguir de O2 a 100% por outros 5
minutos. Eventos de hipóxia e reoxigenação foram repetidos 2x ao dia durante 03 dias consecutivos (1º, 2º e 3º dias de vida). Esse modelo já consolidado em outros trabalhos reproduz o stress oxidativo tecidual no intestino semelhante ao das crianças que desenvolvem ECN. Este protocolo é uma modificação dos métodos de Okur et al 50 e de Özkan et al 51. Após os eventos as crias novamente gozaram da companhia materna em temperatura apropriada. Ocorreram as mortes de sete (7) animais do grupo 1(H/R) e cinco (5) ratos do grupo 2 (ARG).
No 3º, 6º e 13º dia de vida, oito (8) filhotes dos grupos 1 e 2 e quatro (4) do grupo 3 foram submetidos à anestesia intraperitonial com 0,1 ml de uma mistura de anestésicos - 0,2 ml de Ketamina (10%) com 0,1 ml de Xilazina (2%). Praticou-se laparotomia e procurou-se a existência de sinais macroscópico de lesão isquêmica - edema, distensão, perfuração, necrose ou hemorragia nas víceras. Os intestinos foram totalmente retirados e amostras separadas, fixadas e conservadas em formalina para coloração de rotina e imuno-histoquimica ou acondicionadas e congeladas à – 80°C para dosagem do óxido nítrico tecidual e d o malondialdeido (MDA).
3.3 Histopatologia:
De cada animal, um fragmento do íleo (1 cm) e do cólon (1 cm) foi isolado e fixado em formol, tamponado, desidratado, embebido em bloco de parafina e cortado. A seguir montado em laminas, parte foi corada pela hematoxilina-eosina (HE) para exame morfológico (mucosa, submucosa, vasos e fibras musculares) e parte processada pelo método imuno- histoquimica da avidina-biotina peroxidase para a pesquisa de estruturas do sistema nervoso entérico através da proteína S-100 e da Neuron Specific Enolase (NSE) para visualizar a presença de gânglios nervosos e realizar a contagem desses, como também o número de neurônios no interior. Cortes com 06 micrômetros foram analisados em microscopia óptica, por uma mesma patologista que desconhecia o grupo dos fragmentos examinados.
Análise histológica - hematoxilina-eosina
Utilizou-se microscópio binocular óptico com aumentos de 100 e 400 vezes para examinar as lâminas coradas pelo método da hematoxilina- eosina e a morfologia intestinal foi classificada segundo Chiu et al 52.
Grau 0: mucosa integra sem alterações.
Grau 1: mucosa apresenta vilosidades bem constituídas, sem processo inflamatório, sem lise celular, mas com formação do espaço sub- epitelial de Grunhagen.
Grau 2: mucosa com presença de espaço de Grunhagen, lises celulares e espaçamento maior entre as vilosidades.
Grau 3: a mucosa apresenta destruição das criptas das vilosidades, capilares dilatados e células inflamatórias.
Grau 4: destruição da estrutura das vilosidades, algumas somente com o esboço, contendo células inflamatórias e material necrótico, com hemorragia e ulceração glandular.
Grau 5: destruição de toda mucosa, não se observando qualquer estrutura glandular integra, presença de material amorfo depositado sobre a tela submucosa.
Figura 8 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) - vilosidades bem constituídas, unidas, sem sinais de infiltração, de lise celular, ausência de espaço subepitelial de Grunhagen, sem infiltrado celular e dilatação vascular - grau 0 - HE 400x
Figura 9 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) - vilosidades bem constituídas unidas, ausência de espaço subepitelial de Grunhagen, sem sinais de infiltração ou de lise celular, sem infiltrado celular e dilatação vascular - grau 0 - HE 400x.
Figura 10 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – vilosidades e criptas bem estruturadas, inicio da formação dos espaços de Grunhagen, sem infiltração, sem lise de células grau 1 - HE 400x.
Figura 11 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – vilosidades e criptas bem estruturadas, inicio da formação dos espaços de Grunhagen, sem infiltração, sem lise de células - grau 1 - HE 400x
Figura 12 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – vilosidades alargadas, intumescidas, espaços sub-epitelial de Grunhagen desenvolvidos, distanciamento do epitélio absortivo, estase capilar, inicio de lise celular - grau 2 - HE 400x.
Figura 13 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – vilosidades intumescidas, espaços sub-epitelial de Grunhagen, distanciamento e perda de continuidade do epitélio absortivo, estase capilar, inicio de lise celular - grau 2 - HE 400x.
Figura 14 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – destruição do ápice das vilosidades, lise celular, dilatação vascular, infiltrado inflamatório, presença de espaços sub- epitelial de Grunhagen - grau 3 - HE 400x.
Figura 15 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – dilatação vascular, perda área absortiva, grandes espaços de Grunhagen, destruição das criptas das vilosidades, lise celular, células inflamatórias - grau 3 - HE 400x.
Figura 16 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – comprometimento da submucosa, dilatação vascular, infiltrado inflamatório, lise celular, destruição das vilosidades, presença de espaços sub-epitelial de Grunhagen - grau 4 - HE 400x.
Figura 17 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – lise celular, evidencia de material necrótico, submucosa comprometida, destruição do ápice das vilosidades e criptas algumas com ulceração glandular e hemorragia, dilatação vascular - grau 4 - HE 100x
Figura 18 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – submucosa com infiltração inflamatória e depósito de material amorfo, vilosidades rotas, ulceração e hemorragia, presença de material necrótico na luz, vasos dilatados - grau 5 - HE 200x.
Figura 19 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – deteriorização das estruturas absortivas, material amorfo disperso, lesão da túnica submucosa, presença de material necrótico, alteração muscular e serosa - grau 5 - HE 200x
Análise histológica - imuno-histoquimica
Para a coloração da Proteína S-100 foi utilizado o kit: S-100 protein, P bovina, 1ml, DAKO, código Z 0311-1 e para coloração NSE o kit: neuron specif enolase, BBS / NC / VI – H13, MxH. 0,2ml, DAKO, código M0873-129. Foram realizadas contagens das estruturas ganglionares de tecido nervoso da parede intestinal (Proteína S-100) nas amostras de cada grupo. Os números de gânglios foram contados em 10 campos consecutivos, a partir de um campo aleatório inicial e seguindo da esquerda para a direita. No interior dos gânglios nervosos dos plexos mioentérico e submucoso os neurônios corados foram contados num total de 8 gânglios consecutivos na parede intestinal das amostras de cada grupo. Utilizou-se aumento de 400 vezes, e a identificação de tipos celulares pela imuno-histoquimica é possível pela presença de determinadas proteínas sintetizadas pelas células ganglionares e responsável por funções específicas no organismo. Moore isolou duas proteínas acidas solúveis no sistema nervoso que aparentemente não ocorriam em outro tipo de tecido 53. A proteína S-100 foi identificada no citoplasma da glia e a proteína NSE nos neurônios – corpo, dendritos, axônio. Essa propriedade é importante no estudo das doenças que afetam a inervação do trato gastrintestinal 54.
Figura 20 – gânglios do plexo nervoso mioentérico – proteína S-100 (íleo) 400 X