ÁLVARO EDMUNDO SIMÕES ULHOA CINTRA
“Enterocolite Necrosante: a influência da
L-Arginina nas alterações histopatológicas e
bioquímicas da parede intestinal de ratos
recém-nascidos submetidos às condições
de hipóxia e reoxigenação”
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) para obtenção do Título de Doutor em Ciências
ÁLVARO EDMUNDO SIMÕES ULHOA CINTRA
“Enterocolite Necrosante: a influência da
L-Arginina nas alterações histopatológicas e
bioquímicas da parede intestinal de ratos
recém-nascidos submetidos às condições
de hipóxia e reoxigenação”
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo (Unifesp) para obtenção do Título de Doutor em Ciências
Orientador: Prof. Dr. José Luiz Martins
Cintra, Álvaro Edmundo Simões Ulhoa.
“Enterocolite Necrosante: a influência da L-Arginina nas alterações histopatológicas e bioquímicas da parede intestinal de ratos
recém-nascidos submetidos às condições de hipóxia e reoxigenação” / Álvaro Edmundo Simões Ulhoa Cintra -
São Paulo, 2008. 92 f
Tese: (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo (Unifesp / EPM) Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação.
Título em Inglês: “Necrotizing Enterocolitis: the L-Arginin’s protector effect into histopathological and bioquimical changes on the newborn rat’s intestinals wall”
1. hipóxia 2. reoxigenação 3. L-Arginina 4. rato 5. Enterocolite necrosante
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
- UNIFESP -
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIRURGIA E EXPERIMENTAÇÃO
- strictu sensu -
Coordenador: Prof. Dr. José Luiz Martins
TESE DE DOUTORADO
Autor: Álvaro Edmundo Simões Ulhoa Cintra Orientador: Prof. Dr. José Luiz Martins
Título: “Enterocolite Necrosante: a influência da L-Arginina nas alterações histopatológicas e bioquímicas da parede intestinal de ratos recém-
nascidos submetidos às condições de hipóxia e reoxigenação”.
BANCA EXAMINADORA
Presidente: Prof. Dr. José Luiz Martins
Professor Titular de Cirurgia Pediátrica – Departamento de Cirurgia
Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).
Membros Prof. Dr. Joaquim Murray Bustorff Silva
Efetivos: Professor Titular de Cirurgia Pediátrica – Departamento de Cirurgia Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).
Prof. Dr. Mário Mantovani
Professor Titular de Cirurgia do Trauma – Departamento de Cirurgia Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).
Prof. Dr. João José Fagundes
Professor Livre Docente Disciplina do Aparelho Digestivo “coloproctologia”- Departamento de Cirurgia
Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Prof. Dr. Jacques Pinus
Professor Adjunto de Cirurgia Pediátrica – Departamento de Cirurgia Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).
Membros Prof. Dr. Pedro Munhoz Fernandez
Suplentes: Professor Adjunto do Departamento de Saúde Materno-Infantil Faculdade de Medicina da Fundação Universitária do ABC.
Prof. Dr. Fábio Luis Peterlini
GRATIDÃO
A Deus – Criador do Universo, fonte de amor e sabedoria.
Pela Vida, dádiva outorgada a cada um de nós,
Por Sua Misericórdia e Graça que nos alcança a todos e ultrapassa a toda compreensão e, sobretudo pelo Plano da Redenção do ser humano.
“Deus ama os seres humanos de tal maneira que deu seu Filho único, para que todo aquele que Nele crê..., tenha vida eterna”. João 3:16
“Ele tomou sobre si as nossas enfermidades, Ele carregou sobre si mesmo as nossas dores... verdadeiramente Ele foi ferido pelas nossas transgressões e moído pelas nossas iniqüidades; e o castigo que nos traz Paz estava sobre Ele, e pelas suas pisaduras fomos sarados”. Isaías 53:4 e 5
A Família - meu esteio, referência e segurança.
Meus saudosos pais Edmundo Ulhoa Cintra e Aurora Simões Cintra que me ensinaram o valor da dignidade humana e do empenho pessoal.
Minha amorosa esposa Ellen Rose Lehr Ulhoa Cintra, linda, sempre preocupada comigo, com atento cuidado, companhia e atenção, sorrindo ao meu lado nos dias bons, apoiando e incutindo ânimo quando as circunstâncias são difíceis.
Meus queridos filhos Everton Ulhoa Cintra, Clayton Ulhoa Cintra e Telma Ulhoa Cintra, razão de ser de minha vida.
Meus irmãos Carlos Edmundo Simões Ulhoa Cintra e Eliana Aurora Cintra Canteruccio, meus cunhados, sobrinhos e familiares pela convivência feliz em cada encontro.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. José Luiz Martins, modelo de cirurgião dedicado e homem de ciência, humilde e altruísta, pelo incentivo e apoio irrestrito, disponibilidade de atenção e de tempo, pela condução, correções e criticas construtivas, buscando sempre me ensinar a fazer pesquisa de valor.
Aos meus primeiros “mestres” na cirurgia pediátrica Prof. Dr. Virgilio Alves de Carvalho Pinto, Dr. Plínio Campos Nogueira, Dr. Manoel Reis Gonçalves Salvador, Dr. Geraldo Modesto de Medeiros, Dr José Osório de Oliveira Lira, pela paciência, simpatia e bondade para comigo, perseverança ao tomar residentes pela mão e ensinar a arte de avaliar, operar e participar no processo de mitigar o sofrimento do pequeno paciente.
Aos Profs. Dr. John Cook Lane, Dr. Renato Giuseppe Giovanni Terzi, Dr. Mário Mantovani, Dr. Juvenal Ricardo Góes, Dr. Domingo Marcolino Braile, Dr. João José Fagundes, Dra. Desanka Dragosavac, Dr. Nelson Adami Andreollo, Dra. José Antonio Gontijo, Dr. Konadin Metze e outros mais, que na Unicamp me ensinaram o “processo” de ensino e aprendizagem em medicina, mostraram o prazer de estudar, pesquisar e descobrir, de conhecer e transmitir, de maneira atrativa aos estudantes, o maravilhoso, o fantástico universo que é o Organismo Humano.
Aos Profs. Dr. Luiz Francisco Poli de Figueiredo, Dr. Djalma José Fagundes, Dr. Saul Goldenberg, Dr. Álvaro Nagib Atallah, Dr. João Luiz Moreira Coutinho de Azevedo, Dr. Murched Omar Taha, Dr. Eliézer da Silva, Dra. Miriam Ghiraldini Franco, Dr. Hélio Plapler, Dr. Ulysses Dória Filho, Dr. Afonso Caricati Neto e muitos outros que na Unifesp, contribuem na formação da massa crítica do pensamento médico-científico, na busca do conhecimento experimental, na compreensão baseada em evidências, no aprendizado com metodologia, na procura da verdade fisiológica.
As Profas. Dra. Francy Reis da Silva Patrício, Dra. Elisa Mieko Suemitsu Higa, Dra. Guiomar Nascimento Gomes, Dra. Gui Mi Ko, Dra.Edna Frasson de Souza Montero que participaram no desenvolvimento deste trabalho experimental, pela disposição e boa vontade ao levar avante a pesquisa, analisar sem tendências e buscar compreender os resultados obtidos.
Aos preciosos amigos Ricardo José Morelo (fotomicrografias), a Sonia Maria da Silva (dosagens), a Thais M. Fonseca (espectrofotometria/ MDA), a Margareth Gori Moura (NO), ao Davi Augusto Marski Filho (diagramação/formatação).
pesquisa, como também disponibilizar verbas para podermos ir aos congressos e fórum para apresentar o resultados de nosso trabalho.
As queridas e sempre atuantes: Valdelice Justiniano Soares, Nancí Cristina Vieira e Elaine Maria Alves Bazzi Dantas secretarias na disciplina de Cirurgia Pediátrica e na pós-graduação em Cirurgia e Experimentação, pela amizade e disposição para comigo.
Aos Pós-Graduandos da Unifesp com os quais tive o privilégio e a oportunidade de conviver nestes últimos anos, pela amizade e companheirismo construtivo, cada qual com suas ocupações e dificuldades, buscando sempre alcançar um melhor preparo para ser útil.
Meu profundo respeito aos animais de experimentação que tiveram sua vida sacrificada durante a realização deste trabalho científico.
Pensamentos:
“Assim é a vida. Quando paramos demais para avaliar os problemas e as dificuldades, perdemos tempo e nos distanciamos das nossas metas”.
“Encontrar defeitos é muito fácil, qualquer um pode fazê-lo, entretanto encontrar qualidades é tarefa para quem tem espírito nobre, capaz de inspirar êxito nas pessoas”.
“Todos temos tendência de sonhar com sucesso, prosperidade e bem estar, confundindo realização com objetivo. Objetivo é o alvo a ser alcançado, conquistando terreno passo a passo. Realização é o resultado dessa conquista”.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 e 2 - fotografias - ratas com as crias, inoculação intra-peritoneal de L-Arginina...34
Figura 3 e 4 - fotografias de câmara de gases para hipóxia e reoxigenação...36
Figura 5 - fotografia – laparotomia do animal de experimento...37
Figuras 6 e 7- fotografia – dissecção e exérese dos intestinos...38
Figura 8 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 0, HE 200x...41
Figura 9 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 0, HE 200x...41
Figura 10 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 1, HE 400x...42
Figura 11 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 1, HE 400x...42
Figura 12 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 2, HE 400x...43
Figura 13 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 2, HE 400x...43
Figura 14 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 3, HE 400x...44
Figura 15 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 3, HE 400x...44
Figura 16 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 4, HE 400x...45
Figura 17 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 4, HE 100x...45
Figura 18 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 5, HE 100x...46
Figura 19 - fotomicrografia de mucosa intestinal - grau 5, HE 200x...46
Figura 20 - fotomicrografia: plexo mioentérico – proteína S-100 (íleo) 400 X...48
Figura 21 - fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 1) grau 3 - HE 100X...55
Figura 22 - fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 1) grau 4 - HE 40X ...55
Figura 23 - fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 2) grau 2 - HE 400X...56
Figura 24 - fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 2) grau 2 – HE 100X...56
Figura 25 - fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 3) grau 0 - HE 400X...57
Figura 26 - fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 3) grau 0 - HE 200X...57
Figura 27 a 29 - fotomicrografia: gânglios (proteína S-100) 100x, 200x, 400x (grupo 3)...61
Figura 30 a 32 - fotomicrografia: gânglios (proteína S-100) 100x, 200x, 400x (grupo2)...62
Figura 33 - fotomicrografia: gânglios (proteína S-100) 400x (grupo2)...63
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - grupos de estudo (H/R, ARG, CTL)...33
Tabela 2 - classificação e Score - Análise das lesões intestinais...54
Tabela 3 - media e desvio padrão - gânglios do plexo nervoso intestinal de ratos...58
Tabela 4 - media e desvio padrão - neurônios do plexo nervoso intestinal...60
Tabela 5 - estatística - concentração do NO (µMol) no Íleo...64
Tabela 6 - estatística - concentração do NO (µMol) no Cólon...65
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - morfologia - grau de lesão tecidual intestinal ...54
Gráfico 2 - Comparação entre as médias dos gânglios do plexo nervoso intestinal...59
Gráfico 3 - Comparação entre as médias dos neurônios do plexo nervoso intestinal...60
Gráfico 4 - comparação dos grupos 1 e 2 - concentração do NO (µMol) no Íleo...64
Gráfico 5 - comparação entre os 3 grupos - concentração do NO (µMol) no Íleo...65
Gráfico 6 - comparação dos grupos 1 e 2 - concentração do NO (µMol) no Cólon...66
Gráfico 7 - comparação entre os 3 grupos - concentração do NO (µMol) no Cólon...66
Gráfico 8 - Media - concentração do NO (µMol) - Íleo e Cólon...67
Gráfico 9 - Desvio Padrão - concentração do NO (µMol) Íleo e Cólon...67
ABREVIATURAS - SÍMBOLOS
A...absorbância
ANOVA...análise de variância BSA...soro - albumina bovina ° C... ...graus Celsius
CBB...coomassie brilhant blue
CEDEME...Centro de desenvolvimento (Biotério) cm ...centímetro
CO2...gás carbônico
dp...desvio padrão
ECN...enterocolite necrosante neonatal EPM...Escola Paulista de Medicina et al ...colaboradores
G...grupo g...grama
H2O2...peróxido de oxigênio
NOS...óxido nítrico sintetase
NPP...nutrição parenteral prolongada O2...oxigênio
OUT...…...out-bread
pH...potencial hidrogênio iônico pO2 ...pressão de oxigênio
RN...recém-nascido rpm ...rotações por minuto TBA...ácido tiobarbiturico
TRIS...solução tampão de tris-hidroximetil-aminometano UI...unidade internacional
RESUMO
Objetivo: Investigar o efeito da L-Arginina em roedores submetidos às
condições de hipóxia e reoxigenação num modelo experimental de
enterocolite necrosante através da avaliação bioquímica dos valores
teciduais do óxido nítrico e do malondialdeido, como também pelas
alterações histopatológicas e imuno-histoquimicas dos intestinos.
Métodos: Utilizou-se 80 ratos recém-nascidos da linhagem Wistar EPM-1
ambos os sexos, pesando 4,4 a 6,6 g. Os animais foram distribuídos
aleatoriamente em 3 classes: grupo 1 (H/R) = (n 32) hipóxia e
reoxigenação, grupo 2 (ARG) = (n 32) pré-tratamento com L-arginina mais
H/R e grupo 3 (CTL) = (n 16) controle. Os animais dos grupos H/R e ARG
foram submetidos em câmara de gás numa atmosfera com CO2 a 100%
por 5 minutos em temperatura de 22° C e a seguir re oxigenados com O2 a
100% por outros 5 minutos, 2x/dia nos primeiros três dias de vida.
Morreram 7 animais do grupo 1 (H/R), 5 animais do grupo 2 (ARG) e
nenhum animal morreu do grupo 3 (CTL). No 3º, 6º e 13º dias de vida oito
animais dos grupos 1 e 2 e quatro do grupo 3 foram anestesiados,
laparotomizados e os intestinos ressecados. Amostras de íleo e de cólon
foram conservadas em formalina para exame histopatológico e
para dosagens do óxido nítrico e malondialdeido tecidual. As lesões
intestinais foram classificadas segundo Chiu et al.
Resultados: Os grupos H/R e ARG apresentaram lesões características
da enterocolite necrosante, porém com melhor preservação das estruturas
no grupo ARG. A quantidade de gânglios do plexo mioentérico foi mais
numeroso no grupo que recebeu H/R e L-arginina (14.93 ± 0.51)
comparado ao que só recebeu H/R (11.10 ± 0.43) - estatisticamente
significante. O numero dos neurônios contados dentro dos gânglios
apresentou diferença estatisticamente significativa entre os grupos de
estudo (p = 0.0044). No íleo, a concentrações do NO revelou-se
significativamente mais elevado: G-H/R = 7,3 ± 2,0 µMol e G-Arg =16,5 ±
4,1 µMol (p=0,0019); entretanto, no cólon este efeito não foi significativo:
G-H/R = 10,7 ± 4,6 µMol e G-Arg = 15,6 ± 8,7 µMol (p=0,2480).
Observou-se significativa diferença entre os grupos 1 e 3 (0,0030), e grupos 1 e 2
(0,0213) quanto a presença de peroxidação lipídica, mas não se constatou
entre os grupos 2 e 3 (0,2771).
Conclusão: OOffeerrttaa ddee LL--aarrggiinniinnaa ccoonnttrriibbuuiippaarraa aauummeennttaarr os níveis de NO
tecidual, rreedduuzziirr aa ccoonncceennttrraaççããoo ddoo MMDDAA ee ddiimmiinnuuiirr aas lesões na parede s
ABSTRACT
Aim: This study highlights the relevance of the mechanism injury on
developmental of the Necrotizing Enterocolitis a pediatric surgical condition
and the investigative interest in L-Arginine - substance with bowel
protective effects at the events of hipóxia/reoxygenation. There is
histopathological and immuno-histochemical evaluation of the intestinal
wall, tecidual analysis of the NO levels and comparisons among the
concentration of the MDA.
Methods: 80 newborn rats Wistar EPM-1 were raffled and labeled as
group 1: hypoxia/reoxygenation (n 32); group 2: L-Arginine pretreatment
and H/R (n 32); group 3: control (n 16). The rats of groups 1 and 2 were
exposed twice a day during 3 consecutive days and gas chamber with CO2
(100%) for 5 minutes followed of reoxygenation with O2 (100%) for others 5
minutes. Thirty minutes before H/R there was injected 0,2 ml of L-Arginine
solution (5%) in peritoneum of group 2. Twelve rats of the groups 1 and 2
group 3 were anaesthetized and sacrificed on 3º, 6º and 13º days. Total
intestinal were cut off to evaluation histopatology (HE, S-100 and NSE),
frosted (-80°C) to NO and MDA analysis. Intestinal injuries were classified
to Chiu’s criteria.
Results: Macroscopically were not observed signs of H/R-induced
intestinal injury. NEC characteristic damage showed groups 1 and 2, more
grades 4 injuries in group 1 and grades 2 injuries in group 2 (p< 0,05).
There is signification difference on ganglions and neurons numbers of the
mioenteric plexus. The NO levels in the ileum were much higher with group
2 (16.5 ± 4.9; p = 0.0019) and group 1 (7.3 ± 2.0), but were not in colon (p
= 0.2480). The MDA compare groups 1-3 (0,0030) and 1-2 (0,0213) were
significance, but were not groups 2-3 (0,2771).
Conclusions: Arginine attenuate the newborn rats intestinal injury
unchained to H/R.
SUMÁRIO
1. Introdução...pág 18
2. Objetivos...pág 31
3. Métodos...pág 32
3.1 amostras...pág 32 3.2 experimento...pág 35 3.3 histopatologia...pág 39 3.4 óxido nítrico...pág 48 3.5 malondialdeido...pág 49 3.6 analise estatística...pág 52
4. Resultados...pág 53
4.1 exame histopatológico...pág 53 4.2 exame imuno-histoquimico...pág 58 4.3 determinação do NO...pág 64 4.4 determinação do MDA...pág 68
5. Discussão...pág 69
6. Conclusão...pág 78
7. Referências...pág 79
“Enterocolite Necrosante: a influência da
L-Arginina nas alterações histopatológicas e
bioquímicas da parede intestinal de ratos
recém-nascidos submetidos às condições
de hipóxia e reoxigenação”
1. INTRODUÇÃO
A Enterocolite Necrosante (ECN) é a emergência gastrintestinal mais
freqüente do recém-nascido, com alta prevalência na UTI neonatal e
elevada incidência no prematuro de muito baixo peso (11% em menores
de 1.500 g) 1, 2. Comumente se instala nas primeiras semanas de vida
causando intensa lesão na parede intestinal. Ressecções intestinais
extensas são realizadas nas complicações – perfuração e peritonite;
contribuindo para o alto grau de morbidade e mortalidade (45%) 3. Os
recém-nascidos sobreviventes geralmente desenvolvem graves distúrbios
Conquanto o mecanismo de ação não seja inteiramente conhecido,
estudos demonstram que hipóxia perinatal, isquemia intestinal,
prematuridade, baixo peso, deficiência de imunidade e sepsis são fatores
predisponentes na ECN 4, 5. A privação tecidual dos níveis de oxigênio
(O2) pela interrupção do suprimento sanguíneo (isquemia) desencadeia
uma serie de alterações no metabolismo celular que resulta na
desorganização da estrutura das células vivas, acarreta colapso no seu
funcionamento e pode evoluir para falência e morte celular.
Paradoxalmente, o aporte de O2 ao tecido isquêmico (reperfusão) inicia
uma seqüência de eventos geralmente mais danosa que o insulto
isquêmico.
A célula mantém-se viva em virtude do funcionamento adequado de
inúmeros processos bioquímicos dependentes de energia. Para tanto, as
células eucariontes produzem sua energia a partir da oxidação de
diversos compostos orgânicos utilizando o O2 molecular. Esses processos
oxidativos ocorrem no interior da mitocôndria onde a reação da glicose
com O2 molecular (glicólise) gera um quantum de energia que permite a
ligação de fosfato inorgânico (Pi) na molécula de adenosina difosfato
(ADP) formando o trifosfato de adenosina (ATP). O ATP é uma molécula
A glicólise produz 36 moléculas de ATP e a liberação de energia contida
nas ligações fosfato se dá pela ação de ATPases celulares. Esta energia,
ativa as moléculas envolvidas na manutenção e controle dos processos
vitais das células vivas. O transporte ativo de íons pela membrana,
atuação da bomba de sódio, transporte de cálcio, de glicose e outras
substâncias essenciais para o metabolismo, são processos celulares
vitais.
Na isquemia, a falta de O2 produz um colapso na produção de
energia na forma de ATP pela mitocôndria. Uma das conseqüências
desse colapso energético é o acumulo de cálcio no meio intracelular
devido ao aumento de sua entrada na célula e redução de sua saída para
o meio extracelular. O acumulo de cálcio intracelular ativa varias enzimas
que aumentam a produção de substâncias capazes de lesar as
membranas celulares (membrana plasmática, mitocondrial, lisossomal). A
lesão da membrana mitocondrial compromete ainda mais a produção de
energia e a lesão da membrana lisossomal libera enzimas proteolíticas
capazes de promover a “autodigestão” da célula. Ainda durante a fase de
isquemia o ATP existente é “catabolizado” a AMP, adenosina, inosina e a
hipoxantina. Em mamíferos a falta de energia celular (ATP) resulta no
passagem passiva do CL-, Na+ e Ca2+ para dentro da célula e do K+ e
MG2+ para fora. O acúmulo de cálcio intracelular ativaria a protease
calpaína e a transformação de dehidrogenase (XDH) em
xantina-oxigenase (XO). A XO é uma enzima altamente versátil, exercendo um
papel importante no catabolismo das purinas 9. Anóxia acarreta oxidação
incompleta de compostos químicos pela mitocôndria, dando origem a
moléculas com valências livres capazes de doar (redutores) ou receber
elétrons (oxidantes).
A reintrodução do oxigênio (reperfusão) não restabelece a função
mitocondrial e a membrana lesada mantém o acúmulo de cálcio no interior
da célula, a hipoxantina é oxidada em xantina e ácido úrico pela XO,
liberando radicais livres de O2 (RLO) - hidroxila (XOH) e ânions
superóxido (O2-), assim como espécies reativas de O2 (ERO) - peróxido de
hidrogênio (H2O2), que se ligam às proteínas, lipídeos (fosfolipídios de
membrana), carboidratos e ácidos nucléicos (DNA e RNA), podendo
produzir modificações da estrutura molecular com perda ou redução de
sua atividade biológica7. Nestas condições a XO é a maior fonte de
radicais livres de oxigênio no intestino 8. O radical hidróxido (OH) participa
na peroxidação lipídica, danosa reação biológica na qual radicais O2-
membranas das organelas e celular. Em condições fisiológicas, os efeitos
danosos do O2- é prevenido pela superoxido-dismutase (SOD), mas
durante a reperfusão dos tecidos isquêmicos essas defesas naturais
podem não estar respondendo 9. Mediadores inflamatórios e radicais
livres incluindo o fator de ativação plaquetaria, o fator de necrose tumoral
e os leucotrienos têm um importante papel na ECN 4, 5.
Nos intestinos, isquemia seguida de reperfusão (I/R) desencadeia
uma resposta inflamatória aguda motivada por severa redução do fluxo
sangüíneo local e também pela degranulação de mastócitos, formação
e/ou liberação de proteinases, radicais superóxidos, cascata da
coagulação, causando disfunção celular, lesão tissular, necrose e
apoptose 10, 11. Tal compreensão é relevante nas situações em que o fluxo
sanguíneo torna-se repentinamente muito reduzido – trama, choque; ou
precisa ser interrompido – aneurisma; quando o sistema circulatório
apresenta colapso ou cessa a perfusão tecidual. As lesões decorrentes da
I/R também são um importante determinante tanto da precoce disfunção,
como da tardia sobrevida de um enxerto de intestino delgado
transplantado 12.
O tecido intestinal é excepcionalmente sensível as manifestações de
interno mais sensível à influência de I/R 14. Enterócitos localizados no topo
das vilosidades são mais frágeis aos efeitos da isquemia e essa labilidade
poderia ser devido sua localização – no termino da arteríola central, no
ápice da cripta 15. Estudando isquemia em ratos, Hinnebusch e cols
demonstraram que a sensibilidade dos enterócitos à isquemia seria
dependente do estado de diferenciação dessas células 16. Degeneração da
inervação intrínseca intestinal pode ocorrer também após isquemia
intestinal relativa, mesmo não ocorrendo à necrose intestinal. Alterações
na função absortiva dos nutrientes tem sido observada após I/R do
intestino 17. Através do epitélio intestinal lesado a I/R facilitaria a passagem
de bactérias viáveis da luz intestinal a alcançar gânglios linfáticos
mesentérios e baço - translocação bacteriana. Estudos revelam que a
hipóxia também diminui o ritmo das contrações intestinais 18. Entretanto
Chan e cols observaram que o intestino de ratos prematuro é altamente
resistentes à lesão pós I/R, levantando a hipótese que a I/R sozinha na
ausência de outros fatores predisponentes, não seria suficiente para
causar a ECN 19. Tais dados sugerem que a ECN é causada pela
associação de fatores diversos. I/R no intestino propicia a formação de
citocinas inflamatórias e produção de radicais livres de oxigênio, que
inflamatória sistêmica (SIRS) e levando a falência de múltiplos órgãos
(MOF) 20. As lesões intestinais causadas por hipóxia e reoxigenação são
principalmente mediadas pelos radicais livres do O2 18.
Já em 1969, Lloydao estudar perfuração intestinal em RN com ECN,
encontrou que 80% dessas crianças apresentaram evidências clínicas de
asfixia perinatal e enfatizou a importância da hipóxia neonatal na
etiopatogenia da doença, introduzindo o conceito de redistribuição do fluxo
sangüíneo durante a asfixia – desvio do sangue dos vasos mesentérios
para órgãos mais vitais, com conseqüente isquemia intestinal mais intensa
neste sitio 21. Estudos recentes em animais corroboram que a asfixia
produz lesões intestinais, semelhantes da ECN 22. O íleo parece ser mais
resistente que o jejuno diante da I/R e o teor de óxido nítrico parece ser o
fator responsável por essa habilidade do íleo, mas a alta resistência do
intestino de prematuros não foi acompanhada de elevados níveis de óxido
nítrico 23.
A terapêutica das lesões na I/R deveriam incluir agentes
farmacológicos que atuam na etiopatogenia. Pesquisadores têm se
ocupado a procura de substancias capazes de proteger os tecidos da
agressão na I/R. Vários agentes farmacológicos tem sido descritos como
somastatina, n-acetilcisteina, glucagom, perfluorocarbono intraluminal,
glicina, etc. Recentemente estudos tem mostrado o papel dos receptores
das proteinase
Estudos têm demonstrado que o Óxido Nítrico (NO) exerce um
importante papel regulador/modulador em condições homeostáticas e nas
inflamatórias. Ele pode atuar como vasodilatador e inibidor plaquetário,
assim como pode interferir prevenindo a adesão de neutrófilos. O NO
liberado pode também levara formação de espécies altamente reativas
como o peroxinitrito e nitrosotiois capazes de causar dano mitocondrial,
alem de inibir a proliferação celular via inibição da poliamino sintetase 19, 23,
76. NO é um radical livre, gasoso que causa vasodilatação arteriolar.
Resulta da produção endógena nos neurônios, plaquetas, neutrófilos e
células endoteliais, aumenta os níveis citoplasmáticos de GMP-cíclico,
inibindo a agregação e a adesão plaquetaria e reduzindo a ocorrência de
eventos tromboembólicos 24. A liberação basal de NO pelas células
endoteliais modula o tônus vascular sistêmico, e a inibição da síntese de
NO resulta num aumento da pressão arterial em ratos normotensos 25. NO
é sintetizado a partir da L-Arginina por uma complexa reação onde se
forma citrulina e catalisada pela óxido nítrico-sintetase (NOS). São
NOS (nNOS) e induzivel NOS (iNOS) 26. Nos intestinos, NOS é encontrada
no epitélio, musculatura lisa, plexos nervosos, além dos leucócitos 27. As
denominadas formas construtivas (eNOS e nNOS), são as que mais se
manifestam e liberam NO por curtos períodos, em resposta à estimulação
física. A induzida (iNOS), se manifesta após ativação dos macrófagos e de
outras células imunitárias geralmente em condições patológicas 28.
Quando ativadas sintetizam por períodos longos, mas podem ser inibidas
por N-Mono-Metil-Arginina (L-NMMA) e pelos glicocorticoides. A indução
da iNOS produz aumento de NO e de peróxi-nitrito que lesa os tecidos,
sendo benéfico sua inibição 29. Suspeita-se que iNOS seja um importante
mediador na lesão da reperfusão30. Cuzzocrea e cols não confirmaram
esse achado, Wu e colsdemonstraram que a formação de iNOS após I/R
do intestino induz a apoptose 31, 32. Os receptores das células endoteliais
quando estimulados por substancias vasodilatadoras – acetilcolina,
bradicinina, substancia P, histamina, ou por estímulo mecânico - aumento
do fluxo sanguíneo local na hipertensão; induzem a síntese de NO.
Quando produzido pela célula endotelial estimulada, o NO ao atingir
as fibras musculares lisas da camada media do vaso, liga-se ao
grupamento heme da enzima guanilato-ciclase. Esta enzima é responsável
guanosina-cíclica (GMPc) que em ultima analise responde pela ação e
efeitos do NO. Elevadas taxas de GMPc determinam diminuição de cálcio,
redução da força de contração muscular, relaxamento da musculatura,
conseqüente vasodilatação e queda da pressão arterial.
Uma vasoconstrição localizada de um segmento vascular provoca o
aumento compensatório e liberação local de NO, que modula o
relaxamento, participando do mecanismo de adaptação cardiovascular
para a manutenção da pressão arterial dentro de valores normais. A
administração exógena de NO pode produzir seletiva vasodilatação da
artéria pulmonar. A infusão venosa de inibidores da NOS, como a L-NMMA
– com bloqueio da síntese, determina a elevação da pressão sistêmica em
animais e da pressão na artéria braquial em seres humanos voluntários.
Evidências significativas sugerem que o NO é o mesmo composto
reconhecido como fator relaxante derivado do endotélio33. O fator relaxante
derivado do endotélio (EDRF) e o fator hiperpolarizante derivado do
endotélio (EDHF) induzem vasodilatação por mecanismos distintos. O
componente ativo do EDRF é o NO, que induz relaxamento da
musculatura lisa vascular mediada pela guanil-ciclase 34, 35, 36.
Em condições fisiológicas, NO predomina na microcirculação com
vascular normal, reduzir a aderência de leucócitos no endotélio, inibir a
agregação plaquetaria, reduzir a proliferação da musculatura lisa, limpar a
circulação dos radicais livres 37, 38. Entretanto durante a fase precoce da
reperfusão na I/R do intestino há acumulo de radicais livres (O2-). Nestas
circunstancias há uma tendência para os polimorfonucleares (PMNs)
aderirem ao endotélio e ocorrer agregação das plaquetas 39. O2- sofre
dismutação espontânea para H2O2 que pode promover a ativação da
fosfolipase A2 (PLA2) e levar ao acumulo de mediadores inflamatórios tais
como fator de ativação plaquetaria (PAF) e leucotrienos (LTB4). Diante
disso uma diminuição da produção endógena de NO tem conseqüências
desastrosas resultando em disfunção no endotélio e lesão tissular mediada
pelo PMNs.
A L-Arginina, é um aminoácido não essencial, e precursor do NO.
Conquanto a L-Arginina exógena não cause relaxamento dependente do
endotélio, peptídeos de alto peso molecular contendo arginina
(poli-L-arginina) podem fazer 40. A vasodilatação produzida por ele pode ser
inibida por bloqueio competitivo no metabolismo endotelial da L-Arginina
pelas enzimas NG-nitro-L-Arginina e NG-monometil-L-Arginina 41, 42. Foi
demonstrado que poli-L-arginina (10-11 a 10-7 M) induz relaxamento
semelhante ao relaxamento produzido pelo NO 43. Outros autores
observaram que poli-L-arginina induz relaxamento dependente do
endotélio em coronárias normais e em reperfundidas de cães 44. Isso se
daria pelo bloqueio exclusivo da ciclo-oxigenase. O pré-tratamento com a
oxihemoglobina (10-5 M) atenuou o relaxamento dependente do endotélio
causado pela poli-L-arginina, com glibenclamida (10-6 M) não afetou e com
azul de metileno (10-6 M) que inativa a guanil-ciclase na musculatura
vascular, não inibiu. O cloreto de potássio em concentração 40nM inibiu
completamente o relaxamento dependente do endotélio causado pela
poli-L-arginina 45. Assim em animais, tem-se observado que embora o NO
liberado no endotélio seja fundamental na modulação do tônus vascular
periférico, as poliaminas da L-Arginina exercem um papel importante no
relaxamento dependente do endotélio, fator primordial na prevenção da
lesão tecidual que acontece durante e após a I/R. Estudos tem sugerido
que o NO e a L-Arginina atuam na manutenção da integridade mucosa do
intestinos. Os mecanismos através dos quais exercem essa ação ainda
não são claros, mas o efeito na proliferação celular e a redução da
apoptose pelo NO, e o estimular a recuperação da mucosa intestinal
através da liberação de hormônio do crescimento e/ou produção de
Baseado nestes conhecimentos propusemo-nos estudar em
roedores recém-nascidos, a influência da L-Arginina nas lesões intestinais
causadas por H/R. O estudo foi focado na agressão das estruturas da
parede intestinal – mucosa, submucosa, musculatura e vasos, mas
principalmente o efeito da L-Arginina sobre o plexo miontérico – gânglios
nervosos e neurônios. Avaliamos também, os níveis do NO tecidual e o
grau de peroxidação lipídica ocorrida nos intestinos. Buscou-se
compreender melhor a fisiopatologia da ECN e avaliar um provável efeito
2. OBJETIVO
2.1. Geral:
Estudar um aminoácido cujas características intrínsecas
possivelmente exerçam ação protetora na lesão tecidual observada na
enterocolite necrosante.
2.2. Específico:
Avaliar a ação da L-Arginina exógena nas estruturas da parede
intestinal em ratos recém-nascidos submetidos a hipóxia e reoxigenação.
Constatar através dos indicadores de lesão tecidual – alterações
histopatológicas e imuno-histoquimica, peroxidação lipídica e
concentração do óxido nítrico tecidual, a existência ou não, de um efeito
3. MÉTODOS
O protocolo de pesquisa encaminhado para exame e avaliação do
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de São Paulo -
Unifesp/EPM, sob n. 1662/05, foi aprovado em 06 de janeiro de 2006.
(anexo 1)
3.1 Amostras:
Doze (12) ratas prenhas fornecidas pelo CEDEME / Unifesp da
linhagem Wistar EPM-1 outbread (Rattus norvegicus albinus, Rodentia
mammalia), foram separadas e mantidas em ambiente assistido:
acomodação, higiene, temperatura (21 a 23°C), ciclo claro/escuro de 12
hs, ração própria para a espécie e água à vontade. Após 21 dias as ratas
pariram noventa e três (93) crias com peso entre 3,8 e 7,0 g. Utilizando
recém-nascidos de ambos os sexos foram sorteados e separados em três grupos
de estudos.
Grupo 1: (n=32)
Animais recém-nascidos submetidos somente a
hipóxia-reoxigenação
Grupo 2: (n=32)
Animais recém-nascidos recebendo um pré-tratamento de
L-Arginina e submetidos a hipóxia-reoxigenação
Grupo 3: (n=16)
Animais recém-nascidos não submetidos a hipóxia-reoxigenação
Tabela 1:grupos de estudo
3.2 Experimento:
Os animais do grupo 3 (G3) não sofreram qualquer
estimulo ou agressão artificial durante o experimento. Nos animais do
grupo 2 (G2) foram infundidos via intraperitonial 0.2 ml de solução com
L-Arginina (5%) 30 minutos antes dos eventos de hipóxia e reoxigenação
(H/R). Numa câmara de acrílico transparente especial para inalação
controlada de gases, medindo 32 cm de altura, 34 cm de largura e 50 cm
de comprimento (modelo CGS CO2 G – marca Beira-Mar - Brasil), as
ninhadas dos grupos 1 (G1) e 2 (G2) foram submetidas a uma atmosfera
contendo CO2 a 100% por 5 minutos e a seguir de O2 a 100% por outros 5
minutos. Eventos de hipóxia e reoxigenação foram repetidos 2x ao dia
durante 03 dias consecutivos (1º, 2º e 3º dias de vida). Esse modelo já
consolidado em outros trabalhos reproduz o stress oxidativo tecidual no
intestino semelhante ao das crianças que desenvolvem ECN. Este
protocolo é uma modificação dos métodos de Okur et al 50 e de Özkan et
al 51. Após os eventos as crias novamente gozaram da companhia
materna em temperatura apropriada. Ocorreram as mortes de sete (7)
No 3º, 6º e 13º dia de vida, oito (8) filhotes dos grupos 1 e 2 e
quatro (4) do grupo 3 foram submetidos à anestesia intraperitonial com 0,1
ml de uma mistura de anestésicos - 0,2 ml de Ketamina (10%) com 0,1 ml
de Xilazina (2%). Praticou-se laparotomia e procurou-se a existência de
sinais macroscópico de lesão isquêmica - edema, distensão, perfuração,
necrose ou hemorragia nas víceras. Os intestinos foram totalmente
retirados e amostras separadas, fixadas e conservadas em formalina para
coloração de rotina e imuno-histoquimica ou acondicionadas e congeladas
à – 80°C para dosagem do óxido nítrico tecidual e d o malondialdeido
(MDA).
3.3 Histopatologia:
De cada animal, um fragmento do íleo (1 cm) e do cólon (1 cm) foi
isolado e fixado em formol, tamponado, desidratado, embebido em bloco
de parafina e cortado. A seguir montado em laminas, parte foi corada pela
hematoxilina-eosina (HE) para exame morfológico (mucosa, submucosa,
vasos e fibras musculares) e parte processada pelo método
imuno-histoquimica da avidina-biotina peroxidase para a pesquisa de estruturas
do sistema nervoso entérico através da proteína S-100 e da Neuron
Specific Enolase (NSE) para visualizar a presença de gânglios nervosos e
realizar a contagem desses, como também o número de neurônios no
interior. Cortes com 06 micrômetros foram analisados em microscopia
óptica, por uma mesma patologista que desconhecia o grupo dos
fragmentos examinados.
Análise histológica - hematoxilina-eosina
Utilizou-se microscópio binocular óptico com aumentos de 100 e 400
vezes para examinar as lâminas coradas pelo método da
hematoxilina-eosina e a morfologia intestinal foi classificada segundo Chiu et al 52.
Grau 0: mucosa integra sem alterações.
Grau 1: mucosa apresenta vilosidades bem constituídas, sem
processo inflamatório, sem lise celular, mas com formação do espaço
sub-epitelial de Grunhagen.
Grau 2: mucosa com presença de espaço de Grunhagen, lises
celulares e espaçamento maior entre as vilosidades.
Grau 3: a mucosa apresenta destruição das criptas das vilosidades,
capilares dilatados e células inflamatórias.
Grau 4: destruição da estrutura das vilosidades, algumas somente
com o esboço, contendo células inflamatórias e material necrótico, com
hemorragia e ulceração glandular.
Grau 5: destruição de toda mucosa, não se observando qualquer
estrutura glandular integra, presença de material amorfo depositado sobre
Figura 8 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) - vilosidades bem constituídas, unidas, sem sinais de infiltração, de lise celular, ausência de espaço subepitelial de Grunhagen, sem infiltrado celular e dilatação vascular - grau 0 - HE 400x
Figura 10 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – vilosidades e criptas bem estruturadas, inicio da formação dos espaços de Grunhagen, sem infiltração, sem lise de células
grau 1 - HE 400x.
Figura 12 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – vilosidades alargadas, intumescidas, espaços sub-epitelial de Grunhagen desenvolvidos, distanciamento do epitélio absortivo, estase capilar, inicio de lise celular - grau 2 - HE 400x.
Figura 14 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – destruição do ápice das vilosidades, lise celular, dilatação vascular, infiltrado inflamatório, presença de espaços sub-epitelial de Grunhagen - grau 3 - HE 400x.
Figura 16 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte transversal) – comprometimento da submucosa, dilatação vascular, infiltrado inflamatório, lise celular, destruição das vilosidades, presença de espaços sub-epitelial de Grunhagen - grau 4 - HE 400x.
Figura 18 – fotomicrografia de mucosa intestinal (corte longitudinal) – submucosa com infiltração inflamatória e depósito de material amorfo, vilosidades rotas, ulceração e hemorragia, presença de material necrótico na luz, vasos dilatados - grau 5 - HE 200x.
Análise histológica - imuno-histoquimica
Para a coloração da Proteína S-100 foi utilizado o kit: S-100 protein, P bovina,
1ml, DAKO, código Z 0311-1 e para coloração NSE o kit: neuron specif
enolase, BBS / NC / VI – H13, MxH. 0,2ml, DAKO, código M0873-129. Foram
realizadas contagens das estruturas ganglionares de tecido nervoso da
parede intestinal (Proteína S-100) nas amostras de cada grupo. Os números
de gânglios foram contados em 10 campos consecutivos, a partir de um
campo aleatório inicial e seguindo da esquerda para a direita. No interior dos
gânglios nervosos dos plexos mioentérico e submucoso os neurônios corados
foram contados num total de 8 gânglios consecutivos na parede intestinal das
amostras de cada grupo. Utilizou-se aumento de 400 vezes, e a identificação
de tipos celulares pela imuno-histoquimica é possível pela presença de
determinadas proteínas sintetizadas pelas células ganglionares e responsável
por funções específicas no organismo. Moore isolou duas proteínas acidas
solúveis no sistema nervoso que aparentemente não ocorriam em outro tipo
de tecido 53. A proteína S-100 foi identificada no citoplasma da glia e a
proteína NSE nos neurônios – corpo, dendritos, axônio. Essa propriedade é
importante no estudo das doenças que afetam a inervação do trato
Figura 20 – gânglios do plexo nervoso mioentérico – proteína S-100 (íleo) 400 X
3.4 Determinação do Óxido Nítrico Tecidual:
O óxido nítrico (NO), também conhecido com fator relaxante
derivado do endotélio (EDRF) é um gás muito instável, com peso
molecular de 30d e vida média próximo de 3 a 5 segundos quando em
solução aquosa e condições fisiológicas de temperatura, pH, e tensão de
oxigênio, embora haja relatos de variações na sua vida média de até 50
como também em diversos outros tecidos: neutrófilos, macrófagos,
fibroblastos, plaquetas, cérebro, miocárdio, hepatócitos; acreditando-se
que todas as células possam ser capazes de produzir NO. Sintetizado a
partir do substrato L-arginina sob a ação da enzima óxido-nítrico-sintetase
(NOS), atua provocando vasodilatação na microcirculação, maior perfusão
nos tecido e melhor aporte de oxigênio e nutrientes.
Amostras do intestino resfriadas a –80°C, são desco ngeladas,
homogeneizadas e desproteinizadas. Pela reconversão dos nitritos
formados as concentrações do NO foram medidas indiretamente no
aparelho “Sievers Instruments Model 280 NOA” unidade em microMol
(µMol) – em dosagens duplicadas.
3.5 Determinação de Malondialdeido:
A dosagem do malondialdeido (MDA) é tradicionalmente usada
como uma indicação da existência de peroxidação lipídica induzida pela
presença de radicais livres nos tecidos. A peroxidação lipídica é uma
reação biológica danosa que se processa durante a reperfusão, na qual
(O2-) agridem a membrana celular e das organelas, atuando sobre os
ácidos graxos das cadeias fosfolipídicas nelas presentes, prejudicando a
função de barreira seletiva que essas membranas realizam e
desorganizando a estrutura e a atividade celular. Em condições de
normalidade fisiológica os radicais livres formados, são neutralizados pela
superóxido dismutase.
MDA é um metabólito, o produto final gerado da peroxidação lipídica
e um parâmetro estabelecido para detectar/determinar o aumento de
radicais livres do oxigênio no tecido intestinal, após uma fase de
isquemia/reperfusão. Para dosar o MDA foi empregado o método de
Ohkawa et al 55 sendo os valores expressos em nanomoles (nmol) de
MDA por miligrama (mg) de proteína por grama (g) de tecido.
Dosagem do homogeneizado: - proteína.
Amostras do intestino congeladas à -800C foram descongeladas em
gelo fresco e pesadas, homogenadas em solução tampão de TRIS 0,01 M
com KCL 0,2 M (pH 7.4) em volume de 1ml/50mg, em 4 series de 30
Dosagem do sobrenadante: - aldeído.
Utilizou-se o kit: Oxi-Tek TBARS, BL/+4, AXXORA, código ZMC –
0801192-KI01. Em 50 ul do sobrenadante do homogeneizado (amostras
em duplicata) se adiciona 50 ul de SDS (standard solution) contendo
sulfato de sódio e 1,25 ml de TBS (solução tampão) preparada
antecipadamente com acido tiobarbitúrico, ácido acético e hidróxido de
sódio. Mantido em banho quente (95°C) durante 60 mi nutos. A seguir
resfria-se em gelo por 10 minutos, centrifuga-se por 15 minutos a 3000
rpm e realiza-se a medida da absorbância em espectrofotômetro (510,
532 e 560 A)56.
Uma curva de calibração (sample standard curve) é traçada
utilizando-se uma solução padrão de MDA (100nmol/ml de malondialdeido
bis – acetilmetilo) e serve de referência. Os níveis de malondialdeido
3.6 Analise Estatística:
As variáveis quantitativas foram representadas pela média e desvio
padrão. Para amostras independentes, na análise do grau das lesões
tecidual utilizamos o teste de Kruskal-Wallis. Para verificar a
homogeneidade entre os grupos para as variáveis numéricas, utilizou-se o
teste estatístico ANOVA e os testes comparativos de Bonferroni e
Student-Newman-Keuls. Considerou-se o nível de significância de 0,05
(a = 5%) e os valores abaixo desse padrão foram considerados
4. RESULTADOS
Ao exame macroscópico da cavidade abdominal dos animais
estudados não se observou alterações na superfície do peritoneo e das
viceras ocas como sinais de distensão, edema, perfuração ou hemorragia
nas alças intestinais.
4.1 Exame Histopatológico:
hematoxilina-eosina
Nas laminas dos grupos 1 e 2 foram observadas lesões teciduais
características da ECN no íleo. O grupo 1 (H/R) apresentou
preponderantemente lesões do grupo 4 (mais intensas) enquanto que do
grupo 2 (ARG) lesões do grupo 2 (moderadas). Os animais do grupo 3
(CTL) em sua maioria, não apresentaram alterações morfológicas em
mucosa e submucosa (grau 0).
Foi comparado estatisticamente o grau de lesão tecidual dos
intestinos nos animais dos grupos de estudo, considerando (p < 0,05).
Entre os animais dos grupos 1 e 3 observou-se diferença estatisticamente
Tabela 2: classificação – Análise comparativa das lesões intestinais.
Entre os grupos 1 e 2 também observou-se significativa diferença
(p1-2 = 0,0233). Não se revelou diferença estatisticamente significativa
quando se comparou o grau de lesão entre os grupos 2 e 3 (p 2-3 = 0,334).
Grupo 01 Grupo 02 Grupo 03
Grau N = 8 Score (%) N = 8 Score (%) N = 4 Score (%)
0 0 0.00 0 0.00 3 75.00
1 0 0.00 2 25.00 1 25.00
2 0 0.00 4 50.00 0 0.00
3 3 37.00 1 12.50 0 0.00
4 4 50.00 1 12.50 0 0.00
Figura 21 – fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 1) grau 3 - perda área absortiva, grandes espaços de Grunhagen, destruição das criptas das vilosidades, dilatação vascular, lise celular, células inflamatórias - HE 100X.
Figura 23 – fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 2) grau 2 – vilosidades alargadas, intumescidas, espaços sub-epitelial de Grunhagen presente, distanciamento do epitélio absortivo, estase capilar, inicio de lise celular - HE 400X.
Figura 25 – fotomicrografia de mucosa intestinal (grupo 3) grau 0 vilosidades bem constituídas, sem espaços sub-epitelial de Grunhagen, ausência de infiltração ou lise celular HE 400X
4.2 Exame Imuno-Histoquímico: proteína S-100 e NSE
A comparação entre as médias do número de gânglios dos plexos
miontérico e submucoso da parede intestinal revelou diferença
estatisticamente significante entre os grupos 1 e 3 (p = 0,0117), grupos 1
e 2 (p < 0,05) e grupos 2 e 3 (p = 0,0295). Observou-se subjetivamente na
microscopia um aumento moderado no volume dos gânglios do grupo 1,
nos dias 3º, 6º e 13º, que não foi verificado nos grupos 2 e 3.
Tabela 3: média e desvio padrão; contagem de gânglios do plexo nervoso intestinal de ratos.
Proteína S 100 3º dia 6º dia 13º dia Média Padrão Desvio
Grupo 1 10.80 10.90 11.60 11.1000 0.4359
Grupo 2 14.80 14.50 15.50 14.9333 0.5132
Gráfico 2: Comparação entre as médias dos gânglios do plexo nervoso intestinal - Bonferroni
Constatou-se diferença estatisticamente significativa nas médias do
número de neurônios encontrados dentro dos gânglios entre os grupos 1 e
3 (p < 0,05) e os grupos 2 e 3 (p < 0,05) , porém não significativa entre os
Tabela 4: média e desvio padrão; número de neurônios nos gânglios do plexo nervoso intestinal.
Gráfico 3: Comparação entre as médias dos neurônios do plexo nervoso intestinal - Bonferroni
NSE (enolase) 3º dia 6º dia 13º dia Média Padrão Desvio
Grupo 1 2,12 2,64 2,87 2,5433 0,3842
Grupo 2 2,45 2,96 3,18 2,8633 0,3745
S 100
NSE
4.3 Determinação do Óxido Nítrico Tecidual:
Nas amostras de íleo, do 3º dia de vida, foi encontrada diferença
estatisticamente significativa na concentração média de óxido nítrico entre
os grupos 1 e 2 (p = 0.0023) e entre 1 e 3 ( 0,0040) mas não entre 2 e 3 (p
= 0,6915). O grupo do pré-tratamento com L-Arginina registrou maior
quantidade tecidual de NO: grupo 1 = 7,3 ± 2,0 µMol e grupo 2 = 16,5 ±
4,9 µMol (p=0,0019).
Tabela 5 - estatística – concentração do NO (µMol) no íleo.
0 5 10 15 20 25
1 2 3 4 5 6 7 8
grupo 1 grupo 2
H/R ARG CTL Kruskal-Wallis Resultados
Média 7.30 16.48 17.85 p = O.0019
Desvio Padrão 2.02 4.91 6.10 p (1 e 2) = 0.0023
p (1 e 3) = 0.0040
Gráfico 5 – comparação entre os 3 grupos - concentração do NO (µMol) no Íleo.
A comparação do nível do NO em cólon nas amostras do 3º dia, entre os grupos 1 e 2, grupos 1 e 3, e grupos 2 e 3, não apresentou diferença estatisticamente significativa ( p = 0,3568).
Tabela 6 - estatística – concentração do NO (µMol) no cólon
H/R ARG CTL Kruskal-Wallis Resultados
Média 10.7 15.6 15.9 p = 0.3568
Desvio Padrão 4.60 8.69 7.73 Grau de liberdade = 2
0 5 10 15 20 25 30 35 40
1 2 3 4 5 6 7 8
grupo 1 grupo 2
Gráfico 6 – comparação dos grupos 1 e 2 - concentração do NO (µMol) no Cólon.
Gráfico 8 - Média - concentração do NO (µMol) - Íleo e Cólon.
4.3 Determinação de Malondialdeido:
Nas amostras intestinais dos roedores no 3º dia de vida foram observados entre os grupos 1
(H/R) e 3 (CTL) e entre os grupos 1 (H/R) e 2 (ARG) diferença estatisticamente significativa nas
médias da concentração do MDA, respectivamente p = 0,0030 e p = 0,0213. Entre os grupos 2
(ARG) e 3 (CTL) com (p = 0,2771) a diferença das médias do MDA não foi estatisticamente
significativa.
Tabela 7 - estatística – concentração intestinal do MDA (nMol/mg proteínas)
Gráfico 10: comparação da concentração de MDA entre grupos - Student-Newman-Keuls
H/R ARG CTL Kruskal-Wallis Resultados
Média 8,91 6.01 4.73 p = O.0059
Desvio Padrão 1,90 1.81 0.93 p (1 e 2) = 0.0213
p (1 e 3) = 0.0030
5. DISCUSSÃO
Apesar de diversos estudos experimentais ainda não é inteiramente
compreendido o mecanismo de lesão tecidual na ECN, permanecendo a mais
grave doença gastrintestinal do período neonatal com elevada mortalidade
(45%) 1, 3, 6. A gravidade e o prognóstico na ECN estão também
correlacionados com o comprometimento de outros órgãos devido a liberação
de mediadores inflamatórios na corrente sangüínea 75. Vários fatores
agravantes e predisponentes já foram descritos, porém não se estabeleceu
um tratamento padrão de sucesso para a ECN. Modelos têm sido propostos
buscando reproduzir em animais as lesões intestinais características da ECN
objetivando estudar os fatores desencadeantes, os mecanismos de agressão
tecidual e avaliar possíveis substâncias protetoras. A isquemia intestinal
desempenha um importante papel na fisiopatologia da ECN devido à
sensibilidade da mucosa a hipóxia 2, 57. Durante a asfixia neonatal e hipóxia,
ocorre redistribuição da volemia com perfusão preferencial para órgãos mais
imprescindíveis em detrimento da pele e sítios esplâncnicos que sofrem
vasoconstrição e isquemia 20, 21, 22. A lesão da mucosa intestinal na H/R ocorre
pela redução do oxigênio indispensável à respiração celular dos tecidos, mas
reoxigenação envolvendo aumento da permeabilidade vascular, produção de
mediadores inflamatórios, ativação e adesão de polimorfonucleares,
agregação plaquetaria, infiltração de células inflamatórias, produção de
radicais livres, causando peroxidação lipidica e apoptose5, 14. Citocinas,
radicais superóxidos, fator de ativação plaquetaria, fator de necrose tumoral e
leucotrienos tem importante papel na ECN15, 16.
O tecido intestinal é excepcionalmente susceptível as manifestações
de hipóxia seguidas de reoxigenação 13. Autores observaram alterações
precoces na mucosa e no endotélio intestinal de animais expostos à hipóxia,
outros relataram necrose isquêmica intestinal nestas condições4, 8, 59.
Pesquisadores reproduziram as lesões da ECN utilizando alimentação
artificial com formula láctea acompanhada de múltiplos eventos de hipóxia e
hipotermia 2. Um modelo de H/R utilizando câmara de gás com atmosfera
controlada foi proposto por autores turcoscom obtenção de elevados índices
de lesões características de ECN em ratos 50, 51.
Substâncias diversas com potencial protetor dos tecidos
metabolicamente ativos tem sido alvo de pesquisa. Lactobacilos
acrescentados na dieta dos recém-nascidos diminuem os níveis de
fosfolipase A2 intestinal e de endotoxinas plasmática, reduzindo o risco de
marcadores bioquímicos da H/R e tem alguns efeitos benéficos nas
alterações histopatológicas dos intestinos de ratos induzidos a injuria 8. Entre
nós, Meyer e cols comprovaram que a glicina reduz a peroxidação lipidica
tecidual em ECN induzida por H/R em ratos 63. Sukhotnik e cols encontraram
que a exposição dos ratos a L-arginina oral em modelo de H/R, não previne o
intestino do dano isquêmico, mas acelera significativamente a reparação da
mucosa intestinal lesada 49, 61, 65. Interleucina recombinante humana poderia
reduzir as lesões intestinais de ratos 6, 64.
O NO participa em importantes processos biológicos e contribui para
manter a integridade da mucosa intestinal protegendo os intestinos das
agressões de mediadores inflamatórios 29, 37, 39. Atuando como vasodilatador
arteriolar o NO contribuiria para manter a perfusão distal e periférica dos
tecidos submetidos as condições de isquemia. Uma suplementação de NO
atenua a agressão tecidual intestinal em animais submetidos a I/R 23. Os
receptores das células endoteliais quando estimulados por substâncias
vasodilatadoras – acetilcolina, substancia P, bradicinina, histamina, ou pelo
aumento do fluxo sanguíneo local, induzem a síntese de NO 36. O NO alcança
as fibras musculares lisas da camada média do vaso e liga-se ao grupamento
heme da enzima guanilato-ciclase. Esta enzima converte o trifosfato de
análise é a responsável pela ação e efeitos vasodilatadores do NO. Taxas
elevadas de GMPc determinam uma diminuição de cálcio, redução da força de
contração muscular, relaxamento da musculatura, conseqüente vasodilatação
e queda da pressão arterial 72. Vasoconstrição localizada induz ao aumento
compensatório e liberação local de NO, que modula o relaxamento,
participando do mecanismo de adaptação cardiovascular para a manutenção
da pressão arterial 35, 38. Inalação do NO em baixas concentrações exerce
efeito atenuante na aderência leucocitária em I/R 62, 68. Em baixas
concentrações, o NO parece ter uma função fisiologia protetora, enquanto que
quando produzido em altas doses pode causar agressão intestinal 6. O NO é
sintetizado a partir da L-arginina sob a ação da enzima óxido nítrico-sintetase
(NOS) na formação de L-citrulina. As formas eNOS, nNOS, iNOS são
encontradas amplamente nos intestinos.Luo e cols constataram aumento no
grau das lesões intestinais em ratos após utilizar L-NAME para bloquear a
síntese do NO 60, 69. A arginase compete com a NOS na síntese do NO
reduzindo sua concentração tecidual 71. Em condições fisiológicas, NO
predomina na microcirculação com efeitos benéficos no intestino, entre eles
manter a permeabilidade vascular, reduzir a aderência de leucócitos no
endotélio, inibir a agregação plaquetaria, reduzir a proliferação da musculatura
que uma suplementação de NO atenua a agressão tecidual intestinal em
animais submetidos a I/R 5. O íleo parece ser mais resistente que o jejuno
diante da I/R e o teor de NO parece ser o fator responsável por essa
habilidade do íleo. Entretanto nos intestinos de prematuros não se observou
aumento nos níveis de NO, apesar de apresentarem grande resistência a
injuria 19.
Conquanto a L-arginina exógena não cause relaxamento dependente
do endotélio, peptídeos de alto peso molecular contendo arginina
(poli-L-arginina) podem fazer 40, 41, 45. Autores observaram que poli-L-arginina induz
relaxamento dependente do endotélio em coronárias normais e em
re-perfundidas 27, 42, 43, 44. Isso se daria pelo bloqueio exclusivo da
ciclooxigenase.
Nosso experimento buscou reproduzir as lesões típicas da ECN
utilizando um modelo de H/R em ratos recém-nascidos. Nossa hipótese foi
avaliar o efeito da L-arginina no tecido intestinal quando submetido às
condições de H/R. Nossas observações constataram que nos animais
submetidos exclusivamente a H/R, foram intensas às lesões teciduais
intestinais com alteração na estrutura. O grupo que recebeu previamente a
substrato de síntese do NO com a conseqüente produção aumentada e ação
vasodilatadora, o fator preservador do tecido intestinal?
Microscopicamente observou-se uma menor densidade de gânglios no
bordo anti-mesentérico em contraste com gânglios grandes, extensos e
alinhados no bordo mesentério. Entretanto os animais do grupo H/R
evidenciaram intensa dilatação vascular e um intumescimento dos gânglios
do plexo mioentérico. Tais estruturas estavam subjetivamente mais alargadas
ou aumentadas, mas não foram realizadas medidas específicas e essa
observação não foi notada nos outros grupos de estudo. Constatou-se,
entretanto nos animais do grupo ARG gânglios redondos e grandes no bordo
mesentério e pequenos e raros no bordo anti-mesentérico. No grupo CTL os
gânglios apresentavam-se abundantes e bem formados, também mais
numerosos no bordo anti-mesentérico quando comparado aos outros grupos.
As densidades de neurônios nos gânglios do bordo mesentérico foram
notadamente maiores. Numericamente os gânglios nervosos apresentaram
quantidades estatisticamente diferentes (H/R < ARG < CTL), enquanto que a
quantidade de neurônios dentro dos gânglios apresentou diferença
estatisticamente significativa somente entre os grupos H/R e CTL. Seriam as
alterações do plexo nervoso só observadas mais tardiamente como sugerido
