Espectrometria de Massas

O Espectrômetro de Massas utilizado foi o ESI-TOF-MS ultrOTOFQ fabricado pela

Bruker Daltonics, Billerica, MA, EUA.

O Espectrômetro de Massas empregado no presente estudo utiliza a técnica ESI ("electrospray ionization") para ionizar as moléculas das substâncias presentes na amostra. Esta técnica é apropriada para produzir macromoléculas ionizadas (quasimoléculas) superando a propensão de fragmentação apresentada por elas no momento da ionização (SILVERSTEIN et al. 1979; SILVERSTEIN et al. 2007).

As moléculas de uma determinada substância ionizada por um "electrospray" encontram-se em um estado quasimolecular onde o valor de m/z da quasimolécula é geralmente uma unidade maior ou menor que o valor da massa molecular do composto não-ionizado na dependência do "set up" do Espectrômetro. A massa de um íon de hidrogênio [H+] é equivalente a uma unidade

de m/z. Adicioná-lo (protonação) provê carga positiva à quasimolécula enquanto retirá-lo (desprotonação), carga negativa.

As moléculas, uma vez ionizados, deslocam-se em direção do analisador de massa que registra o tempo que cada íon consome para atingir o detector. Esse tempo de vôo ou tempo de descarga ("Time-of-Flight") depende de dois fatores: (1) da massa molecular do composto "m" e (2) da carga "z" da quasimolécula. Quanto maior a massa, mais lenta será a viagem e maior será esse tempo; por outro lado, quanto maior a carga, mais rápido será o deslocamento e menor será esse tempo. A análise do "Time-of-Flight" da quasimolécula é realizada considerando os dois fatores ao mesmo tempo por meio da utilização da relação entre a massa e a carga ("mass-to- charge ratio") com valores notados em "m/z" (SILVERSTEIN et al. 1979; SILVERSTEIN et al. 2007).

O desenvolvimento da técnica ESI e a sua importância na análise de macromoléculas biológicas acabou sendo motivo da indicação do Prêmio Nobel de Química concedido a John Bennett Fenn

em 2002.

A expressão dos resultados da Espectrometria de Massas se dá por intermédio de um gráfico chamado de Espectro. O eixo horizontal (das abscissas) exibe valores de massa/carga (m/z). O eixo vertical (das ordenadas) relatada a "Abundância Relativa das Quasimoléculas" ou, simplesmente, "Abundância Relativa". Portanto, um pico representa, graficamente, um par ordenado, onde "x" é o valor de m/z e "y" a Abundância Relativa. Cada valor "m/z" está relacionado com uma quasimolécula específica com resolução podendo chegar a mais de um milésimo. A ionização positiva ou protonação é devida ao "set up" determinado previamente às análises. No modo positivo, o valor do tempo de descarga de cada quasimolécula (pico) pode ser expresso por [M+H+]+ notado em m/z, onde M é a massa molecular do composto (somatória das massas atômicas dos elementos que a compõe), H+ (íon hidrogênio) é o próton adicionado nessa molécula pelo "electrospray", e a carga resultante é positiva (+). Portanto, em uma análise, no modo positivo, se um produto apresentar, e.g., uma quasimolécula (pico) com m/z = 52, a massa molecular desse composto deve ser 51 uma (unidades de massa atômica) ou 51 Da (Dalton).

Vários valores de m/z já foram correlacionados com a identidade química dos compostos e fazem parte da memória científica da sociedade humana. Quando se obtém um espectro de massa de um composto já cadastrado basta, para identificá-lo, realizar uma busca computadorizada em uma biblioteca de correspondência entre valores de m/z e estrutura molecular. A coincidência dos espectros de massas é uma evidência convincente da identificação que é, muitas vezes, aceita em procedimentos legais (SILVERSTEIN et al. 1979; SILVERSTEIN et al. 2007). Quando se observa em um espectro um pico com valor de m/z ainda não cadastrado, é necessário propor a sua estrutura molecular baseada nos reagentes e condições de sua obtenção.

4.3.1 Condições das Análises no Espectrômetro de Massas

As análises foram realizadas segundo as seguintes condições experimentais: => bomba de Infusão com fluxo de 130 µL / h;

=> utilização da água (H2O 100%) como fase móvel de solubilização;

4.3.1.1 Condições Operacionais do Espectrômetro de Massas

As condições operacionais do espectrômetro de massas foram as seguintes: => "End Plate": 4000 Volts;

=> "Capillary": 4500 Volts; => "Capillary Exit": 300 Volts; => "Skimmer": 1/55 Volts; => "Skimmer" 2: 25 Volts.

Devido ao fato do espectrômetro de massas possuir alta resolução, houve a necessidade de calibração interna e externa antes da realização das análises. Utilizou-se, tanto para a calibração interna quanto para a externa, a solução de NaTFA a 10 mg / mL (a sigla NaTFA representa "sodium trifluoroacetate").

Salienta-se que a análise do "Time-of-Flight" por meio de "Electrospray Ionization" apresenta altíssima resolução, ou seja, elevada capacidade de determinação de compostos separando íons em função de variações mínimas na relação entre a massa e a carga (m/z).

4.3.2 Extração das Amostras

Para analisar a medicação intracanal, foi necessário fluidificá-la e filtrá-la para se evitar o entupimento dos ductos do Espectrômetro de Massas. Portanto, extraíram-se amostras analisáveis das pastas pelo seguinte processo.

Foram adicionados 300 µL de água deionizada à pasta. Após esta adição, a amostra sofreu agitação durante 2 minutos o que a tornou menos viscosa. O líqüido resultante foi então passado por um filtro para Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para soluções aquosas. A amostra fluidificada e filtrada pôde, então, ser injetada no Espectrômetro de Massas.

4.3.3 Cronologia das Espectrometrias de Massas

As análises no Espectrômetro de Massas da solução de digluconato de clorexidina a 0,2% isolada e da pasta medicamentosa preparada com hidróxido de cálcio veiculado em solução de digluconato de clorexidina a 0,2% foram realizadas (S1) imediatamente; (S2) após sete e (S3) catorze dias do preparo.

4.3.4 Armazenamento das Amostras

Durante os períodos de espera de 7 e 14 dias, os espécimes foram acondicionados em recipientes de plástico com tampa e armazenados em estufa (Digital-Plus, 3M) a 36,5 ºC com 95% de umidade relativa.