ESPECTROSCOPIA DE ESPALHAMENTO RAMAN

A espectroscopia Raman é baseada no fenômeno de espalhamento inelástico da radiação. No espalhamento inelástico da radiação, ocorre a interação entre a radiação eletromagnética monocromática e a matéria através do campo elétrico existente, levando a um estado virtual de energia. O estado virtual pode ser considerado como uma distorção de curta duração da nuvem eletrônica, causada pelo campo elétrico oscilante da radiação51_{. A energia} neste estado virtual pode ser relaxada de duas formas: a molécula pode retornar ao estado original, conhecido com espalhamento elástico ou espalhamento Rayleigh, ou a molécula pode retornar a um estado energético diferente devido à mudança no seu estado vibracional, que caracteriza o espalhamento inelástico da radiação ou espalhamento Raman52; 53. A diferença entre a energia incidida e espalhada inelasticamente corresponde à diferença de energia entre dois níveis vibracionais. Dessa forma, a espectroscopia Raman fornece informação vibracional, assim como a espectroscopia na região do infravermelho48.

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Figura 3 - Espalhamento de Luz: (a) espalhamento inelástico (região Stokes); (b) espalhamento elástico (Rayleigh); (c) espalhamento inelástico (região anti-Stokes); (d) representação esquemática das formas de

espalhamentos da radiação (imagens adaptadas)52; 53_.

O espalhamento inelástico pode ocorrer de duas formas. Na primeira forma, o fóton espalhado possui energia inferior ao fóton incidente (Figura 3 - a). Neste caso, tem-se o espectro Raman na região chamada Stokes. Na segunda forma de espalhamento inelástico, o fóton espalhado possui energia superior ao fóton incidente. Esta região é conhecida como região anti- Stokes (Figura 3 - c). Nesta região, a intensidade de uma banda é diretamente proporcional à população do nível vibracional correspondente, que por sua vez é inversamente proporcional à energia necessária para popular este nível52.

A aplicação de transformada de Fourier (FT-Raman), o desenvolvimento de microcomputadores e lasers na região do infravermelho permitiram a difusão da utilização da técnica de espectroscopia Raman para análises químicas, principalmente em amostras biológicas.

18 2.4.3 ANÁLISE HIPERESPECTRAL DE IMAGENS

Nos últimos anos, a técnica de análise hiperespectral de imagens (HSI) tem demonstrado grande potencial na análise de autenticidade de alimentos. Esta técnica gera simultaneamente informações espectrais e espaciais das amostras analisadas a partir da combinação de tratamento computacional com dados de análise por espectroscopia ótica tradicional54.

Em uma análise espectroscópica tradicional, o resultado obtido é apresentado na forma de um único espectro I (λ), obtido em um único ponto da amostra. Um sistema de imagem fornece informações em duas dimensões, I (x, y). Em uma análise hiperespectral, um arranjo tridimensional é obtido, I (x, y, λ), em que cada pixel (x, y) apresenta o resultado de um espectro individual I (λ) ou, em outras palavras, cada comprimento de onda individual (λ) apresenta uma imagem espacial separada I (x, y)54; 55. Um arranjo tridimensional é apresentado na Figura 4:

Figura 4 - Informação em um hipercubo de uma imagem hiperespectral com um conjunto tridimensional I(x, y, λ).(Imagem adaptada)54

De um modo geral, cada pixel na imagem obtida possui um perfil espectral de acordo com a posição espacial correspondente. Este fator permite a visualização da distribuição de características de alterações na qualidade dos alimentos56.

A espectroscopia Raman de imagem pode ser obtida em dois modos: imagem (imaging) ou mapeamento (mapping). No modo imaging, uma determinada superfície da amostra é iluminada e uma imagem global da amostra é adquirida (similar a uma fotografia da superfície

19 da amostra). No modo mapping, a amostra é posicionada nos eixos x e y a partir da movimentação de uma plataforma móvel.

No modo mapping dois tipos de mapeamento podem ser obtidos: mapeamento pontual ou mapeamento em linha. No mapeamento pontual (point-mapping), um espectro é obtido em uma localização espacial xy da superfície selecionada da amostra (Figura 5 – (a)). Este ponto é denominado pixel. Após a aquisição dos espectros para a área selecionada da amostra, esses são agrupados em um arranjo tridimensional, em que x e y são as coordenadas do ponto de aquisição do espectro e z possui a informação acerca do número de onda do espectro obtido. Como vantagens, esta técnica apresenta alta resolução espectral, cobertura espectral total e confocalidade. Entretanto, as imagens apresentam baixa definição, a aquisição é lenta e o laser pode induzir danos na amostra57.

Outra forma de aquisição de dados é o mapeamento em linha (line-mapping). Neste tipo de análise, uma linha definida na superfície da amostra é analisada de cada vez (Figura 5 – (b)). Como vantagens, esta técnica apresenta confocalidade, alta resolução espectral e cobertura de ampla faixa espectral. Em contrapartida, é menos eficiente que o mapeamento pontual, é moderadamente lenta e apresenta imagens com definição moderada57_.

Figura 5 - Comparação entre os modos de aquisição de imagem por mapeamento utilizando a espectroscopia Raman: (a) Mapeamento pontual e (b) Mapeamento linear (ou em linha). (Imagem adaptada)57

Os dois modos de aquisição de espectroscopia Raman de imagem (mapeamento e imagem) geram imagens químicas das amostras analisadas. Entretanto, para extração da informação e interpretação dos dados químicos obtidos, é necessária a utilização de métodos quimiométricos de análise.

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2.5 QUIMIOMETRIA

Quimiometria é definida como a “disciplina química que utiliza métodos matemáticos e estatísticos, entre outros, empregando uma lógica formal para: 1) definir ou selecionar condições ótimas para procedimentos de análise e experimentos; e 2) obter o máximo de informação química relevante a partir da análise de dados químicos”58; 59_{. Genericamente, pode-} se dividir a quimiometria em três áreas principais: planejamento e otimização de experimentos, reconhecimento de padrões e calibração multivariada. Os métodos de reconhecimento de padrões podem ser utilizados para análise exploratória de dados, classificação de amostras e resolução de curvas60.

Diversas técnicas analíticas apresentam dados passíveis de tratamento quimiométrico, como técnicas cromatográficas acopladas a espectrômetros de massas, e métodos espectroscópicos de análises. Dentre estes, destacam-se as técnicas de espectroscopia molecular, tais como espectroscopia de absorção molecular na região do ultravioleta/visível - UV/vis, no NIR, e no MIR, espectroscopia Raman e espectrofluorimetria. Estas técnicas produzem sinais analíticos sobrepostos para matrizes complexas e encontram aplicação associada a métodos quimiométricos em diversas áreas, tais como arqueologia, bioanalítica, processos industriais, análise farmacêutica, ciência forense, ciência de alimentos, dentre outras58.