Espectroscopia na região do infravermelho

Análises espectroscópicas podem fornecer importantes informações a respeito da composição e propriedades de materiais, qualitativamente e/ou quantitativamente. Desde a década de 50, técnicas espectroscópicas na região do infravermelho já apresentam aplicação na indústria, entretanto, após o surgimento das técnicas quimiométricas e dos espectrofotômetros com transformada de Fourier (FT-IR), tornaram-se ferramentas indispensáveis em diversos ramos de pesquisa, da química à agricultura, e também no controle de qualidade nas indústrias (SIESLER et al., 2002).

A região infravermelha corresponde à parte do espectro eletromagnético situada entre as regiões do visível e das micro-ondas e é subdivida em três regiões: infravermelho próximo, médio e distante (Tabela 3). A espectroscopia no infravermelho baseia-se na absorção de radiação infravermelha por moléculas que convertem a radiação em energia de vibração molecular. A frequência de uma absorção depende das massas relativas dos átomos ligados, das constantes de força das ligações e da geometria dos átomos, deste modo, cada frequência de vibração pode ser associada a um tipo específico de ligação química (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2010).

Tabela 3 - Regiões do infravermelho

Região Número de ondas (cm-1₎

Próximo 14290 – 4000

Médio 4000 – 400

Distante 700 – 200

Fonte: Silverstein; Webster; Kiemle (2010, p.70).

Normalmente, as bandas no espectro de infravermelho são expressas em números de onda (cm-1_{) e as intensidades em absorbância. A absorbância (A) de} uma amostra é definida como o logaritmo decimal do inverso da transmitância (T) ou reflectância (R) (Equação 1):

A = log_ Eq. 1

onde a transmitância é a razão entre a energia radiante transmitida por uma molécula e a energia radiante que nela incide. Para medidas conduzidas por refletância, a transmitância é substituída pela refletância na equação. A refletância é definida como a razão entre a radiação refletida pela amostra e radiação incidente sobre a amostra (AMERICAN..., 2012).

Mesmo substâncias simples podem gerar um espectro relativamente complexo apresentando várias bandas de absorção na região do infravermelho. A radiação infravermelha absorvida pelas moléculas resulta em vibrações de deformações angulares e axiais. Somente vibrações que levam à alteração rítmica do momento dipolo da molécula são observadas no espectro de infravermelho. Como os átomos movimentam-se em um espaço tridimensional, uma molécula com

n átomos possui 3n graus de liberdade vibracionais. No caso de moléculas não lineares, 3 dos graus de liberdade descrevem a rotação das moléculas e três a translação, e o demais correspondem às vibrações fundamentais (aquelas que não envolvem alteração na posição do centro de gravidade da molécula). As moléculas lineares possuem 3n – 5 graus de liberdade, pois dois graus de liberdade descrevem a rotação molecular.

O número teórico de vibrações fundamentais ou frequências de absorção raramente é observado, pois as bandas correspondentes são acompanhadas de

vibrações harmônicas (múltiplos de uma dada frequência) e de combinações de frequências de absorção, além disso, podem haver vibrações fundamentais muito fracas para serem observadas ou as vibrações podem ser tão próximas que coalescem (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2010).

Moléculas diatômicas heteronucleares, moléculas poliatômicas com vibrações assimétricas e grupos funcionais ligados a polímeros são detectáveis no espectro infravermelho, pois possuem momento de dipolo. Normalmente, grupos funcionais que apresentam momento de dipolo intenso resultam em absorções intensas.

3.3.1 Espectrômetro de Infravermelho com Transformações de Fourier (FT-IR)

A espectrometria com transformações de Fourier se desenvolveu muito nas últimas décadas. O instrumento é basicamente composto por uma fonte de radiação infravermelha, um interferômetro, um espelho móvel e um fixo, célula da amostra, detector e um conversor analógico-digital, como na Figura 2.

Figura 2 - Esquema de um espectrômetro de FT-IR

No espectrômetro FT-IR, a fonte emite a radiação infravermelha contendo todas as frequências de interesse. Então o feixe de radiação passa pelo interferômetro onde é separado em dois caminhos por um separador de feixes. Cada caminho leva a um espelho, um fixo e um móvel, para que o feixe seja recombinado no interferômetro produzindo um sinal codificado, chamado interferograma. Como a intensidade pode ser variada pela movimentação precisa do espelho móvel, o interferograma contém a informação de intensidade para cada frequência produzida pela fonte. O feixe recombinado chega até a amostra ocorrendo uma interação, onde certas frequências são absorvidas ou apenas parcialmente absorvidas. O detector mede a intensidade total da radiação para todas as frequências geradas pela fonte, assim, quando a amostra absorve parte da radiação, a intensidade para determinada frequência é reduzida e medida pelo detector. Então, através de um computador, uma transformação de Fourier converte o interferograma, que está no domínio do tempo, para o domínio de frequências, obtendo-se finalmente um espectro de absorção no infravermelho (THERMO FISHER SCIENTIFC, 2007).

Os espectrômetros FT-IR possuem importantes características como instrumento analítico (THERMO FISHER SCIENTIFC, 2007):

x Fonte de radiação extremamente estável - se o tempo necessário de aquecimento da fonte for alcançado, será produzido o mesmo padrão de intensidades para a faixa de frequências definida;

x Rapidez na aquisição dos dados: leva-se aproximadamente um segundo para coletar uma varredura, a qual contém a informação de intensidade para todas as frequências produzidas pela fonte;

x Sensibilidade instrumental - é possível controlar quão bem o instrumento separa a informação da amostra do ruído instrumental determinando o número de varreduras que serão coletadas. Quando varreduras múltiplas são coletadas, usam-se seus valores médios para criar um espectro. A adição de mais varreduras pode melhorar a sensibilidade do instrumento, pois os sinais produzidos pela amostra são constantes, enquanto o ruído gerado pelos componentes do instrumento são aleatórios;

x Precisão e exatidão das posições das bandas - não há necessidade de calibração do instrumento nem de verificação das posições das bandas com amostras de referência, pois a calibração do instrumento é realizada de forma

automática previamente às análises através de um lazer localizado próximo à fonte, onde o valor da frequência gerada por esse é usado como referência; x Resolução das bandas: a resolução de um espectro refere-se à distância

mínima entre duas bandas. Uma resolução mais alta pode resultar em um espectro com mais bandas resolvidas e até mesmo revelar bandas estreitas, entretanto, o aumento desnecessário de resolução irá aumentar o tempo de coleta de dados sem aumentar a quantidade e qualidade de informação.

3.3.2 Espectroscopia na região do infravermelho médio (mid-IR)

A espectroscopia mid-IR é uma técnica analítica muito útil para fornecer informações estruturais de amostras de compostos puros. Desde 1900, a técnica já é utilizada na identificação de grupos funcionais em moléculas orgânicas (PASQUINI, 2003). Na região do infravermelho médio, a absorção de radiação corresponde às transições de vibrações fundamentais e grupos funcionais são caracterizados por bandas de absorção em determinados números de onda. A intensidade da absorção está diretamente relacionada à concentração do componente da amostra e, normalmente, obedece à lei de Lambert-Beer (Equação 2). Nesta equação, o valor da absorbância (A) é diretamente proporcional à absortividade molar (ε), ao caminho óptico (b) e à concentração molar (C), desta forma, quando a absortividade molar e o caminho óptico são constantes, é possível realizar uma análise quantitativa construindo-se uma curva analítica. Se mais de um constituinte na amostra apresenta absorção em um determinado comprimento de onda, o valor da absorbância para este comprimento de onda é a soma das absorbâncias de cada constituinte.

A = ε . b . C Eq. 2

Nos últimos anos, uma técnica muito rápida para a aquisição dos espectros no infravermelho médio tornou-se disponível para os espectrômetros FT-IR possibilitando a análise de um grande número de amostra em pouco tempo. A técnica é conhecida como refletância total atenuada (ATR – attenuated total

reflectance) que consiste em um acessório onde a amostra fica em contato com um cristal de diamante, germânio ou seleneto de zinco, e o feixe de radiação

infravermelha incide em uma das extremidades do cristal produzindo múltiplas reflexões enquanto interage com a amostra, refletindo até a outra extremidade do cristal em direção ao detector (Figura 3) (ALLISON, 2011). A profundidade da penetração da radiação na amostra pode ser controlada pela escolha do ângulo de incidência do cristal, desta forma, é possível evitar a saturação de sinais ou até mesmo aumentar a sensibilidade do método. Através desta técnica, é possível realizar análises precisas qualitativas e quantitativas de amostras sólidas e líquidas sem a necessidade de uma preparação prévia da amostra, requerendo apenas um volume de 1 mL para amostras líquidas. Portanto é uma técnica rápida, não destrutiva e que gera somente pequenas quantidades de resíduos.

Figura 3 - Esquema da refletância total atenuada (ATR)

Fonte: Elaborado pelo autor.

3.3.3 Espectroscopia na região do infravermelho próximo (NIR)

A radiação na faixa do infravermelho próximo foi detectada anteriormente à radiação na faixa do infravermelho médio, entretanto o uso da espectroscopia NIR passou a ser mais amplamente utilizada somente após o surgimento da quimiometria e do desenvolvimento da tecnologia dos espectrômetros na década de 80. A radiação NIR possui energia maior que a necessária para promover as moléculas de seu estado vibracional fundamental para seu estado vibracional excitado de menor energia e menor que a necessária para a excitação de elétrons nas moléculas. O uso de espectroscopia NIR em métodos analíticos apresenta grandes vantagens como: rapidez (um minuto ou menos para obtenção de um

espectro); é não destrutivo; apresenta elevada taxa de penetração do feixe de radiação; é adequado para uso in-line; é aplicável a qualquer amostra que possua moléculas com ligações C-H, S-H ou O-H; e requer mínima ou nenhuma necessidade de preparação de amostra (PASQUINI, 2003).

As bandas de absorção no espectro na região do infravermelho próximo são resultantes de combinações ou sobretons das vibrações fundamentais na faixa do infravermelho médio. Grupos funcionais que absorvem em determinada frequência no infravermelho médio irão apresentar sobretons múltiplos desta frequência, entretanto cada combinação subsequente irá apresentar uma intensidade cada vez mais fraca. O terceiro sobretom pode ser observado apenas para bandas fundamentais muito intensas e o quarto sobretom é normalmente muito fraco para ser observado.

Uma banda de absorção no infravermelho próximo pode ser resultante da combinação de duas ou mais bandas de transição fundamental. Por exemplo, uma molécula que possui um grupo funcional que absorve em 1750 cm-1 _{e outro grupo} que absorve em 3600 cm-1 _{apresentará uma banda de combinação em 5350 cm}-1 (GEMPERLINE, 2006).

Os detectores usualmente empregados em NIR são baseados em materiais fotocondutivos de silício, PbS e InGaAs. Junto a potentes fontes de radiação (lâmpadas de tungstênio ou halogênio), estes detectores podem gerar medidas com alta taxa de sinal/ruído, compensando parcialmente a baixa intensidade das bandas de absorção na região do infravermelho próximo (PASQUINI, 2003).

Na espectroscopia NIR, as medidas são usualmente realizadas no modo de refletância, permitindo análises de líquidos e sólidos sem nenhuma ou mínima preparação da amostra (OLIVEIRA, 2008). A técnica de refletância difusa é utilizada na área da agricultura desde 1965 e passou a ser acoplada aos espectrômetros modernos, como FT-IR. Nesta técnica, a radiação na faixa do infravermelho próximo entra em uma esfera de integração e passa por uma janela de safira até incidir na amostra interagindo com a mesma, então, é refletida de forma difusa. A radiação refletida pela amostra volta à esfera e é direcionada ao detector de InGaAs após múltiplas reflexões nas paredes da esfera (Figura 4). A radiação infravermelha dispersada é coletada com uma eficiência maior que 95%. Esta técnica apresenta a grande vantagem da facilidade no manuseio de amostras, possibilitando analisar

amostras diretamente em frascos pela subtração da contribuição espectral do recipiente (THERMO FISHER SCIENTIFIC, 2008).

Figura 4 - Esfera de integração NIR

Fonte: Thermo Fisher Scientific (2008, p.1).

Kubelka e Munk estabeleceram uma relação entre a concentração dos componentes de uma amostra com a intensidade da radiação dispersa pela refletância difusa. A relação presente na Equação 3, que substitui a lei de Beer, é valida apenas para materiais homogêneos e transparentes e estabelece uma relação linear entre a concentração (C) e a refletância difusa (PASQUINI, 2003):

f(C):( ) Eq. 3

A crescente evolução da aplicabilidade da espectroscopia NIR só se deu com a paralela evolução dos métodos quimiométricos. Os espectros NIR possuem uma faixa extensa de números de onda, portanto muitos dados espectrais são adquiridos em uma análise, desta forma, há a necessidade do uso de ferramentas quimiométricas para conseguir extrair informação destes dados. Como as bandas de absorção em NIR são combinações de bandas fundamentais, os espectros NIR não são muito úteis na elucidação de estruturas moleculares ou mesmo em análises qualitativas, entretanto, são muito aplicáveis em determinações quantitativas (SIESLER et al., 2002).

3.4 Quimiometria

Nos últimos 30 anos, houve um grande aumento do uso de computadores para análise de dados físico-químicos. Com o rápido avanço tecnológico dos instrumentos analíticos computadorizados, a aquisição de dados tornou-se cada vez mais rápida gerando uma enorme quantidade de informações, muitas vezes complexas. Instrumentos modernos são capazes de medir um grande número de variáveis em uma única amostra, portanto, para tratar tamanha quantidade de dados e extrair deles alguma informação, são necessárias ferramentas estatísticas multivariadas, ou seja, técnicas quimiométricas (FERREIRA et al., 1999).

A palavra “quimiometria” denota o uso de métodos matemáticos e estatísticos para resolver problemas químicos (CALSON, 2009, p.302). Quimiometria é uma ciência interdisciplinar que envolve estatística multivariada, modelagem matemática, ciência da computação e química analítica. Surgiu formalmente no início da década de 70, mas se consolidou apenas com a introdução dos computadores nos laboratórios, tornando-se um complemento da automação laboratorial (BARROS; SCARMINIO; BRUNS, 2006).

Sendo o mundo à nossa volta inerentemente multivariado, problemas químicos complexos podem ser resolvidos através de análises quimiométricas, pois considerando a distribuição de múltiplas variáveis simultaneamente é possível obter mais informação, uma vez que, quando cada variável é analisada individualmente, a correlação entre elas é negligenciada (GEMPERLINE, 2006).

Há três áreas de pesquisa envolvendo métodos quimiométricos: planejamento e otimização de experimentos; reconhecimento de padrões; e calibração multivariada, estando a última diretamente relacionada a este trabalho.

3.4.1 Calibração multivariada

A calibração é uma das tarefas mais importantes nas análises espectroscópicas quantitativas. O objetivo da calibração é desenvolver um modelo matemático adequado capaz de descrever ou predizer uma propriedade de interesse estabelecendo a relação entre duas ou mais variáveis. Normalmente, um conjunto de variáveis é uma série de medidas físicas (por exemplo, um espectro) e o outro contém um ou mais parâmetros (como concentração ou outras propriedades de

interesse) (ADAMS, 2004). Quando apenas uma variável é relacionada com a propriedade de interesse, é chamada calibração univariada. É um método de fácil aplicação, porém está restrito à ausência de interferentes na amostra, ou seja, o efeito matriz deve estar ausente. Já a calibração multivariada não necessita que as respostas instrumentais sejam seletivas, permitindo que a concentração do analito ou a propriedade de interesse seja determinada mesmo na presença de interferentes, contanto que os interferentes estejam presentes no conjunto de amostras de calibração. Além do mais, esta calibração possibilita análises com baixa relação sinal/ruído e determinação de mais de uma propriedade simultaneamente, tornando-se uma alternativa quando a calibração univariada não se aplica (VALDERRAMA, 2005).

Um modelo de calibração é uma função matemática que relaciona um grupo de variáveis dependentes Y (propriedades de interesse) com um grupo de variáveis independentes X (respostas instrumentais) através de um coeficiente de regressão b:

 = .  Eq. 4

A formulação da Equação 4 é conhecida como Mínimo Quadrado Inverso (ILS – Inverse Least Square), onde um único valor de Y está em função das respostas. No modelo de calibração univariada, X representa apenas uma variável de resposta, enquanto no modelo multivariado, X é uma matriz de dimensão n x m, onde n é o número de amostras e m as respostas analíticas. Cada coluna representa uma resposta instrumental (por exemplo, absorbância em um comprimento de onda) e cada linha representa uma amostra de calibração (Figura 5).

Figura 5 - Representação da matriz de dados X. As linhas representam as amostras e as colunas os sinais analíticos.

Fonte: Elaborado pelo autor.

O próximo passo após o desenvolvimento do modelo de calibração é a verificação de seu desempenho na predição dos valores de Y através da validação. A validação do modelo de calibração multivariada é um passo crítico antes de utilizar o modelo em ensaios de rotina. Seu propósito é determinar a reprodutibilidade da calibração e a tendência do modelo comparado com um método conhecido (GEMPERLINE, 2006). Nesta etapa, aplica-se o modelo de calibração em outro conjunto de amostras (conjunto de validação) com valores conhecidos das variáveis independentes e, então, os valores de Y previstos pelo modelo são comparados aos valores de referência. Se os valores previstos forem aceitáveis por testes estatísticos, então o modelo de calibração poderá ser utilizado em amostras com valores de Y desconhecidos.

Em uma visão geral, são necessários os seguintes passos para a determinação de uma propriedade de interesse em uma amostra desconhecida através da calibração multivariada:

1. Formação de um conjunto de amostras de calibração e um de validação. 2. Os valores das propriedades de interesse das amostras de calibração e

validação devem ser determinados com precisão e exatidão através de métodos de referência;

3. Obtenção das variáveis independentes das amostras de calibração e validação por um instrumento analítico;

4. Desenvolvimento de um modelo de calibração utilizando-se de um software estatístico a partir dos dados de referência e respostas analíticas;

5. Aplicação do modelo de calibração no conjunto de validação para verificar o desempenho do modelo. A eficácia do modelo é realizada comparando-se estatisticamente os valores preditos pelo modelo com os valores obtidos pelo método de referência;

Se os valores preditos para o conjunto de validação forem aceitáveis por testes estatísticos, o modelo de calibração poderá ser utilizado na determinação da propriedade de interesse de amostras desconhecidas, desde que estas apresentem composição similar às amostras do conjunto de calibração.

3.4.2 Conjunto de calibração e validação

As amostras que constituirão o conjunto de calibração devem abranger toda a faixa de concentração do analito ou da propriedade interesse. Para misturas simples contendo poucos componentes, geralmente é possível preparar amostras que podem servir de padrões para a calibração multivariada, entretanto, para misturas complexas, como produtos petroquímicos, a preparação de padrões de referência é impraticável. Neste caso, os valores de referência usados na calibração multivariada devem ser obtidos a partir de um método analítico de referência. A exatidão da concentração ou propriedade estimada pela calibração multivariada é altamente dependente da exatidão e precisão do método de referência, desta forma, o conhecimento da precisão do método de referência é crítico no desenvolvimento da calibração multivariada (AMERICAN..., 2012).

O conjunto de calibração deve ser o mais representativo possível, ou seja, todos os interferentes possíveis devem estar presentes, de preferência em diferentes concentrações, e deve abranger toda a faixa da propriedade de interesse. O conjunto de validação deve ser totalmente independente, não contendo alíquotas das amostras de calibração.

3.4.3 Pré-processamento de dados e transformações matemáticas

Vários tipos de pré-processamento de dados e transformações matemáticas podem ser aplicados no desenvolvimento do modelo de calibração. A finalidade é reduzir as fontes de variações não informativas, consequentemente, melhorando a relação sinal/ruído e tornando as matrizes de dados mais condicionadas à modelagem. Todo método de pré-processamento deve ser automatizado para que os resultados sejam reprodutíveis e devem ser aplicados do mesmo modo nos espectros de calibração, validação e de amostras desconhecidas. Os pré- processamentos mais usais são o centrado na média e o autoescalonamento, e as transformações matemáticas comumente utilizadas em dados espectroscópicos são:

primeira e segunda derivada; suavização; correção de linha base e Correção de

Sinais de Espalhamento Multiplicativo (MSC – Multiplicative Scatter Correction).

Centrado na média

Centrado na média refere-se a um processo em que cada variável de resposta é subtraída da média da mesma para todo o conjunto de variáveis X. Este processo desloca o eixo do sistema de coordenadas para o centro de gravidade, ou centroide, dos dados. Do ponto de vista estatístico, centrado na média tem a intenção de prevenir que dados situados distante do centróide tenham uma maior influência que os dados que estão próximos, assim, revelando apenas flutuações dos dados em torno do valor médio (KRAMER, 1998).

Em sistemas onde as variáveis possuem a mesma unidade, como na espectroscopia, centrar na média pode ser a escolha apropriada, pois se leva a crer que as variáveis com maior variação são mais importantes.

Autoescalonamento

É usado para dar mesmo peso a toda porção dos dados, colocando-os em uma escala de zero a um. No autoescalonamento, calcula-se a variância dos dados s2 (Equação 5), subtrai-se os dados originais pela média (Equação 6) e divide-se pelo desvio padrão, segundo a Equação 7 (MATTOS, 2003). Este pré- processamento torna todas as variáveis equivalentes em termos de magnitude,

entretanto, seu uso pode ser prejudicial ao desempenho do modelo, por exemplo, se