Capítulo 3 Mimetização enzimática
4.3.4. Medida do efeito fototérmico
4.3.5.3. Espectroscopia na região do Ultravioleta-Visível (UV-VIS)
Os espectros na região do UV-Vis das suspensões aquosas (dispostas em cubetas de quartzo com comprimento ótico de 1 cm) foram coletados em um espectrofotômetro Cary 50 da Agilent e a região analisada foi de 200 a 1000 nm.
4.3.5.4.
Magnetometria
O estudo do comportamento magnético das amostras frente a um campo externo (M versus H) foi realizado em um equipamento SQUID (Quantum Design, MPMS XL), com campo máximo igual a 20 kOe e temperatura de 300 K. As amostras foram empacotadas em filme PVC (policloreto de vinila) e introduzidas em um canudo plástico transparente para acoplamento ao equipamento por meio de uma haste de aço.
4.3.5.5.
Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)
As micrografias foram obtidas no microscópio TEM-FEG (JEM 2100F) com canhão ZrO/W(100), 200 kV de aceleração e 1.7 Å point resolution. As medidas de EDS foram realizadas usando um Oxford SDD X-Max 80 mm2 sem janelas. A suspensão das amostras em água destilada ou etanol foram gotejadas em uma grade de cobre (Ultrathin holey carbon support grid, 400 mesh, copper) e secas a temperatura ambiente.
4.3.5.6.
Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM)
As micrografias foram obtidas com elétrons secundários em um microscópio eletrônico de varredura SEM-FEG HR (FEI-Inspect F50), do Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano). O pó foi depositado em porta amostras de silício e recoberto com filme de carbono.
4.4. Resultados e discussões
Nesta etapa do trabalho objetivou-se a obtenção de um sistema do tipo caroço@casca com magnetita no “caroço” e ouro formando a “casca”. Diversas metodologias foram utilizadas para o recobrimento das pequenas nanopartículas de magnetita sintetizada pelo método de co- precipitação, apresentados no Capítulo 2, porém não obtivemos resultados satisfatórios e os dados não são mostrados nesta tese. Desta forma, optamos pela funcionalização de uma nanopartícula de magnetita de maior tamanho com nanopartículas de ouro menores, e para isso utilizamos o método de solvotermia para síntese das MNP. Os resultados são mostrados a seguir.
A obtenção das nanopartículas de magnetita pelo método solvotérmico foi realizada a partir de trabalhos anteriores do grupo de pesquisa, cuja metodologia já está bem estabelecida e apresenta-se altamente reprodutível [147–149]. Esta metodologia caracteriza-se na utilização de um solvente orgânico, neste caso o etilenoglicol, capaz de promover a redução parcial de Fe3+ a Fe2+ sob altas temperatura e pressão. Nas primeiras etapas da reação, há a solubilização do sal precursor e a complexação do íon Fe3+ com grupamentos acetato. Com o aquecimento
do meio reacional ocorre lentamente a decomposição destes complexos e a formação de hidróxido que provém do próprio acetato decomposto. Então, parte dos íons Fe3+ são reduzidos
a Fe2+ pelo solvente [onde o etilenoglicol em altas temperaturas (>200ºC) é oxidado a
acetaldeído ou glicoaldeído, apresentando forte ação redutora frente a Fe(OH)3 ou Fe2O3] e
então inicia-se o processo de nucleação da magnetita, tendendo a agregar em partículas maiores a fim de minimizar a energia de superfície. Como o solvente é bastante viscoso, ele inibe o crescimento exacerbado das partículas. [150]
Por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (Figura 42) pode ser observado o arranjo das nanopartículas sintetizadas. Observa-se a formação de uma partícula de aproximadamente 90 nm formada pela aglomeração de nanogrãos de aproximadamente 9 nm de diâmetro. O mecanismo de crescimento das nanopartículas de magnetita se dá por ripening de Ostwald, envolvendo o crescimento de cristais maiores a partir da agregação de cristais menores. Nos últimos estágios da reação, ocorre o esgotamento de OH- livres em solução, fazendo com que novos nanocristais, com menores tamanhos, se solubilizem e não cresçam para formar partículas maiores.
Figura 42 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) da amostra s-Fe3O4.
Ao promover o aquecimento prévio da mistura reacional antes de levá-la para a estufa acredita-se que ocorra a formação dos primeiros núcleos, mesmo com temperatura inferior à temperatura de decomposição do EG. Essa nucleação prematura possibilita a formação de nanopartículas de tamanho reduzido e sua agregação controlada. Em seu trabalho, Carvalho e colaboradores [147] observaram que, com o aumento da temperatura da então chamada mistura pré-reacional, o tamanho do agregado diminui, passando de 750 nm quando adicionada à autoclave em temperatura ambiente, para 100 nm com aquecimento a 120ºC - 140ºC, aparentando não variar o tamanho caso sejam utilizadas temperaturas mais elevadas. A temperatura de 140ºC foi escolhida para este trabalho pois, para uma suposta aplicação biomédica, as nanopartículas devem ter tamanho reduzido para poderem penetrar em regiões tumorais, as quais apresentam baixa vascularidade, e também penetrar nas células para atuação como agente antitumoral.
Na literatura são reportados diversos trabalhos cujos autores utilizaram EG como solvente e FeCl3 como único precursor de ferro. [147,151–153] Nestes trabalhos, as partículas
obtidas também são formadas por agregação de nanogrãos, porém apresentam uma cavidade no interior desta partícula. Yan e colaboradores [154] estudaram a influência da presença de pequena quantidade de água no meio reacional, observando que a hidrólise da ureia promoveu a formação de microbolhas de CO2 na solução, induzindo a formação de sistemas ocos, tais
como observados pelos demais autores. Em trabalho similar, Goswami [155] também atribui a presença das cavidades das partículas à formação de CO2 a partir da decomposição da ureia,
nanopartículas. Em nosso trabalho, acreditamos que o aquecimento prévio da solução em ambiente aberto pode ter minimizado a formação de bolhas no interior da solução ao longo das 8 h de autoclave, fazendo com que as esferas obtidas não apresentem cavidade em seu interior.
Para comparar o efeito das diferentes metodologias de síntese de magnetita , foi obtida a curva de M versus H (Figura 43) da amostra sintetizada por solvotermia, s-Fe3O4, para
comparação com a amostra por co-precipitação, chamadas aqui de cp-Fe3O4, descrita no
Capítulo 2 da tese. Observa-se que a magnetização de saturação da amostra s-Fe3O4 (64 emu
g-1, ~90 nm) é maior do que a sintetizada por co-precipitação, cp-Fe
3O4 (60 emu g-1, 10 nm),
também apresentando pequena histerese, magnetização remanente e coercividade. Este resultado evidencia uma cooperação entre os nanogrãos (~9 nm) que compõe a nanopartícula, passando a ter um comportamento de uma nanopartícula maciça de maior tamanho.
Figura 43 – Curvas de M versus H das amostras cp-Fe3O4 e s-Fe3O4.
A funcionalização da magnetita com ouro na amostra s-Fe3O4@AuNS pôde ser
observada por meio de difratometria de raios X (Figura 44). Observam-se os picos de Au (111) em 38º (2θ), (200) em 44º (2θ), (220) em 65º (2θ) e (311) em 78º (2θ), e os picos característicos de ferrita. A morfologia destas nanopartículas foi observada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) na Figura 45, evidenciando a presença de nanopartículas de ouro esferoidais com maior contraste adsorvidas na superfície das nanopartículas de magnetita em menor contraste. O sistema caroço@casca não foi obtido como desejado.
Figura 44 – Difratogramas de raios X das amostras de magnetita sintetizada pelo processo solvotérmico e funcionalizadas nanopartículas de ouro s-Fe3O4@AuNS.
Figura 45 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) da amostra s- Fe3O4@AuNS. Observa-se a estrutura de nanogrãos da magnetita e nanopartículas esferoidais
de ouro adsorvidas em sua superfície com maior contraste.
Nanopartículas esferoidais de ouro não apresentam banda plasmon na região de interesse, ~800 nm, estando localizada comumente em ~530 nm. Então optou-se por fazer a
funcionalização da magnetita com nanobastões de ouro, cuja banda plasmon transversal situa- se na região de 800 nm, como desejado, contribuindo para o efeito de fototermia, aliado ao polipirrol. O perfil da banda plasmon dos nanobastões de ouro sintetizados (AuNR) foi observado por meio dos espetros de extinção, coletado por espectroscopia UV-Vis (Figura 46). Observa-se que há uma banda na região de 500 nm e uma banda mais intensa na região de 750 nm. A banda de maior energia está relacionada à oscilação da nuvem eletrônica na direção transversal dos nanobastões e a de menor energia à oscilação na direção longitudinal. Esta última banda quando excitada por laser pode promover um aquecimento local da nanopartícula dado por meio da excitação dos elétrons de superfície do metal, cuja relaxação promove liberação de calor.
Figura 46 – Espectro de extinção dos nanobastões de ouro (AuNR) sintetizados para funcionalização das nanopartículas magnéticas. Em detalhe são mostrados os modos de
ressonância da banda plasmon.
A funcionalização foi confirmada pelas imagens de microscopia eletrônica de transmissão por varredura (STEM) (Figura 47). Observa-se que os bastões de ouro se encontram adsorvidos na superfície destas nanopartículas de forma desordenada. Na Figura 48 é mostrada um mapeamento da distribuição dos elementos Fe e Au por EDS.
Figura 47 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura por transmissão (STEM) da amostra s-Fe3O4@AuNR.
Figura 48 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura por transmissão (STEM) com mapeamento por EDS da amostra s-Fe3O4@AuNR, mostrando a distribuição dos elementos
Fe em azul e Au em amarelo.
O recobrimento com polipirrol da amostra s-Fe3O4@AuNS foi caracterizado por
espectroscopia na região do infravermelho por ATR para verificar se a polimerização foi efetiva. Na Figura 49 são mostrados os espectros de IR-ATR das amostras s-Fe3O4 e s-
referente à ligação Fe-O em 540 cm-1 e também bandas referentes à presença de etilenoglicol na região de 1500 a 800 cm-1, utilizado como agente redutor da síntese e estabilizante da superfície do material. Já a amostra recoberta com polipirrol apresenta perfil muito distinto e suas bandas puderam ser identificadas e então atribuídas, confirmando a polimerização na amostra analisada. O espectro da amostra funcionalizada apenas com ouro não apresentou mudança frente ao espectro do caroço magnético e por isso não é apresentado.
Figura 49 – Espectros de IR-ATR das amostras s-Fe3O4 e s-Fe3O4@AuNS@PPy. No detalhe,
é apresentada a estrutura do polipirrol e algumas bandas características.
O mecanismo de formação do polipirrol é controverso; os dois mecanismos mais aceitos estão ilustrados na Figura 50. Na primeira etapa (a) há a formação do radical do monômero do pirrol, o qual reage com outro monômero radicalar (c), liberando posteriormente 2 íons H+ (e). Em seguida, o dímero perde um novo elétron formando novo radical, que por sua vez reage com outro monômero radicalar, e assim sucessivamente [(f) e (g)] Outro mecanismo envolve a reação de um monômero radicalar com outro monômero não oxidado (b), formando um dímero radicalar; esse dímero então passa por outro processo de oxidação (d) e consequente liberação de 2 íons H+ (e). [156]
Figura 50 – Representação esquemática dos dois principais mecanismos possíveis de polimerização do pirrol. Adaptado de Tan e Ghandi [156].
Para verificar se houve de fato o recobrimento das nanopartículas com polipirrol foram coletadas imagens de microscopia eletrônica de transmissão (Figura 51) por meio das quais é possível observar que o processo de polimerização foi bastante homogêneo. Observa-se o claro contraste entre as nanopartículas magnéticas, nanopartículas de ouro e a matéria orgânica recobrindo todo o sistema, não sendo seletivo a uma partícula ou outra.
Estas amostras foram caracterizadas segundo a sua absorbância na região do UV-Vis a fim de identificar a banda plasmon do ouro e a banda de condução do polipirrol. Na Figura 52 são apresentados os espectros das amostras s-Fe3O4, s-Fe3O4@Au e s-Fe3O4@AuNS@PPy
normalizados. Observa-se a presença de um ombro no espectro da amostra s-Fe3O4@Au na
região de 550-600 nm, caracterizando a presença de nanopartículas de ouro esferoidais isoladas, como esperado segundo as imagens de microscopia, apesar de não ser o desejado para fins fototérmicos. Com o recobrimento com polipirrol, observa-se um aumento significativo na absorbância na região de 700 a 900 nm, característico da sua banda de condução. O espectro ruidoso é devido à baixa estabilidade do sistema em suspensão. Este aumento da absorção nesta região é interessante para aplicação de fototermia e o procedimento de recobrimento foi aplicado na próxima etapa do trabalho. Com o sucesso do recobrimento com polipirrol da
amostra s-Fe3O4@AuNS amplamente justificado até então, a amostra s-Fe3O4@AuNR@PPy
não foi caracterizada por UV-Vis, IR-ATR ou TEM.
Figura 51 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) da amostra s- Fe3O4@AuNS@PPy.
Em geral, polímeros são tipicamente isolantes e, para que uma cadeia polimérica se torne condutora, esta deve estar oxidada ou reduzida. Costuma-se adotar nomenclatura de química de materiais para esses tipos de compostos por apresentarem propriedades semelhantes. Quando a dopagem é feita via oxidação, dada da remoção de um elétron e consequente redistribuição dos elétrons π da cadeia, ocorre a formação de um cátion radical chamado polaron, promovendo a polarização local da cadeia polimérica. No processo de formação do polaron, a banda de valência do polímero permanece cheia e a banda de condução vazia e a dopagem promove o preenchimento parcial de um nível energético localizado na região do bandgap. Quando um segundo elétron é removido da cadeia pode haver duas situações distintas: (a) formação de um segundo estado polaron ou (b) remoção de um segundo elétron do polaron pré-existente e a formação de um bipolaron. A formação do bipolaron é favorecida uma vez que o ganho de energia decorrente da interação de duas cargas com o retículo é maior do que a repulsão coulômbica entre as cargas de mesmo sinal. Em alguns polímeros condutores, como polipirrol e politiofeno, o processo de dopagem ocorre simultaneamente com o processo de oxidação para sua formação. Elétrons são retirados da cadeia polimérica durante a oxidação e há a inserção de contra-íons como dopantes para promover o balanceamento de carga. [157] A Figura 53 ilustra a formação de polarons e bipolarons na cadeia polimérica do polipirrol e seus níveis de energia.
Para avaliar a capacidade de aquecimento local dos sistemas contendo ouro e polipirrol, foram feitos ensaios de medida do aumento de temperatura local com o auxílio de um laser em 808 nm. As curvas de fototermia foram coletadas a partir da suspensão aquosa das nanopartículas contendo polipirrol e/ou nanobastões de ouro (Figura 54) e é possível observar que houve um bom aquecimento local na amostra s-Fe3O4. Este aquecimento pode ser atribuído
à presença de defeitos de oxigênio em sítios tetraédricos na rede da magnetita, os quais podem abrigar elétrons excitáveis em ~840 nm. [158] As amostras s-Fe3O4@PPy e s-
Fe3O4@AuNR@PPy resultaram em um aquecimento ainda maior devido principalmente a
presença de polipirrol, uma vez que há pouca diferença entre seus valores. As amostras s- Fe3O4@AuNS e s-Fe3O4@AuNS@PPy não foram utilizadas nestes ensaios.
(a)
(b)
Figura 53 – (a) Esquema da formação de polarons e bipolarons na cadeia polimérica do polipirrol. Adaptado de Trchová, e Stejskal [159]. (b) Representação dos níveis de energia
Figura 54 – Curvas de fototermia das amostras s-Fe3O4, s-Fe3O4@PPy e s-
Fe3O4@AuNR@PPy com excitação em 808 nm, 750 mW de potência.
Uma das causas do baixo aquecimento local para todas as amostras e a flutuação da curva s-Fe3O4@PPy em 60 s < t < 180 s é a baixa estabilidade da suspensão aquosa, pois logo
após os ensaios foi observado que todo o sólido havia decantado, em todas as amostras. Desta forma, podemos concluir que há liberação de calor com a aplicação de radiação em 808 nm, porém não foi alcançado seu máximo devido à variação de concentração de nanopartículas na direção do feixe do laser. Por este motivo não foram realizadas outras replicadas das medidas. Entretanto, é possível observar que a presença de nanobastões de ouro promoveu um aquecimento local mais intenso quando comparada com as demais amostras, atingindo ΔT=18,1ºC em 600 s.
4.5. Conclusões parciais
A síntese pelo método solvotérmico levou à formação de um material nanoestruturado (90 nm) formado da aglomeração de nanogrãos menores. Observou-se que frente à magnetita sintetizada por co-precipitação, a sua magnetização de saturação é maior devido à presença dos nanogrãos, formados por monodomínios magnéticos, que acabam cooperando entre si e se assemelhando a uma nanopartícula inteiriça de maior tamanho.
A síntese de nanobastões de ouro e sua adsorção sobre as nanopartículas magnéticas sintetizadas via método solvotérmico foram caracterizadas por microscopia de transmissão. Sua
aplicabilidade como gerador de calor foi estudada na presença de laser em 808 nm em amostra recoberta por polipirrol e observou-se um pequeno aumento da temperatura local frente à amostra contendo apenas polipirrol, atingindo ΔT = 18,1ºC em 600 s. Apesar de não ser expressivo o aumento de temperatura local, esses sistemas têm potencial para aplicações biomédicas, visto que podem gerar estado febril em uma célula neoplásica e, consequentemente, levar à sua morte.