Capítulo 3 Mimetização enzimática
3.3.2. Quantificação de ferro
3.3.2.3. Quantificação de Fe nas amostras
Foram preparadas ~8 mL suspensões 0,2 mg mL-1 das amostras de nanopartículas Fe3O4, Mn-Fe3O4, (Zn-Mn)-Fe3O4-II e Zn-Fe3O4 e sonicadas em ultrassom de ponteira Eco-
sonics (potência máxima 750 W, frequência 20 kHz, micro ponta de titânio de 4 mm de diâmetro) por 10 min a 30% da potência máxima com o objetivo de obter uma suspensão estável de nanopartículas. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 min e deixadas em repouso por pelo menos 24 h para que as nanopartículas fora da suspensão desejada pudessem decantar. O precipitado (nanopartículas que não suspenderam) foi descartado e a água-mãe, contendo a suspensão estável de nanopartículas, foi utilizada para os experimentos.
A abertura das amostras para liberação dos íons Fe(II) e Fe(III) foi realizada com solução de ácido sulfúrico 0,1 mol L-1 em proporção 1 : 2. As soluções foram sonicadas por 3 h em banho de ultrassom até tornar-se completamente incolor. Em seguida, 0,5 mL da solução foram adicionadas a balões de 50 mL e foi seguido o mesmo protocolo utilizado nas curvas de calibração, tanto para Fe(II) quanto Fe(III). A partir da suspensão mais diluída, as demais amostras foram normalizadas e então foram feitas as medidas de mimetização enzimática.
3.3.3. Mimetização enzimática
As nanopartículas superparamagnéticas foram utilizadas como mimetizador enzimático na oxidação do TMB (3,3´, 5, 5´-tetrametilbendizina) na presença de H2O2 para a formação do
estado oxidado do TMB, o qual apresenta coloração azul. O estudo da cinética da reação foi realizado utilizando-se volumes determinados de suspensão de MNP de diferentes concentrações em tampão acetato (ácido acético pH 4, ajustado com solução NaOH 0,1 mol L-
1), diferentes concentrações de soluções de H
2O2 em tampão acetato (pH 4) e diferentes volumes
de solução de diferentes concentrações de TMB em DMF. Utilizou-se solução tampão acetato o suficiente para completar 2 mL. A Tabela 11 mostra as concentrações dos reagentes
utilizados nos ensaios. Os ensaios foram realizados em cubetas de quartzo com comprimento ótico de 1 cm, e os espectros foram coletados em espectrofotômetro Agilent 8453 com o auxílio de peltier (Quantum Northwest), o qual manteve a reação a 37ºC com agitação magnética a 800 rpm. À cubeta foram adicionados na ordem, TMB e tampão acetato, sendo então disposta no porta amostra do espectrofotômetro. Em seguida, foram adicionados simultaneamente H2O2 e
MNP e então iniciada a leitura das intensidades das bandas em 460 nm e 650 nm a cada 5 ou 10 s por 300 ou 600 s. Após a medida, a cubeta e a barra magnética foram lavadas com H2O
deionizada por pelo menos 3 vezes e ambientada com tampão acetato para iniciar a nova medida.
Tabela 11 – Concentrações de nanopartículas magnéticas, peróxido de hidrogênio e TMB utilizados nos ensaios catalíticos.
Concentração MNP (mol L-1)* Concentração H2O2 (mol L-1) Concentração TMB (mol L-1) 6,0 10-9** 6,8 10-5 7,5 10-4 1,1 10-6 3,4 10-4 6,6 10-3 1,1 10-5 3,4 10-4 6,6 10-3 1,1 10-4 3,4 10-4 6,6 10-3 1,1 10-4 3,8 10-5 3,32 10-4
*calculada a partir da massa molar da magnetita.
**medidas realizadas a 25ºC; amostras preparadas com auxílio de ultrassom de ponteira e quantificadas com o- fenantrolina.
3.4. Resultados e discussões
A reação de oxidação do TMB é dada pela decomposição do H2O2 na presença de
catalisador, como ilustra a Figura 30. Nesta reação é necessário que haja a formação de radicais •OH para a oxidação do TMB. Na ausência do catalisador, esta reação é muito lenta.
Figura 30 – Ilustração do processo de oxidação do TMB por H2O2 na presença de catalisador.
Adaptado de Rhee e colaboradores [117] e Kireyko e colaboradores [118].
As nanopartículas escolhidas para serem estudadas neste processo foram Fe3O4, Mn-
Fe3O4, (Zn-Mn)Fe3O4-II e Zn-Fe3O4. As atividades catalíticas devem ser aumentadas com a
dopagem de manganês, como visto na introdução desse capítulo, seguindo a ordem esperada Zn-Fe3O4 > (Zn-Mn)Fe3O4-II > Fe3O4 > Mn-Fe3O4 ou Zn-Fe3O4 > Fe3O4 > (Zn-Mn)Fe3O4-
II > Mn-Fe3O4. O aumento na reatividade de amostras dopadas com Mn2+ ocorre pela redução
termodinamicamente favorável dos íons Mn3+, oriundos da decomposição do peróxido, ocasionada pela transferência de elétron de íons Fe2+ na superfície da nanopartícula para estes íons. A redução dos íons Mn3+ pelos íons Fe2+ é viável quando comparada à redução de íons
Fe3+ devido ao maior potencial de redução do par redox Mn3+/Mn2+ (E0 = 1,51 V) comparado ao par redox Fe3+/Fe2+ (E0 = 0,77 V). [115]
Mn2+ + H2O2 → Mn3+ + OH− + •OH
Fe2+ + Mn3+ → Fe3+ + Mn2+, E0 = 0,73 V
Os primeiros ensaios realizados foram conduzidos com suspensão estável de nanopartículas com concentração 6,0 10-9 mol L-1 (calculado a partir da concentração de
magnetita obtida da quantificação realizada com complexação com o-fenantrolina), 6,8 10-5 mol L-1 de H
2O2 e 7,5 10-4 mol L-1 de TMB. As curvas de absorção são mostradas na Figura
31.
Figura 31 – Curvas de absorção em 650 nm versus tempo dos ensaios de cinética das amostras Fe3O4, Mn-Fe3O4, (Zn-Mn)Fe3O4-II e Zn-Fe3O4 com concentração 6,0 10-9 mol L-1.
Ensaios realizados a 25ºC com 6,8 10-5 mol L-1 de H2O2 e 7,5 10-4 mol L-1 de TMB.
Observa-se que não houve catálise da reação com as concentrações utilizadas, pois praticamente não há aumento na absorção em 650 nm quando comparado à amostra sem nanopartícula. Pelas concentrações utilizadas neste ensaio, esperava-se um aumento significativo nas absorbâncias, principalmente das amostras contendo manganês. Esse resultado evidencia dois problemas: (1) passivação massiva dos sítios ativos na superfície das nanopartículas pelo polietilenoglicol, o qual impede a transferência de elétrons entre a nanopartícula e os substratos e/ou impede a aproximação desse substratos por simples impedimento estérico e (b) oxidação da superfície da nanopartícula, tanto por oxigênio
atmosférico ao estocar a amostra sólida, quanto pela própria solução tampão quando sonicada pelo tratamento em ultrassom de ponteira. Os mesmos ensaios foram conduzidos a 37ºC e a resposta catalítica foi ainda menor e por isso as curvas não são mostradas nesta tese.
A fim de evitar a oxidação pela solução tampão e ultrassom de ponteira, novas amostras foram preparadas, com auxílio de banho de ultrassom apenas, e com maiores concentrações de nanopartículas. A Figura 32 mostra curvas de absorção versus tempo para diferentes concentrações de nanopartícula realizados agora a 37ºC para maximizar a reação.
Figura 32 – Curvas de absorbância em 650 nm versus tempo dos ensaios de cinética da amostra Fe3O4 com concentrações 1,1 10-6 mol L-1 (vermelho), 1,1 10-5 mol L-1 (verde) e 1,1
10-4 mol L-1 (azul). Ensaios realizados a 37ºC com 3,4 10-4 mol L-1 de H2O2 e 6,6 10-3 mol L-1
de TMB.
Dentre os testes realizados, foi escolhida a maior concentração de nanopartícula para os próximos ensaios, pois foi aquela com melhor resposta, apesar de apresentar um perfil sigmoidal. Este perfil sugere que a reação é mais lenta no início e aumenta em tempos intermediários. Isso pode ter sido causado pela presença de PEG, que dificulta a adsorção dos substratos H2O2 e TMB na superfície da nanopartícula. A partir da média da triplicata das curvas
de absorção das amostras Fe3O4, Mn-Fe3O4, (Zn-Mn)Fe3O4-II e Zn-Fe3O4 com concentração
de 1,1 10-4 mol L-1, H2O2 3,8 10-5 mol L-1 e diferentes concentrações de TMB foram obtidas as
calculada por meio da lei de Beer-Lambert, 𝐴 = 𝜀. 𝑙. [𝑃], onde A é a absorbância, ε a absortividade molar (39000 cm-1), l o caminho óptico e [P] a concentração da forma oxidada do TMB.
Figura 33 – Curvas [P] versus tempo dos ensaios de cinética das amostras Fe3O4, Mn-Fe3O4,
(Zn-Mn)Fe3O4-II e Zn-Fe3O4 com concentração 1,1 10-4 mol L-1. Ensaios realizados a 37ºC
com 3,8 10-5 mol L-1 de H2O2 e diferentes concentraçõesde TMB.
A velocidade inicial de um ensaio enzimático é dada da inclinação da curva na parte linear nos primeiros segundos de medida, onde até 10% do substrato fora transformado em produto. Como em nossos ensaios o perfil do início da curva é diferente do esperado, foram obtidos os valores entre 152 e 252 s das curvas [P] versus tempo dos ensaios com diferentes concentrações de TMB, ilustrados na Figura 34(a). Observa-se um perfil exponencial, como desejado.
(a)
(b)
Figura 34 – Curvas (a) velocidade inicial v0 versus [TMB] e (b) 1/v0 versus 1/[TMB] dos
ensaios de cinética das amostras Fe3O4, Mn-Fe3O4, (Zn-Mn)Fe3O4-II e Zn-Fe3O4.
A constante de Michaelis-Menten Km é dada quando a concentração do substrato é
equivalente a 𝑣𝑚á𝑥⁄ , sendo um indicativo da afinidade da enzima por esse substrato; quanto 2 menor o valor de Km, maior é a afinidade do substrato pela enzima. O valor de Km é constante
para a enzima, sendo independente de sua concentração. Para o cálculo desses valores, faz-se a linearização da curva 1/v0 versus 1/[S] (Equação 13), mostrados na Figura 34(b). Na Tabela
Equação 13 1 𝑣0 = 1 𝑣𝑚á𝑥+ 𝐾𝑚 𝑣𝑚á𝑥 1 [𝑆]
Observa-se que não há uma tendência clara nos valores de Km com a dopagem com
manganês, evidenciando que a presença de PEG e uma possível oxidação da superfície das nanopartículas têm extrema influência em sua atividade catalítica.
Tabela 12 – Parâmetros cinéticos dos ensaios de mimetização enzimática das amostras Fe3O4,
Mn-Fe3O4, (Zn-Mn)Fe3O4-II e Zn-Fe3O4.
Amostra Vmáx / μmol L-1 s-1 Km / mmol L-1
Fe3O4 0,107 0,148
Mn-Fe3O4 0,064 0,171
(Zn-Mn)Fe3O4-II 0,063 0,064
Zn-Fe3O4 0,070 0,143
3.5. Conclusões parciais
As nanopartículas de composição Fe3O4, Mn-Fe3O4, (Zn-Mn)Fe3O4-II e Zn-Fe3O4
foram avaliadas segundo sua atividade como mimetizador enzimático na oxidação do TMB na presença de peróxido de hidrogênio. Observou-se que a presença de PEG na superfície das nanopartículas influenciou de forma significativa a sua atividade catalítica, impedindo a transferência de elétrons dos pares redox Fe3+/Fe2+ e Mn3+/Mn2+ para a decomposição do peróxido a radicais hidroxila. Esse impedimento fez com que a reação de catálise não ocorresse a baixas concentrações de nanopartícula e, a concentrações mais elevadas, os perfis das curvas fossem distorcidos, levando a valores de Vmáx e Km inconclusivos.
Capítulo 4 – Fototermia
4.1. Introdução
Dentre os diferentes estímulos externos para a promoção de hipertermia local, a radiação no infravermelho próximo (NIR, do inglês near-infrared) (650-900 nm) tem se tornado atraente devido à sua facilidade de operação, capacidade de ser focada localmente numa região específica e pela sua absorção mínima pela pele e tecidos orgânicos (Figura 35) [119].
Figura 35 – Esquema da janela ótica in vivo e o valor do coeficiente de extinção de água, oxi e desoxi-hemoglobina, variando do comprimento de onda na região do visível e infravermelho
próximo NIR (do inglês near-infrared). Adaptado de Kobayashi, e colaboradores [120].
A terapia fototérmica com uso de um fotosensitizador exógeno teve início na década de 1990, quando Giulio Jori e John D. Spikes [121] sugeriram que moléculas orgânicas ou próprios componentes celulares (que não apresentassem atividade fotoquímica e fraca fluorescência) poderiam atuar como geradores de calor caso apresentassem as seguintes características: (1) alto coeficiente de extinção molar (de preferência em uma região espectral na qual poucos outros cromóforos absorvam radiação), (2) rápido decaimento não-radiativo por conversão
térmica e (3) fotoestabilidade. Desde então, diversos corantes [122,123], semicondutores [124,125] e metais [126–129] têm sido estudados com esta finalidade.
O ouro é o metal mais utilizado para promover a geração de calor localmente ao ser excitado em sua banda plasmon na região do NIR. Outros metais também são utilizados em biomedicina, como prata e platina, atuando também como agentes de carreamento de fármacos, agentes de contraste para imageamento de tecidos, inibidores, sensores, dentre outros [130]. Além de usar o calor para destruir diretamente o câncer, o efeito fototérmico pode ser aproveitado para estimular outros tipos de terapias, permitindo liberação de fármacos sob demanda para o tratamento do câncer de uma forma combinada, que oferece uma eficácia terapêutica sinergística maior em comparação com a monoterapia. [131]
As propriedades óticas e elétricas dos metais são decorrentes do fato destes possuírem elétrons livres na estrutura denominados de elétrons livres de condução, os quais não participam das ligações químicas e estão dispersos em toda a estrutura cristalina como uma nuvem de elétrons. Esta nuvem de elétrons interage com o campo elétrico da radiação eletromagnética incidente em uma determinada frequência, fazendo com que estes elétrons livres oscilem de modo coerente entre si. Esta oscilação é quantizada e representada por um quantum de energia denominado de plasmon. O plasmon do metal é um fenômeno que ocorre na superfície de filmes finos e de partículas metálicas em escala nanométrica e por isso são denominados de plasmon de superfície. Nanopartículas metálicas apresentam forte banda de absorção na região do UV- VIS, atribuída à banda de ressonância de plasmon de superfície (SPR, do inglês surface plasmon resonance), a qual pode ser excitada e promover a geração de calor (terapia fototérmica). [132,133] A Figura 36 ilustra este fenômeno.
Figura 36 – Ilustração esquemática do fenômeno de ressonância plasmônica de superfície em nanopartículas metálicas. Após a iluminação com comprimento de onda específico, os elétrons de superfícies sofrem oscilação coletiva coerente, oscilando juntamente com o campo
A posição da banda SPR é variável e dependente do tamanho, morfologia e composição da nanopartícula metálica, estando ela no caroço ou na casca de um sistema core@shell. Ao manipular estes parâmetros, o comprimento de onda da banda SPR pode ser ajustado ao longo do visível e na região do infravermelho, permitindo que a excitação possa ser realizada em uma determinada região de interesse.
Liu e colaboradores [134] sintetizaram nanoestrelas de ouro de tamanhos diferentes e observaram uma mudança significativa na posição da banda plasmon segundo a morfologia e tamanho das nanopartículas. As nanopartículas com menos pontas, assemelhando-se a esferas de 12 nm, apresentaram o máximo no espetro de extinção centrado em 520 nm, enquanto que nanoestrelas de 30 nm apresentaram um espectro bastante largo, centrado em 945 nm, e nanoestrelas de 60 nm apresentaram o máximo da banda centrado em 706 nm. Na Figura 37 são mostrados os espectros de extinção obtidos para as diferentes nanopartículas e suas imagens de microscopia eletrônica de transmissão.
Figura 37 – Imagens de TEM de (a) nanoesferas de ouro de 12 nm; (b) nanoestrelas de 30 nm; e (c) nanoestrelas de 60 nm. Espectros de UV-Vis de nanoesferas e nanoestrelas.
Adaptado de Liu e colaboradores [134].
Ayala-Orozco e colaboradores [135] estudaram sistemas do tipo core@shell de sílica e ouro a fim de observar sua atuação em tratamento por fototermia. Os autores sintetizaram os sistemas SiO2@Au com ~150 nm e Au@SiO2@Au com ~90 nm (nomeadas pelos autores como
são mostrados os espectros de extinção obtidos. Os autores observaram que os sistemas de nanomatryoshkas exibiram uma melhor eficácia da terapia fototérmica para câncer de mama triplo-negativo em camundongos nus quando comparados com core@shell de ouro padrão, pois a eficiência de transdução fototérmica de nanomatryoshkas foi de 63% enquanto que para os sistemas core@shell foi de 39%.
Encina e colaboradores [136] fizeram cálculos teóricos para sistemas caroço@casca de nanopartícula magnética recobertos com Au e observaram que, para deslocar a banda plasmon para a região de 800 nm, o caroço deve apresentar 25 nm de diâmetro e a casca 5 nm de espessura, ou 21 nm e 4 nm, respectivamente. Dong e colaboradores [137] sintetizaram um sistema caroço@casca com as proporções de 120-125 nm de caroço magnético e 25 nm de casca de ouro, obtendo a banda plasmon na região de 800 nm como calculado por Encina [136].
Figura 38 – Espectros de extinção das nanopartículas (a) nanomatryoshkas com dimensões [r1, r2, r3] = [21, 31, 44] nm; e (b) sistema core@shell com dimensões [r1, r2] = [62, 76] nm.
Adaptado de Ayala-Orozco e colaboradores [135].
Nanobastões de ouro em especial têm atraído muito interesse na literatura pois a faixa de absorção de luz pode ser finamente ajustada variando a sua razão de aspecto (razão entre o comprimento e o diâmetro da nanopartícula) para que a eficiência de aquecimento possa ser maximizada usando absorção na região de 800 nm, correspondente à janela ótica dos tecidos biológicos. Além disso, eles têm as vantagens de síntese em larga escala, fácil funcionalização e estabilidade coloidal. No entanto, a aplicação clínica dessas nanopartículas é um pouco limitada devido a uma ligeira citotoxicidade causada pelo excesso de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), usado como molde e estabilizante da superfície da nanopartícula durante a síntese.
Chang e Murphy [138] sintetizaram mini nanobastões de ouro com ressonância plasmônica de superfície longitudinal modulável de ∼600 a ~1300 nm, com razões de aspecto que variaram de 2,2 a 10,8 e comprimentos de 19 a 93 nm. Os autores utilizaram ácido ascórbico e hidroquinona como agentes redutores do Au(III) para crescimento dos bastões, garantindo os tamanhos reduzidos das nanopartículas; em geral. A Figura 39 ilustra os resultados obtidos pelos autores. Observa-se que há uma dependência direta na posição da banda plasmon com a razão de aspecto dos nanobastões.
Figura 39 – Imagens de microscopia de transmissão e espectros de extinção de nanobastões de ouro de diferentes razões de aspecto obtidos por Chang e Murphy [138].
Sistemas poliméricos também são amplamente utilizados em biomedicina para os mais diversos objetivos, tais como carreamento de fármacos, terapia fototérmica e biocompatibilidade [139,140]. Dentre os polímeros utilizados para terapia fototérmica encontra-se o polipirrol (PPy), um polímero amplamente utilizado comercialmente devido às suas características de biocompatibilidade, resistência às condições atmosféricas e alta estabilidade térmica. Dependendo das condições de síntese, o polipirrol pode apresentar características de condutor elétrico, semicondutor ou isolante, sendo sintetizado diretamente sobre a superfície desejada na forma de casca por reações química, eletroquímica ou por plasma in situ [141]. Quando dopado, o polipirrol apresenta uma larga banda de absorção correspondente à excitação eletrônica para sua banda de condução na região da janela ótica de maior transparência do tecido humano (650 – 1300 nm) [142,143].
Liu e colaboradores [144] prepararam nanopartículas de polipirrol de diferentes tamanhos e estudaram sua aplicabilidade como agente de fototermia e contraste para imageamento fotoacústico. Os autores observaram que nanopartículas com 50 nm de diâmetro apresentaram maior liberação de calor frente a partículas de 40 nm e 60 nm, atingindo ΔT =
25ºC em 600 s com concentração de 20 ppm. Essas mesmas partículas também obtiveram melhores respostas para imageamento fotoacústico. Os autores também realizaram estudos in vitro do efeito fototérmico em células HeLa incubadas com 50, 100 e 200 ppm das nanopartículas com 50 nm e observaram que as maiores concentrações causaram a morte das células expostas ao laser 808 nm por 10 min, enquanto que na ausência das nanopartículas as células se mantiveram intactas.
Song e colaboradores [145] estudaram nanopartículas de óxido de ferro de 6 nm recobertas com polipirrol funcionalizado com PEG, IONP@PPy-PEG (~100 nm), e mostram que as suspensões irradiadas com laser 808 nm (1 W cm-2) com concentração de 0,5 mg mL-1
são capazes que aquecer a água em 45ºC em apenas 5 min, além de atuarem como bons contrastes para ressonância magnética e fotoacústica. As nanopartículas também foram testadas in vivo e 100% das células tumorais foram eliminadas após radiação (Figura 40).
Figura 40 – Terapia fototérmica in vivo usando IONP@PPy-PEG. Imagens térmicas de infravermelho de camundongos portadores de tumor 4T1 sem injeção intravenosa (linha superior) ou com injeção intravenosa (linha inferior) de IONP@PPy-PEG (0,8 mg mL−1, 24 h
após a injeção) sob irradiação com laser de 808 (1,5 W cm−2) nm por 5 min. Adaptada de Song e colaboradores [145].
Du e colaboradores [146] funcionalizaram nanobastões de ouro com polipirrol a fim de estudar sua eficácia fototérmica e fotoestabilidade. Os autores observaram que os sistemas core@shell apresentaram melhor fotoestabilidade e efeito fototérmico em comparação com nanobastões de Au puros. Utilizando laser 808 nm (3 W) e concentração igual a 20 μg mL-1,os
nanobastões recobertos com polipirrol atingiram ΔT= ~23ºC em 380 s no ensaio de fototermia, enquanto que os nanobastões de Au puros atingiram ΔT= ~18ºC apenas. Para concentração de 92,8 μg mL-1 os nanobastões recobertos atingiram ΔT= ~70ºC. Estudos in vitro demonstram
que as nanopartículas têm alta eficiência para inibir a proliferação de células tumorais quando aplicada radiação.
A associação do ouro e do polipirrol com uma nanopartícula superparamagnética com alta magnetização de saturação pode proporcionar diversas alternativas de tratamento para neoplasias, um controle refinado do aquecimento local e atuar como um contraste para diversos tipos de imageamento de tecidos, tais como ressonância magnética, tomografia computadorizada ou fotoacústica. Ou seja, este sistema multifuncional poderia atuar no combate ao câncer mesmo em seu estágio inicial. Esses resultados nos motivaram, portanto, a investigar esse tipo de sistema.
4.2. Objetivos
Neste capítulo objetivou-se a obtenção de um sistema multifuncional de magnetita, ouro e polipirrol (Fe3O4@Au@PPy) para aplicação em fototermia.
O objetivo inicial foi a obtenção de um sistema core@shell de magnetita e ouro com intensa banda de absorção na região de 800 nm e, posteriormente, apenas a funcionalização das nanopartículas de magnetita com nanobastões de ouro. Em seguida, objetivou-se o recobrimento homogêneo de todo o sistema com polipirrol e sua aplicação na liberação de calor ao utilizar laser em 808 nm.
4.3. Materiais e Métodos
4.3.1. Reagentes
Os reagentes utilizados no presente trabalho estão listados na Tabela 13, bem como suas características. Estes foram utilizados sem purificação prévia à exceção do pirrol, destilado imediatamente antes do uso.