Espectroscopia é definida como o estudo de sistemas físicos através da radiação eletromagnética interagida ou produzida. Espectrometria é a medida da radiação para obter informações dos sistemas e seus componentes. Em algumas técnicas de espectroscopia, a radiação é proveniente de uma fonte externa e modifica-se ao interagir com o sistema e, em outras técnicas, a radiação é originada do sistema(Iupac, 1997). Os espectros obtidos das amostras carregam uma grande quantidade de informações e por isso, as análises de espectroscopia são utilizadas tanto em métodos qualitativos quanto quantitativos. Existem
várias técnicas de espectroscopia destinadas à análise de diferentes tipos de sistemas. Essas técnicas se diferenciam em função das espécies analisadas (molecular ou atômica), tipo de interação com a matéria (absorção, emissão ou difração) e região do espectro eletromagnético utilizada. As mais utilizadas na análise de alimentos são ultravioleta (UV), visível (Vis), infravermelho (IR) e ressonância magnética nuclear (NMR)(Penner, 1998).
No século XVIII, o matemático Jean-Henri Lambert foi o primeiro a propor uma relação matemática em que o logaritmo do decréscimo da intensidade da luz (conhecida atualmente como inverso da transmitância) é igual ao produto da opacidade do meio multiplicada pela espessura. No ano de 1850, o físico e matemático Auguste Beer estabeleceu a correlação entre concentração e densidade ótica (absorbância)(Rouessac & Rouessac, 2007). Atualmente é assumido que espectroscopia de absorção molecular se baseia na medida da transmitância ou absorbância de soluções contidas em recipientes transparentes de caminho ótico conhecido. Assim, a concentração de um analito presente no recipiente que absorve radiação eletromagnética é linearmente proporcional à absorbância, de acordo com a lei de Lambert-Beer(Skoog et al., 2007). A intensidade do feixe de radiação eletromagnética que incide (I0) na amostra em relação a intensidade do feixe que sai da amostra (I) é expressa em termos de Transmitância (T), onde T= I I⁄ . A transmitância não é um valor diretamente 0 proporcional à concentração do analito responsável pela absorção da radiação. Desse modo, um segundo termo é utilizado para descrever a relação entre I e I0, a absorbância (A). Em condições adequadas, a absorbância é diretamente proporcional a concentração das espécies em solução que absorvem o feixe de radiação, onde A= log(I0⁄ )=- log T. A lei de Lambert-I Beer pode ser expressa como A=εlc, onde ɛ é o coeficiente de absortividade molar, l é o caminho ótico e c é a concentração do analito. Se a solução for composta de uma mistura de analitos que absorvem a radiação, a absorbância total é dada pela soma dos produtos da concentração (c), pela absortividade molar (ɛ) e caminho ótico (l), da seguinte forma: Atotal=ε1lc1+ε2lc2+…εnlcn(Siouffi, 2004).
A espectroscopia no infravermelho refere-se a medição da absorção em diferentes frequências da radiação na região do infravermelho por alimentos ou outros sólidos, líquidos ou gases. A espectroscopia no Infravermelho começou em 1800 com um experimento de Frederick William Herschel que consistiu na utilização de um prisma para criar um espectro a partir da luz branca e um termômetro em um ponto além da região vermelha do espectro, onde foi possível notar um aumento de temperatura. Esta foi a primeira observação dos efeitos da radiação no infravermelho. Na década de 1940, a espectroscopia no infravermelho tornou-se uma ferramenta importante usada pelos químicos para identificar grupos funcionais em
compostos orgânicos. Na década de 1970, foram introduzidos os instrumentos comerciais de infravermelho com medidas de reflectância capazes de fornecer determinações quantitativas dos teores de umidade, proteínas e gorduras em cereais e outros alimentos(Wehling, 1998).
A região do infravermelho está compreendida entre os comprimentos de onda de 0,78 e 100 µm e é dividido em três regiões: o infravermelho próximo (near-infrared) de 0,78 a 2,5 µm, o infravermelho médio (mid-infrared) de 2,5 a 50 µm e o infravermelho distante (far-infrared) de 50 a 100 µm (Skoog et al., 2007). Tal como acontece em outros tipos de absorção, as moléculas são excitadas para um estado de energia mais elevado ao absorverem radiação na região do infravermelho em um processo quantizado, absorvendo apenas frequências específicas de radiação, correspondente a alterações de energia da ordem de 8 a 40 kJ/mol. Neste processo, a radiação é absorvida se a frequência da radiação incidente tem a mesma frequência das vibrações das moléculas. Entretanto, nem todas as ligações de uma molécula são capazes de absorver essa radiação, visto que somente algumas ligações possuem um momento dipolo que varia com o tempo. Desse modo, para absorver a radiação, a ligação deve ter um momento elétrico que varia na mesma frequência da radiação incidente (Pavia et al., 2009).Quase todos os compostos que possuem ligações covalentes (orgânicos ou inorgânicos) absorvem várias frequências da radiação na região do infravermelho (Skoog et al., 2007).
As medidas de espectroscopia no infravermelho de uma amostra podem ser realizadas em função da transmitância, transmitância difusa, reflectância difusa, transflectância e interactância(Manley et al., 2008). As medidas de transmitância são as mais simples e as primeiras a serem utilizadas em coletas de espectro no infravermelho. Transmitância se baseia na medida da intensidade da radiação na faixa do infravermelho que passa através de uma amostra. Análises de reflectância podem ser divididas em dois tipos: medida de reflectância interna, que pode ser feita usando uma célula de reflectância total atenuada em contato com a amostra; e a medida de reflectância externa que envolve a medida da radiação refletida pela superfície da amostra de duas formas: difusa e especular(Stuart, 2005b). As medidas de reflectância se tornaram uma das ferramentas mais importantes em determinação quantitativa de rotina de constituintes alimentares(Skoog et al., 2007). As medidas em reflectância difusa são realizadas geralmente em análises de sólidos ou amostras granulares. As medidas de reflectância e a transmitância podem ser combinadas para formar um modo de transflectância, onde a radiação incidente é transmitida através da amostra e reflete a partir da placa refletora sendo, em seguida, transmitida novamente em sentido contrário a através da amostra. Transmitância e reflectância, também podem ser combinadas
para formar um modo interactância, onde a radiação incidente é detectada em pontos distintos da superfície de uma amostra(Manley et al., 2008).
Os avanços mais significativos na espectroscopia no infravermelho surgiram com a introdução de espectrômetros com transformada de Fourier (FT). Este tipo de instrumento emprega um interferômetro e explora o processo matemático da FT, o que melhora a qualidade dos espectros de infravermelho e minimiza o tempo necessário para obtenção dos dados(Stuart, 2005a). Quando a FT é aplicada na soma dos interferogramas acumulados (dados de intensidade versus tempo), pode ser obtido um espectro com uma melhor relação sinal/ruído, ou seja, maior sensibilidade do que um instrumento convencional de dispersão(Pavia et al., 2009). A espectroscopia no infravermelho distante requer o uso de fontes e materiais óticos específicos(Rouessac & Rouessac, 2007). A região do infravermelho distante é mais limitada que a região no infravermelho médio por conter menos informações acerca da estrutura das moléculas. Entretanto, pode fornecer informações de moléculas que contém átomos pesados, moléculas que apresentam vibrações moleculares de cadeia, torsões moleculares e vibrações de cristais em modo de rede (Lattice)(Stuart, 2005b).
A espectroscopia no infravermelho médio baseia-se na absorção de radiação na região de 4000 a 400 cm-1 do espectro eletromagnético (Fagan & O'Donnell, 2010).A espectroscopia no infravermelho médio (MIR) pode fornecer mais informações acerca da estrutura dos compostos e, por isso, tem sido bastante utilizada na identificação de compostos orgânicos (Stuart, 2005b).Existem no mercado vários analisadores automáticos de leite por infravermelho médio, que tem a capacidade de analisar centenas de amostras por hora. Nestes equipamentos, podem ser determinados simultaneamente os teores de gorduras, proteínas, lactose, baseando-se nos comprimentos de onda de absorção dos principais grupos funcionais de cada um desses compostos(Wehling, 1998). Devido ao sucesso da análise de leite por FTIR, esta tecnologia tem sido comercializada em produtos como o MilkoScan™ FT120 (Foss, Hillerød, Dinamarca) que emprega este princípio em conformidade com os padrões estabelecidos pelo International Dairy Federation (IDF) e Association of Official Analytical Chemists (AOAC)(Fagan & O'Donnell, 2010).
A espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) é considerada uma técnica importante em análises quantitativas de controle de qualidade, embora seja caracterizada como pobre em termos de absorções específicas por conter bandas largas e de baixa intensidade geradas a partir de combinações(Stuart, 2005b). A sobreposição de várias bandas individuais de absorção da radiação eletromagnética resulta em bandas de absorção largas, que são características dos espectros de NIR. Estes espectros contém uma quantidade enorme
de informações sobre propriedades químicas e físicas das amostras analisadas. Entretanto, a interpretação de um espectro de NIR não é uma tarefa simples. Para facilitar a interpretação das informações fornecidas por um espectro de NIR, podem ser utilizadas ferramentas de quimiometria para desenvolvimento de modelos de calibração multivariados e predizer propriedades relevantes de amostras desconhecidas. As técnicas de quimiometria de quadrados mínimos parciais (PLS) e regressão de componentes principais (PCR) têm sido utilizadas na construção de modelos de calibração. Com estes métodos, o número de variáveis é reduzido e as novas variáveis obtidas podem ser utilizadas na construção de curva de calibração que será usada para prever o teor em novas amostras. Os modelos são produzidos a partir das informações obtidas de cada comprimento de onda medido no espectro de NIR de amostras analisadas pelos métodos de referência(Wehling, 1998).
Vários fatores relacionados a NIR favorecem a aplicação em alimentos, tais como a sensibilidade para as absorções das ligações C-H, N-H e O-H dos componentes dos alimentos, a rapidez na obtenção dos dados de resposta, a simplicidade no preparo das amostras, o fato de que a medição não é destrutiva e o baixo custo de instrumentação (McClure, 2007).No início, as pesquisas utilizando a espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) eram limitadas à análises quantitativas de grãos, mas atualmente a técnica de NIR é aplicada na análise de café, ração animal, doces, cosméticos, produtos lácteos, óleos essenciais, frutas, etc, para determinação da composição centesimal, quantificação de compostos específicos (compostos bioativos, por exemplo) e também em pesquisas de determinação de autenticidade de alimentos(Manley et al., 2008). A primeira aplicação de NIR na indústria de laticínios foi na análise de leite em pó e, em seguida, análises de queijo e mais tarde de leite líquido para determinação do teor de proteínas, lipídios, lactose, no diagnóstico de mastite utilizando ferramentas de quimiometria (Giangiacomo & Cattaneo, 2007).O espectro de infravermelho próximo de amostras alimentícias apresenta bandas de absorção largas e pouco definidas formadas a partir de sobretons e das combinações de vibrações fundamentais que ocorrem no infravermelho médio, sendo em torno de 1 a 3 ordens de magnitude mais fracas que as absorções fundamentais.Para facilitar a interpretação das informações fornecidas por um espectro na região do infravermelho médio (MIR) ou Próximo (NIR), podem ser utilizadas ferramentas de quimiometria para desenvolvimento de modelos e predizer o teor de proteínas de amostras desconhecidas (Manley et al., 2008).