UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia de Alimentos
KLEIDSON BRITO DE SOUSA LOBATO
INFRARED SPECTROSCOPY IN UHT MILK AND FREEZE-DRIED AÇAÍ PULP: QUALITY PARAMETERS, DETECTION AND IDENTIFICATION OF
ADULTERANTS
ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO EM LEITE UHT E POLPA DE AÇAÍ LIOFILIZADA: PARÂMETROS DE QUALIDADE, DETECÇÃO E
IDENTIFICAÇÃO DE ADULTERANTES
CAMPINAS 2018
KLEIDSON BRITO DE SOUSA LOBATO
INFRARED SPECTROSCOPY IN UHT MILK AND FREEZE-DRIED AÇAÍ PULP: QUALITY PARAMETERS, DETECTION AND IDENTIFICATION OF
ADULTERANTS
ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO EM LEITE UHT E POLPA DE AÇAÍ LIOFILIZADA: PARÂMETROS DE QUALIDADE, DETECÇÃO E
IDENTIFICAÇÃO DE ADULTERANTES
Thesis presented to the Faculty of the Food Engineering of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Ph.D. grade, in the area of Food Science.
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas para a obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos
Orientadora: Profa. Dra. Juliana Azevedo Lima Pallone
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO KLEIDSON BRITO DE SOUSA LOBATO E ORIENTADA PELA PROF(A). DR(A). JULIANA AZEVEDO LIMA PALLONE
CAMPINAS 2018
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Márcia Regina Garbelini Sevillano - CRB 8/3647
Lobato, Kleidson Brito de Sousa,
L781e LobEspectroscopia no infravermelho em leite UHT e polpa de açaí liofilizada : parâmetros de qualidade, detecção e identificação de adulterantes / Kleidson Brito de Sousa Lobato. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
LobOrientador: Juliana Azevedo Lima Pallone.
LobTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Lob1. Leite Composição. 2. Quimiometria. 3. Leite UHT. 4. Açaí. 5. Leite -Adulteração. I. Pallone, Juliana Azevedo Lima. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Infrared spectroscopy in UHT milk and freeze-dried açai pulp : quality parameters, detection and identification of adulterants
Palavras-chave em inglês: Milk - Composition Chemometrics UHT milk Açai Milk - Adulteration
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Doutor em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Juliana Azevedo Lima Pallone [Orientador] Ádria de Sousa Bentes
Daniela Souza Ferreira Douglas Fernandes Barbin Jesuí Vergílio Visentainer Data de defesa: 28-02-2018
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa Dra Juliana Azevedo Lima Pallone (Orientadora) Faculdade de Engenharia de Alimentos- UNICAMP
Profa Dra Ádria de Sousa Bentes (Membro Titular)
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de São Paulo- IFSP
Profa Dra Daniela Souza Ferreira (Membro Titular) Faculdade de Engenharia de Alimentos- UNICAMP
Prof. Dr. Douglas Fernandes Barbin (Membro Titular) Faculdade de Engenharia de Alimentos- UNICAMP
Prof. Dr. Jesuí Vergílio Visentainer (Membro Titular) Departamento de Química- UEM
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico aos Meus Pais, Antonio Messias Brito Lobato e Marlene Farias de Souza Lobato.
AGRADECIMENTOS
À Deus por tudo.
À Daniela Andrade Neves que me acompanhou e foi fundamental para a realização e conclusão deste trabalho.
Aos meus pais Antonio Messias Brito Lobato, Marlene Farias de Souza Lobato, meus irmãos Kleiton Brito de Souza Lobato e Karla Priscila de Souza Lobato e sogros Roberto de Freitas Neves e Elisa Cristina Andrade Neves por todo o carinho e suporte.
À Prof. Dra. Juliana Azevedo Lima Pallone pela excelente orientação no doutorado.
Ao Lucas de Oliveira Montesino e ao Rafael Leonardo Zamproni pela amizade e ajuda durante as análises Físico-Químicas realizadas no LANAGRO-Campinas.
À prof. Dra. Márcia Miguel Castro Ferreira por toda a ajuda e ensinamento em Quimiometria. Aos colegas do Laboratório Análise de Alimentos II pela parceria durante o período do doutorado.
Aos amigos da Célula Mansões Santo Antônio e aos líderes do Ministério Nova Vida da Igreja Bola de Neve Campinas.
Ao Eduardo Adilson Orlando, técnico do Laboratório de Análise de Alimentos II, pelos seus serviços prestados com muita responsabilidade, agilidade e sabedoria.
À Maria de Fátima Martins Pinhel e Lívia Cavaletti Corrêa da Silva por terem acreditado na proposta do trabalho e por todo o suporte na realização das análises Físico-Químicas e utilização do espectrômetro no Infravermelho Próximo no LANAGRO-Campinas.
À todos os técnicos e funcionários da Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas pelos seus serviços prestados.
Ao Prof. Dr. Ronei de Jesus Poppi por permitir a utilização dos Espectrômetros no Infravermelho Próximo e Médio.
RESUMO
O leite UHT tem propriedades diferentes em relação ao leite cru e é amplamente consumido no Brasil. Vários adulterantes já foram encontrados no leite, sendo a adição de água considerada como a forma de adulteração mais frequente, que tem por objetivo principal aumentar o volume do produto final e consequentemente os lucros. Açai é o fruto da palmeira Euterpe oleracea Martius, conhecida como a mais produtiva do estuário da Amazônia. A polpa de açaí é comumente adulterada com materiais de menor valor para também aumentar os lucros. Este é o primeiro trabalho que investigou o uso de espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) na determinação de componentes, detecção e identificação de adulterantes em leite UHT integral, e o uso de NIR na detecção e identificação de adulterantes em polpa açaí liofilizada. Amostras de leite UHT integral foram analisadas pelos métodos de referência para a quantificação dos principais componentes do leite e para a detecção de adulterantes. As amostras de leite UHT isentas de adulterantes foram adulteradas (água, água + uréia, água + amido, água + sacarose, água + uréia + amido, água + uréia + sacarose e água + uréia + amido + sacarose) em diferentes níveis (1- 20 %). Os espectros de transflectância na região do NIR e os espectros de transmissão na região do MIR de todas as amostras de leite UHT foram utilizados no desenvolvimento de modelos de regressão (PLS) e classificação (PLS-DA). As amostras de polpa de açaí foram adulteradas com amido de milho, polpa de beterraba, suco de uva, amido de mandioca e maltodextrina em diferentes níveis (1- 50%), e liofilizadas. Os espectros de reflectância na região do NIR das amostras de polpa de açaí liofilizada (incluindo as amostras adulteradas) foram utilizados no desenvolvimento de modelos de classificação (k-NN, SIMCA e PLS-DA). Os modelos PLSdesenvolvidos com dados no NIR para determinação dos componentes do leite UHT foram desenvolvidos usando 2-9 variáveis latentes, sendo obtidos baixos valores de RMSEC (0,0065- 0,1550%), RMSEP (0,0110- 0,1049%), sensibilidade (0,0099- 2,0651%), limite de detecção (0,01- 0,57%), limite de quantificação (0,03- 1,74%) e bias (4,76x10-3- 3,64x10-2). Os modelos MIR foram desenvolvidos com 6-8 variáveis latentes e também apresentaram baixos valores de RMSEC (0,0061- 0,0969%), RMSEP (0,0099- 0,0836%), sensibilidade (0,0004- 0,0522%), limite de detecção (0,06- 0,90%), limite de quantificação (0,17- 2,72%) e bias (-2,89x10-4- 2,51x10-2). Ao considerar as figuras de mérito (R2cal, R2pred, sensibilidade, seletividade, limites de detecção e quantificação), observou-se que os melhores resultados para a quantificação de sólidos totais, lactose, gorduras, proteínas e cinzas em leite integral UHT foram desenvolvidos utilizando os dados no NIR. De modo geral, a análise de componentes principais mostrou boa distinção entre as amostras de leite UHT integral autênticas e adulteradas. Este estudo mostrou que tanto o NIR como o MIR tem potencial para detectar amostras de leite integral UHT adulteradas. Por outro lado, apenas a espectroscopia na região do NIR permitiu a identificação do tipo de adulterantes nas amostras de leite integral UHT. Dentre os modelos de classificação testados para detecção e identificação dos adulterantes em polpa de açaí liofilizada, os modelos dek-NN mostraram que é possível detectar as amostrasadulteradas e identificar o tipo de adulterante em cada. Este estudo mostrou que a espectroscopia no infravermelho tem potencial para a quantificação dos componentes de leite integral UHT e para a detecção de amostras adulteradas. Aespectroscopia no infravermelho próximo pode ser aplicada na quantificação dos componentes de leite UHT integral, na detecção e identificação de adulterantes em leite integral UHT integral e polpa açai liofilizada.
ABSTRACT
The UHT milk has different properties compared to raw milk and is largely consumed in Brazil. Several adulterants have been found in milk, being the addition of water considered as the most frequent, which is characterized by a fraud with the main purpose to increase the volume of the final product and consequently the profits. Açai is the fruit of the palm tree Euterpe oleracea Martius, known as the most productive of the Amazon estuary. Açai pulp is commonly adulterated with less expensive materials to increase the profit margins. This is the first work that investigated the use of near-(NIR) and mid-infrared (MIR) spectroscopy in the determination of UHT whole milk components and the detection and identification of adulterants, and the use of NIR in the detection and identification of adulterants in freeze-dried açaí pulp. UHT whole milk samples were analyzed by reference methods for quantification of the main components and for the detection of adulterants. The UHT whole milk samples free of adulterants were adulterated (water, water + urea, water + starch, water + sucrose, water + urea + starch, water + urea + sucrose and water + urea + starch + sucrose) in different levels (1- 20%). The NIR transflectance spectra and the MIR transmittance spectra of all UHT milk samples were used in the development of regression (PLS) and classification (PLS-DA) models.The açaí pulp samples were adulterated with cornstarch, beet pulp, grape juice, cassava starch, maltodextrin in different levels (1- 50%), and freeze-dried. The NIR reflectance spectra of the freeze-dried açai pulp samples (including the adulterated ones) were used in the development of classification models (k-NN, SIMCA and PLS-DA). The PLS models were developed using 2- 9 latent variables, obtaining low values of RMSEC, RMSEP, Limits of detection and quantification. The PLS models developed with NIR data had 2-9 latent variables and presented low values of RMSEC (0.0065- 0.1550%), RMSEP (0.0110- 0.1049%), sensitivity (0.0099- 2.0651%), limit of detections (0.01- 0.57%), limit of quantification (0.03- 1.74%) and bias (4.76x10-3- 3.64x10-2). The PLS models developed with MIR data had 6-8 latent variables and also presented low values of RMSEC (0.0061- 0.0969%), RMSEP (0.0099- 0.0836%), sensitivity (0.0004- 0.0522%), limit of detection (0.06- 0.90%), limit of quantification (0.17- 2.72%) and bias (-2.89x10-4- 2.51x10-2). Considering the figures of merit (R2cal, R2pred, sensitivity, selectivity, limits of detection and
quantification) it was observed that the best results for the quantification of total solids, lactose, fats, proteins, and ash in UHT whole milk were developed using the NIR data. In General, the PCA has shown good distinction between the authentic and adulterated UHT whole milk samples. This study showed that both NIR and MIR feature potential to detect adulterated UHT whole milk samples. On the other hand, only the NIR spectroscopy has enabled the correct identification of adulterants in UHT whole milk samples. Among the classification models developed for the detection and identification of adulterants in freeze-dried açai pulp, the k-NNmodels showed that it is possible to detect adulterated samples and to identify the type of adulterant in each one. This study showed that spectroscopy has great potential for the quantification of the UHT whole milk components and for detection of adulterated samples. Near-infrared spectroscopy can be applied for the quantification of UHT whole milk components and for the detection, and identification of adulterants in UHT whole milk and in freeze-dried açai pulp.
SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL ... 12 REFERÊNCIAS ... 15 OBJETIVOS ... 17 CAPÍTULO I ... 18 Revisão Bibliográfica ... 18 1. LEITE ... 19 1.1 Leite UHT ... 20 1.2 Adulteração de Leite ... 20
1.3 Métodos oficiais de análise de leite UHT ... 23
1.3.1 Sólidos Totais ... 24
1.3.2 Carboidratos ... 24
1.3.3 Lipídios ... 26
1.3.4 Proteínas ... 27
1.3.5 Cinzas ... 28
1.4 Métodos de Detecção/Quantificação de Adulterantes em Leite ... 28
2. AÇAÍ ... 30
2.1 Adulteração de açaí ... 32
3. ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO E MÉDIO ... 32
4. QUIMIOMETRIA ... 37
REFERÊNCIAS ... 44
CAPÍTULO II ... 53
Near- and mid-infrared spectroscopy performances in the evaluation of UHT whole milk quality parameters... 53
ABSTRACT ... 54
1. Introduction ... 54
2. Materials and Methods ... 56
2.1 Samples ... 56
2.2 Quality parameters of UHT whole milk samples ... 56
2.3 Near-infrared and mid-infrared spectroscopy... 57
2.4 Multivariate calibration models ... 57
3. Results and discussion ... 58
3.1 Quality parameters of UHT whole milk samples ... 58
3.2 NIR and MIR spectra ... 60
3.3.1 Total solids ... 62 3.3.2 Lactose ... 64 3.3.3 Fats ... 67 3.3.4 Proteins ... 70 3.3.5 Ash ... 72 4. Conclusion ... 73 Acknowledgements ... 74 References ... 74 SUPPLEMENTARY MATERIAL ... 78 CAPÍTULO III ... 86
Detection of adulterants in UHT whole milk: comparison of near- and mid-infrared spectroscopy ... 86
ABSTRACT ... 87
1. Introduction ... 87
2. Materials and Methods ... 89
2.1 Materials ... 89 2.2 Samples ... 89 2.3 Investigation of adulterants ... 90 2.4 Samples adulteration ... 90 2.5 Spectra collection ... 91 2.6 Multivariate analyses ... 93 2.6.1 Exploratory analysis ... 93 2.6.2 Detection of adulteration ... 93 2.6.3 Identification of adulterants ... 94
3. Results and Discussion ... 94
3.1 Near- and mid-infrared spectra ... 94
3.2 Exploratory analysis ... 96 3.2.1 Near-Infrared ... 96 3.2.2 Mid-Infrared ... 97 3.3 Detection of adulteration ... 99 3.3.1 Near-Infrared ... 99 3.3.2 Mid-Infrared ... 101 3.4 Identification of adulterants ... 102 3.4.1 Near-Infrared ... 102 3.4.2 Mid-Infrared ... 106
3.4.3 Comparison of Techniques ... 107
3.4.4 Comparison with the reference methods ... 108
4. Conclusion ... 110
Acknowledgements ... 110
References ... 111
SUPPLEMENTARY MATERIAL ... 114
CAPÍTULO IV ... 120
Authenticity of freeze-dried açai pulp by near-infrared spectroscopy ... 120
DISCUSSÃO GERAL ... 134
CONCLUSÕES GERAIS ... 143
REFERÊNCIAS GERAIS ... 147
INTRODUÇÃO GERAL
O leite é um dos alimentos mais produzidos no mundo, sendo observado um aumento na sua produção mundial desde o ano de 2005, que passou de 600 milhões de toneladas para 800 milhões de toneladas no ano de 2014. De tudo o que é produzido, em torno de 80% é proveniente de leite bovino, seguido de leite bubalino e de outras espécies. As regiões que mais produzem leite são a Ásia (28%), União Européia (24%), América central e do Norte (18%), América do Sul (11%), outros países europeus (9%), África (5%) e Oceania (5%)(IDF, 2015). No Brasil, com uma produção de 32,3 milhões de toneladas/ano, o leite é o 4° alimento mais produzido. Com essa produção, o Brasil está em 4° lugar no ranking da produção mundial de leite, sendo que os Estados Unidos lideram, com 90,9, seguido da Índia com 54,0 e a China com 37,4 Milhões de toneladas/ ano(Faostat, 2016).O leite bovino é composto de 87,1 % de água, 4,6% de carboidratos (lactose e glicose), 4% de lipídeos (mono, di e triglicerídeos, fosfolipídeos, cerebrosídeos, etc), 3,25% de proteínas (caseínas, β-lactoglobulina, α-lactoalbumina, soro-albumina, etc), 0,7% de minerais (cálcio, magnésio, potássio, sódio, etc), 0,19% de ácidos orgânicos (cítrico, fórmico, acético, lático, etc). O leite também apresenta teores menores de vitaminas do complexo B, ácido ascórbico, aminoácidos, uréia, amônia, etc(Walstra et al., 1999). O leite tem grande importância na alimentação humana, pois contribui com boa parte das necessidades energéticas e uma das principais fontes de proteínas em populações da Ásia, África, Europa e Oceania (Fao, 2014). No Brasil, o consumo per capta anual é de 169 kg de leite e estima-se que até 2022 o consumo seja o dobro (Ibge, 2014). Em torno de 19% de todo leite produzido no Brasil destina-se à produção de leite UHT e dentro do segmento de leite fluido, esse é o produto mais consumido (>80%). Isto se deve às necessidades do consumidor, visto que o leite UHT está presente em 88% dos lares brasileiros e seu consumo tem aumentado desde 2011(Nogueira, 2014).
O Açaí (Euterpeoleracea Martius) é o fruto mais produtivo do estuário amazônico (Menezes et al., 2008)etem grande importância na dieta das populações dessa região (Schauss, 2009). O principal produto obtido dos frutos de açaí é o suco. Primeiro, o fruto é amolecido em água morna, e então ele é mecanicamente despolpado enquanto adiciona-se água. Após a obtenção da polpa, vários subprodutos podem ser obtidos, tais como sorvetes, bebidas fermentadas, doces, geleias e, mais recentemente, extratos e açaí clarificado.A polpa de açaí se tornou bastante conhecida devido aos efeitos benéficos à saúde (associação à redução de doenças cardiovasculares), resultante, sobretudo,da ação dos flavonóides cianidina-3-glicosídeo e cianidina-3-rutinosídeo(Bichara & Rogez, 2011).A frutificação do açaizeiro
ocorre durante todo o ano, com um período de maior produção entre Julho e dezembro (Rogez, 2000). Consequentemente, a comercialização é diretamente afetada pela safra, que implica em escassez de produto e aumento dos preços na entressafra. De modo a garantir o fornecimento durante o ano inteiro, a polpa de açaí pode ser congelada, desidratada por secagem ou liofilizada (Schauss, 2009).
A fraude em alimentos se caracteriza por qualquer substituição, adição, adulteração ou falsificação de alimentos, ingredientes alimentares ou embalagens. Essa prática visa principalmente ocultar ou mascarar a má qualidade dos produtos, de modo a atribuir-lhes qualidades ou requisitos que não possuem para o ganho econômico(Moore et al., 2012). Isto ocorre, principalmente, em alimentos ou ingredientes alimentícios largamente consumidos ou de grande valor agregado (Manley et al., 2008). Portanto, não é surpreendente as tentativas de alguns fornecedores de maximizar os lucros através das práticas de falsificação e adulteração, que são consideradas fenômenos recorrentes no comércio de alimentos(Schieber, 2008).
Por ser um alimento bastante comercializado, o leite é um dos alimentos mais fraudados e o 2° alimento com maior número de resultados de busca sobre adulteração (143 resultados) em bases de dados de pesquisa (Web of Science, Pubmed e Google Scholar)(Moore et al., 2012). Podem ser citados dois motivos principais explicam o grane número de casos de adulteração do leite. O primeiro está relacionado ao aumento dos lucros através do aumento do volume de produção pela adição de água. O segundo está relacionado à adição de adulterantes para evitar perdas por deterioração causada pela ação de microrganismos (Faostat, 2016; Smit, 2003). A polpa de açaí liofilizada é um produto de alto valor agregado, que pode ser adulterada através da adição de materiais espessantes, como farinha de trigo, amido de milho e maltodextrina; e corantes artificiais ou derivados de outras frutas e vegetais (uva e beterraba)(Binois, 2012; Soares, 2014).
Devido à complexidade das matrizes alimentares, os métodos analíticos utilizados na determinação de adulterantes e da composição centesimal são considerados trabalhosos, demorados, são destrutivos, utilizam grande quantidade de solvente e geram um grande volume de resíduos (Frankhuizen, 2008; Moore et al., 2012). Visando a obtenção de resultados mais rápidos com a geração de menos solvente, as técnicas de espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) vêm sendo cada vez mais exploradas para a realização de controle de qualidade e monitoramento de processos na área de alimentos(Siesler, 2008). Isso se deve ao fato de que praticamente qualquer amostra pode ser analisada(líquidos, soluções, pastas, pós, filmes, fibras, gases e superfícies), as amostras
requerem pouco ou nenhum preparo, após o desenvolvimento dos modelos os resultados são rapidamente obtidos sem a destruição das amostras (McClure, 2007; Stuart, 2005a).
O espectro no infravermelho está compreendido entre os comprimentos de onda de 0,78 e 100 µm, sendo dividido em três regiões: o infravermelho próximo (near-infrared) de 0,78 a 2,5 µm, o infravermelho médio (mid-infrared) de 2,5 a 50 µm e o infravermelho distante (far-infrared) de 50 a 100 µm (Skoog et al., 2007). A espectroscopia no infravermelho consiste na capacidade das moléculas de absorverem apenas frequências (energias) de radiação infravermelha selecionada, o que provoca sua excitação e a vibração dos seus átomos (Pavia et al., 2009; Stuart, 2005b). Os espectros obtidos nas faixas do infravermelho próximo e médio apresentam uma grande quantidade de informações. Entretanto, a interpretação desses espectros é realizada através da utilização de ferramentas de quimiometria que permitem o desenvolvimento de modelos matemáticos capazes de predizer propriedades relevantes de amostras desconhecidas (Manley et al., 2008).
REFERÊNCIAS
Bichara, C.M.G., Rogez, H., (2011). Açai (Euterpe oleracea Martius), In: Yahia, E.M. (Ed.), Postharvest biology and technology of tropical and subtropical fruits. . Woodhead Publishing Ltd, Cambridge, pp. 1-23.
Binois, D., (2012). The obstacles to açaí exportation in Brazil, Gestão Internacional. Fundação Getúlio Vargas, São Paulo, p. 91.
Fao. (2014). Dairy production and products: Milk and Milk Products. Food and Agriculture Organization of the United Nations.
http://www.fao.org/agriculture/dairy-gateway/milk-and-milk-products/en/#.U77MJvldWSp. Access: 2014.
Faostat. (2016). Brazilian production of Milk, whole fresh cow in 2006 and 2016. Food and Agricultural commodities production. The Statistics Division of the FAO- Food and Agriculture Organization of the United Nations.
http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx. Access: 2018.
Frankhuizen, R., (2008). NIR Analysis of Dairy Products, In: Burns, D.A., Ciurczak, E.W. (Eds.), Handbook of Near-Infrared Analysis, 3 ed. CRC Press, Boca Raton, EUA, pp. 415- 436.
Ibge, (2014). Indicadores IBGE: Estatistica da Produção Pecuária. Setembro de 2014. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, pp. 5- 44.
IDF. (2015). The World Dairy Situation. Summit Daily. Vol. 2 (21), pp. 3.
Manley, M., Downey, G., Baeten, V., (2008). Spectroscopic Technique: Near-Infrared (NIR) Spectroscopy, In: Sun, D.-W. (Ed.), Modern Techniques for Food Authentication. Academic Press, London, pp. 65- 99.
McClure, W.F., (2007). Introduction, In: Ozaki, Y., McClure, W.F., Christy, A.A. (Eds.), Near-Infrared Spectroscopy in Food Science Technology. Wiley John Wiley & Sons, Hoboken, EUA, pp. 1- 10.
Menezes, E.M.S., Torres, A.T., Sabaa Srur, A.U. (2008). Valor nutricional da polpa de açaí (Euterpe oleracea Mart) liofilizada. Acta Amazonica. Vol. 38, pp. 311-316.
Moore, J.C., Spink, J., Lipp, M. (2012). Development and Application of a Database of Food Ingredient Fraud and Economically Motivated Adulteration from 1980 to 2010. Journal of Food Science. Vol. 77 (4), pp. R118-R126.
Nogueira, M. (2014). Depois de 2012 difícil, indústria de Leite Longa Vida prevê crescimento de cerca de 4% em 2013 ABLV. Assosiação Brasileira da Indústria de Leite Longa Vida. http://www.ablv.org.br/implistcontentint.aspx?id=792&area=imp-not. Access:
2014.
Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S., (2009). Infrared, In: Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S. (Eds.), Introduction to Spectroscopy, 4 ed. Brooks/ Cole, USA, pp. 15- 104. Rogez, H., (2000). Açaí: preparo, composição e melhoramento da conservação. EDUFPA. Schauss, A.G., (2009). Açaí: An Extraordinary Antioxidant-Rich Palm Fruit. Biosocial
Publications.
Schieber, A., (2008). Introduction to Food Authentication, In: Sun, D.-W. (Ed.), Modern Techniques for Food Authentication. Academic Press, London, pp. 1-17.
Siesler, H.W., (2008). Basic Principles of Near-Infrared Spectroscopy, In: Burns, D.A., Ciurczak, E.W. (Eds.), Handbook of Near-Infrared Analysis, 3 ed. CRC Press, Boca Raton, EUA, pp. 7- 20.
Skoog, D.A., Holler, F.J., Crouch, S.R., (2007). An Introduction to Infrared Spectrometry, In: Skoog, D.A., Holler, F.J., Crouch, S.R. (Eds.), Principles of Instrumental Analysis, 6 ed. Thomson Brooks/Cole, Belmont, EUA, pp. 430- 452.
Smit, G., (2003). The major constituents of milk, In: Smit, G. (Ed.), Dairy Processing: Improving Quality. CRC Press LLC, USA, pp. 5- 38.
Soares, K. (2014). Vigilância Sanitária apreende 50 litros de açaí adulterado. ORM News. Portal ORM. Organizações Rômulo Maiorana.
http://www.ormnews.com.br/noticia/vigilancia-sanitaria-apreende-50-litros-de-acai-adulterado. Access: 2017.
Stuart, B., (2005a). Introduction, In: Stuart, B. (Ed.), Infrared Spectroscopy: Fundamentals and Applications. John Wiley & Sons, Hoboken, EUA, pp. 1-14.
Stuart, B., (2005b). Spectral Analysis, In: Stuart, B. (Ed.), Infrared Spectroscopy:
Fundamentals and Applications. John Wiley & Sons, Hoboken, EUA, pp. 45- 70. Walstra, P., Geurts, T.J., Noomen, A., Jellema, A., van Boekel, M.A.J.S., (1999). Milk:
Compostion, Structure, and Properties., In: Walstra, P., Geurts, T.J., Noomen, A., Jellema, A., van Boekel, M.A.J.S. (Eds.), Dairy Technology: Principles of Milk Properties and Processes. Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 3- 26.
OBJETIVOS
OBJETIVOS GERAIS
Este trabalho teve como principal objetivo o desenvolvimento de modelos de calibração e classificação utilizando espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) para determinação de parâmetros de qualidade e adulterantes em leite UHT integral, e desenvolver modelos de classificação utilizando NIR para determinação de adulterantes em polpa de açaí liofilizada.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Coletar periodicamente amostras de leite UHT integral e avaliar os parâmetros de qualidadeutilizando métodos de referência;
Coletar os espectros no NIR e MIR, pré-processar os dados, realizar análise exploratória e construir modelos de calibração para determinação de parâmetros de qualidade em leite UHT integral;
Realizar a pesquisa de adulterantes em amostras de leite UHT integral utilizando métodos de referência;
Simular a adulteração de leite UHT integral com água, uréia, sacarose e amido em diferentes concentrações;
Coletar os espectros no NIR e MIR, pré-processar os dados, realizar análise exploratória e construir modelos de classificação para detecção e identificação de adulterantes em leite UHT integral;
Simular a adulteração de polpa de açaí liofilizada com polpa de beterraba, suco de uva, amido de milho, amido de mandioca e maltodextrina em diferentes concentrações;
Coletar os espectros no NIR, pré-processar os dados, realizar análise exploratória e construir modelos de classificação para detecção e identificação de adulterantes em leite UHT integral;
Comparar a performance dos modelos de classificação na detecção e identificação de adulterantes em polpa de açaí liofilizada, obtidos através de diferentes pré-processamentos.
CAPÍTULO I
1. LEITE
Há milhares de anos o ser humano tem domesticado animais mamíferos com o objetivo de produzir leite. Os primeiros animais domesticados para esse fim foram as ovelhas e as cabras há cerca de 8 a 10 mil anos atrás, seguido pelos bovinos, os quais são considerados como as espécies mais utilizadas na produção de leite(Huppertz & Kelly, 2009). O leite é o líquido secretado pelas fêmeas de animais mamíferos que tem como principal função fornecer todos nutrientes necessários para o desenvolvimento do animal recém-nascido, desempenhando importantes funções por fornecer proteínas e peptídeos, que incluem as imunoglobulinas, enzimas, inibidores de enzimas, proteínas transportadoras, fatores de crescimento e agentes antimicrobianos (Fox & McSweeney, 1998).O leite também fornece ácidos graxos essenciais, vitaminas, sais minerais e outros compostos minoritários, tais como a taurina(O'Mahony & Fox, 2013)
Desde o ano de 2005, a produção mundial de leite tem aumentado, passando de 669 milhões de toneladas em 2006 para 798 milhões de toneladas no ano de 2016 (Faostat, 2016). Cerca de 82.5% do leite produzido é leite bovino, seguido de leite bubalino (13.9%), cabra (1.9%), ovelha (1.3%) e camelo (0.3%). Em ordem decrescente, as regiões que mais produzem leite são a Ásia (39.7%), União Européia (27.7%), Américas (22.7%), África (6.1%) e Oceania (3.7%)(Faostat, 2016).
O leite bovino é definido como o produto oriundo da ordenha completa e ininterrupta, em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas, tendo como características físico-químicas: opacidade, cor branca levemente amarelada, gosto adocicado e levemente salgado e não apresenta odores estranhos. Ao utilizar o termo leite, subentende-se estar relacionando a leite de vaca e leites de outras espécies de animais devem conter o nome da espécie de que proceda(Mapa, 2011).
Em sua composição, o leite bovino apresenta em média, 87,1 % de água, 4,6% de carboidratos (lactose), 4,0% de lipídios (mono, di e triglicerídeos, fosfolipídios, cerebrosídeos, etc.), 3,3% de proteínas (caseínas, β-lactoglobulina, α-lactoalbumina, soro-albumina, etc.), 0,7% de minerais (cálcio, magnésio, potássio, sódio, etc.), 0,19% de ácidos orgânicos (cítrico, fórmico, acético, lático, etc.). O leite também apresenta teores menores de vitaminas do complexo B, ácido ascórbico, aminoácidos, uréia, amônia, etc(Walstra et al., 1999b).
O leite tem grande importância na alimentação humana, pois é consumido por cerca de seis bilhões de pessoas, sendo que na Ásia e na África contribui com 3% das
necessidades energéticas diárias e na Europa e Oceania, contribui com 8 e 9%, respectivamente, além de fornecer 6%, 7% e 19% das necessidades diárias de proteínas em países da Ásia, África e Europa, respectivamente(Fao, 2014).
O consumo per capita mundial é em torno de 110.7 kg de leite/ ano e estima-se um aumento de 13.7% até o ano de 2023(IDF, 2015). O consumo de leite per capita do brasileiro é em torno de 169 kg/ano, o que é considerado alto(Ifcn, 2012)e de acordo com os dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, até o ano de 2022 o consumo per capita de leite será o dobro do atual(Ibge, 2014). O leite é o 4° alimento mais produzido no Brasil com produção média de 33,62 milhões de toneladas/ ano, sendo considerado o 4° maior produtor mundial de leite. Os Estados Unidos lideram com 96.36, seguido da Índia com 77.42 e a China com 37,15 milhões de toneladas/ ano(Faostat, 2016).
1.1 Leite UHT
O leite UHT (Ultra-Alta Temperatura, UAT) ou "longa vida" é definido pela Portaria nº 370 de 04 de Setembro de 1997 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, como o leite homogeneizado que foi submetido, durante 2 a 4 segundos, a uma temperatura entre 130°C e 150°C, mediante um processo térmico de fluxo contínuo, imediatamente resfriado a uma temperatura inferior a 32°C e envasado sob condições assépticas em embalagens estéreis e hermeticamente fechadas (Mapa, 1997).
O leite UHT está presente em 88% dos lares brasileiros e, de acordo com os dados da Associação Brasileira da Indústria de Leite Longa Vida (ABLV), o consumo de leite UHT aumentou no ano de 2011, de 5,818 bilhões de litros para 6,125 bilhões de litros de leite em 2012. Por outro lado, o consumo de leite pasteurizado e de leite informal, que já apresentam consumo em declínio há alguns anos, diminuiu de 1,625 e 1,78 bilhões de litros em 2011 para 1,430 e 1,52 bilhões de litros em 2012, respectivamente. Cerca de 19% de todo leite produzido no Brasil é destinado à produção de leite UHT e dentro do segmento de leite fluido, o leite UHT é o produto mais consumido, pois seu consumo corresponde a 81% deste segmento (Nogueira, 2014).
1.2 Adulteração de Leite
A fraude em alimentos se caracteriza por qualquer substituição, adição, adulteração ou falsificação de alimentos, ingredientes alimentares ou embalagens de alimentos para o ganho econômico(Moore et al., 2012). Um dos maiores casos de adulteração de alimentos que já ocorreu foi relatado em 2007 pelo FDA (Food and Drug Administration) onde foi detectada a presença de melamina (adicionada para aumentar o teor de nitrogênio
total) em rações para animais e fórmulas infantis. Devido o consumo dos alimentos adulterados, cerca de 1000 animais domésticos morreram nos Estados Unidos. Na China, em torno de 294 mil foram afetados, sendo que destes, 50 mil apresentaram problemas renais e 6 morreram (Fda, 2009).
Nos últimos 10 anos, vários casos de adulteração em leite no Brasil têm sido relatados. No ano de 2007, o Ministério Público Federal do Estado de Minas Gerais e a Polícia Federal iniciaram a Operação Ouro Branco com o objetivo de combater crimes cometidos por cooperativas suspeitas de praticarem a adulterações em leite(Mpf, 2007).No ano de 2012, o Ministério Público do Estado do Rio Grande do Sul (MPRS) em parceria com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) iniciaram a operação “Leite Compen$ado” com objetivo deflagrar a adulteração em leite(Mprs, 2013a).
Durante a operação Ouro Branco foram encontradas grandes quantidades de soda cáustica (hidróxido de sódio) e de peróxido de hidrogênio, além das substâncias que, embora permitidas, estavam sendo adicionadas em quantidades acima do limite máximo permitido por lei, tal como o citrato de sódio (Mpf, 2007).Na primeira coleta da operação Leite Compen$adofoi identificada a presença de formol em amostras de leite em um posto de resfriamento e durante o cumprimento de mandados de busca e apreensão, foram recolhidos sacos de uréia, soda cáustica, corantes, coagulantes líquidos e emulsão para obtenção de consistência, entre outros produtos (Mprs, 2013a).Durante as fases da operação Leite Compen$ado no estado do Rio Grande do Sul, foi encontrada uma formulação contendo uréia utilizada para compensar a diluição promovida pela adição de água (Bertão, 2014). Em outra formulação foi relatada a utilização de bicarbonato de sódio e açúcar (Truda & Colossi, 2013). Em outra operação, foi verificado que o leite estava sendo adulterado com uréia contendo formol. O produto adulterado foi largamente comercializado, sendo produzido entre Janeiro e Abril de 2013 em torno de 1.5 milhões de litros (Mprs, 2013b). No mesmo ano, foi verificado que empresas transportadoras de leite eram responsáveis pela adição de uréia contendo formol. A quantidade de uréia adquirida pelos fraudadores alcançou mais de 100 toneladas, sendo movimentado no período de 1 ano em torno de 100 milhões de litros de leite (Mprs, 2017).
Por ser um alimento bastante comercializado, o leite é um dos alimentos mais fraudados e o 2°alimento com maior número de pesquisas envolvendo a investigação de adulterantes (143 resultados) em bases de dados de pesquisa (Web of Science, Pubmed e Google Scholar)(Moore et al., 2012). Assim como em outros tipos de alimentos, normalmente, a adulteração de leite se dá através da adição de produtos de menor valor, tal
como no caso da adição de água, que é considerada o modo mais simples de adulteração de leite e que tem o objetivo de aumentar seu volume(Nascimento et al., 2017). Isto é motivado por um fator econômico, visto que no Brasil, por exemplo, no ano de 2012 a comercialização de leite movimentou em torno de 10 bilhões de dólares (Faostat, 2016).
O conhecimento sobre a adulteração do leite é de longa data e sabe-se que a adulteração pela adição de água não ocorre de forma isolada, conforme mostrado por Mpf (2007), Mprs (2013a), Bertão (2014) e Truda & Colossi (2013), sendo, portanto, utilizados outros produtos de baixo valor comercial e de fácil acesso, tal como no caso da uréia, do amido e da sacarose, que podem ser facilmente encontrados em zonas rurais. A uréia está presente naturalmente no leite (84- 280 mg/ kg de leite), considerada o componente majoritário da fração chamada de Nitrogênio não- Protéico (NPN), representando em torno de 50% (Walstra et al., 1999b), sendo adicionada para aumentar o teor dessa fração, de modo a aumentar a concentração de nitrogênio total (Azad & Ahmed, 2016).O teor de uréia presente naturalmente no leite é dependente do tipo de alimentação dos animais e da época do ano. O teor elevado de uréia no leite contribui para o aumento da estabilidade térmica (O'Mahony & Fox, 2013).
A uréia tem várias aplicações, tais como componente de fertilizantes, ração animal, aditivo alimentício, agente aromatizante, etc (Epa, 2011). Durante a produção da uréia polimérica (forma que promove a liberação controlada de nitrogênio no solo) há a reação com o formaldeído na presença de catalisador, originando um polímero sólido, branco, com teor de nitrogênio em torno de 38% e teor residual de formaldeído(Guertal, 2009). Isto explica os resultados positivos para presença de formaldeído em amostras de leite adulteradas com uréia, que foram coletadas pelo Ministério Público do Estado do Grande do Sul (Mprs, 2013a).
O amido é a reserva predominante de energia de plantas e ocorre na natureza na forma de grânulos formados, em sua grande maioria (depende da matriz) de dois polímeros- amilose, uma molécula essencialmente linear formada de unidades de α-D-glicopiranosil unidas por ligações 1→4 e ligações do tipo 1→6, e amilopectina, uma molécula formada por unidades de α-D-glicopiranosil unidas por ligações do tipo 1→4 com ramificações do tipo 1→6 a cada 20 a 60 resíduos. As principais fontes de amido são: milho, batata, mandioca, trigo, arroz, batatadoce etc (Belitz et al., 2009). O leite bovino contém alguns oligossacarídeos em baixas concentrações (até 150 mg/L) e não contém amido (O'Mahony et al., 2013). Entretanto, assim, como a sacarose, o amido também tem sido adicionado para aumentar a densidade do leite que foi previamente adulterado pela adição de água (Sharma, 2006).
A sacarose é um oligossacarídeo composto por uma unidade de α-D-glucopiranosil e uma unidade de α-D-frutofuranosil, sendo obtida principalmente a partir da cana-de-açúcar e da beterraba (BeMiller & Huber, 2008). A adição de açúcar é uma prática comum de adulteração na indústria de laticínios, que visa aumentar a densidade do leite e, desse modo, mascarar a adição de água(Harding, 1995a). Adições a partir de 0,2% de açúcar ao leite aumenta em 1 unidade a leitura de densidade no lactodensímetro (Singhal et al., 1997).
Outros tipos de adulterantes já foram encontrados no leite.Além do açúcar, o amido, os sais de sulfato, a uréia e sal de cozinha são adicionados para aumentar o teor de sólidos não-gordurosos. O sulfato de amônio é adicionado para corrigir a densidade do leite. Em alguns casos são utilizadas substâncias perigosas à saúde humana, tal como no caso da adição de uréia, formol, detergentes, sulfato de amônio, ácido bórico, soda cáustica, ácido benzóico, ácido salicílico, peróxido de hidrogênio, açúcares e melamina (Azad & Ahmed, 2016). Na literatura, ao considerar o número de publicações no período de 2010 a 2016, verifica-se que a maior parte dos estudos relaciona-se à pesquisa de água adicionada (27.7%), Melamina (22.6%), óleos e gorduras (9.7%), uréia (8.4%), outras fontes de nitrogênio (3.9%), amido (3.9%), ácido salicílico (3.2%), formaldeído (2.6%), outros adulterantes (1.9%), detergentes (1.9%), açúcar (1.3%) (Nascimento et al., 2017).
1.3 Métodos oficiais de análise de leite UHT
A Instrução Normativa nº 68, de 12 de Dezembro de 2006 descreve os Métodos Analíticos Oficiais Físico-Químicos para Controle de Leite e Produtos Lácteos (Mapa, 2006). De acordo com(Mapa, 1997), o leite apresentar aspecto líquido, cor branca, odor e sabor característicos, sem sabores nem odores estranhos deve ter os requisitos mínimos de qualidade em relação aos parâmetros de teor de gorduras, acidez, estabilidade ao etanol (68%) e extrato seco desengordurado (Tabela 1). Além dos parâmetros citados na Tabela 1, outras análises podem ser realizadas no leite UHT, tais como a determinação do teor de sólidos totais, carboidratos, lipídios, proteínas e cinzas, além da investigação da presença de adulterantes. Os ensaios para determinação da umidade em alimentos podem ser consideradoscomo uma das análises mais importantes. A água de um alimento pode estar presente em três formas: livre, adsorvida ou de capilaridade ou quimicamente ligada. A determinação precisa da umidade apresenta inúmeros desafios apesar de muitas vezes empregar procedimentos relativamente simples. Um grande problema é a dificuldade de separar completamente toda a água da amostra de alimentos, resultando em uma subestimação do teor de umidade. No entanto,
condições mais severas para remover toda a umidade de um alimento podem simultaneamente causar a decomposição do produto. Das várias técnicas analíticas para determinar o teor de umidade, a remoção de umidade ou a secagem é frequentemente aplicada e determinada gravimetricamente. A matéria residual obtida após a remoção da umidade de uma amostra é denominada de sólidos totais, um parâmetro de grande importância econômica, visto que a água não tem valor comercial para o produtor (Park & Bell, 2004).
Tabela 1: Parâmetros mínimos de qualidade do leite.Fonte: Mapa (1997).
Requisitos Integral Semi- ou parcialmente desnatado Desnatado
Matéria gorda (%) ≥ 3,0 0,6 a 2.9 ≤ 0,5
Acidez (g ácido lático/ 100mL) 0,14 a 0,18 0,14 a 0,18 0,14 a 0,18
Estabilidade ao etanol Estável Estável Estável
ESD (%) ≥ 8,2 ≥ 8,3 ≥ 8,4
ESD: Extrato seco desengordurado. 1.3.1 Sólidos Totais
No leite, a determinação do teor de sólidos totais é realizada através de secagem de uma alíquota da amostra, a uma temperatura determinada, até massa constante e pesagem. Para isso, a cápsula onde será adicionada a amostras e a sua tampa devem ser aquecidas separadamente em uma estufa a 102 ± 2ºC por 1 hora. Em seguida, a cápsula deve ser fechada com sua tampa e transferida para o dessecador, onde devem ser esfriadas até a temperatura ambiente e pesadas. A amostra é transferida para a cápsula, pesada, juntamente com a tampa e submetida à secagem102 ± 2ºC. Em seguida, deve- se tampar a cápsula, transferirpara dessecador, destampar e esfriar a cápsula contendo a amostra dessecada, mantendo a tampa emposição similar à que manteve na estufa. Transferir a cápsula para a balança, colocar sua tampa e anotar opeso. Esse processo deve ser repetido até o conjunto apresentar peso constante(Mapa, 2006).
1.3.2 Carboidratos
Os carboidratos são um dos mais abundantes grupos de compostos orgânicos presentes na natureza. Estes compostos são divididos basicamente em 3 grupos principais: mono/dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos, além de serem também classificados em simples e complexos. Quimicamente, os carboidratos são constituídos de carbono, hidrogênio e oxigênio na proporção CnH2n:On. Os carboidratos são a principal fonte de
energia na dieta humana, sendo responsáveis por fornecer de 40 a 80% da energia total necessária. Dentre eles, os mais relevantes à nutrição humana são: glicose, sacarose, frutose, lactose, sorbitol, manitol, galacto-oligossacarídeos, fruto-oligossacarídeos e amido(Herrero et
al., 2012). No leite bovino, a lactose (β-D-galactopiranosil-D-glicopiranose) é considerada como o principal carboidrato presente, comumente chamada de açúcar do leite(Holsinger, 1997).
A Lactose é um dissacarídeo composto de D-glicose e D-galactose unidas por uma ligação glicosídica do tipo β-1,4. A síntese de lactose ocorre a partir da glicose no complexo de Golgi localizado nas células mamárias secretoras e contribui com cerca de 50% da pressão osmótica do leite. Durante a lactação, o teor de lactose diminui continuamente e de modo inverso, a contagem de células somáticas aumenta. Isso ocorre devido ao contrafluxo de NaCl do sangue, resultando na diminuição do teor de lactose, um efeito necessário para manter o equilíbrio osmótico(Huppertz & Kelly, 2009). Durante a síntese de lactose, a α-lactoalbumina (proteína expressa somente nas glândulas mamárias) desempenha uma importante função, pois na sua presença, a enzima UDP-galactose-N-acetilglicosamina β-1,4-galactosiltransferase-I (β-1,4-GT-I) se comporta de modo altamente específico para glicose. Desse modo, a α-lactoalbumina tem a habilidade de catalisar e regular a síntese de lactose e, consequentemente, controlar a pressão osmótica(Brew, 2013).
A lactose está presente no leite bovino em uma concentração média de 4,6 g/ 100 g de leite, sendo cerca de 600 vezes maior que a concentração de glicose livre (7 mg/ 100 g de leite), o que representa em torno de 50% dos sólidos totais do leite(Walstra et al., 1999a). A utilização da lactose para produção de energia deve ser precedida pela hidrólise através da atividade da enzima β-galactosidase (Lactase) para liberar glicose e galactose no intestino delgado, visto que somente monossacarídeos são absorvidos. A hidrólise de somente uma parte da quantidade de lactose ingerida caracteriza uma síndrome chamada de intolerância a lactose. A deficiência na produção da enzima pode favorecer o acúmulo de lactose no lúmen do intestino delgado, o que promove a passagem de fluidos para o lúmen por osmose, produzindo distensões abdominais e cólicas. Em seguida, a lactose passa para o intestino grosso, onde é fermentada por bactérias para produzir ácido lático e ácidos graxos de cadeia curta(BeMiller & Huber, 2008).
Além da lactose, outros carboidratos podem ser encontrados em concentrações menores ligados a grupos fosfatos, a lipídios, a proteínas e na forma livre, tais como a galactose e outros oligossacarídeos(Holsinger, 1997). O elevado teor de lactose pode ser encontrado tanto no leite quanto nos derivados lácteos não fermentados, tais como o sorvete, e em menor proporção em produtos fermentados, tais como o iogurte e o queijo devido a ação de bactérias láticas que produzem ácido lático a partir da lactose(BeMiller & Huber, 2008).
Existe na literatura uma enorme quantidade de métodos analíticos destinados a determinação de carboidratosem leite e produtos derivados. Entretanto, o método oficial do Mapa (1997) para determinação de carboidratos em leite fluido consiste na determinação de açúcares redutores em lactose, glicídios não redutores em sacarose. Neste método, os íons cúpricos da solução de Fehling são reduzidos quantitativamente, sobebulição, a óxido cuproso por titulação com solução de açúcar redutor. O ponto final é alcançado quando um pequeno excesso do açúcar redutor descolora o azul de metileno. Neste método são utilizados os seguintes reagentes: acetato de zinco dihidratado (Zn(CH3COO))2 ou sulfato de zinco
heptahidratado (ZnSO4.7H2O), ácido clorídrico (HCl), álcool etílico (C2H5OH), azul de
metileno (C16H18CIN3.3H2O), ferrocianeto de potássio trihidratado (K4 [Fe(CN)6].3H2O),
hidróxido de sódio (NaOH), sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O), sulfato de zinco
heptahidratado (ZnSO4.7H2O), tartarato duplo de potássio e sódio (C4H4KNaO6.4H2O).
1.3.3 Lipídios
Os lipídios são ésteres de ácidos graxos e considerados como um grupo de compostos orgânicos hidrofóbicos solúveis em solventes orgânicos. Essa propriedade é explorada em métodos de análise instrumental em que há a necessidade de separação destes compostos em misturas contendo proteínas e carboidratos(Belitz et al., 2009). Os lipídios são classificados em óleos e gorduras, sendo estas últimas denominadas desse modo por estarem na forma sólida em temperatura ambiente devido à composição em ácidos graxos. As gorduras do leite estão presentes na forma de glóbulos de gordura e são formadas em grande parte de uma mistura de triacilgliceróis (>98%), sendo também encontrados diacilgliceróis (0,3%), monoacilgliceróis (0,03%), ácidos graxos livres (0,1%), fosfolipídios (0,8%), cerebrosídeos (0,1%), gangliosídeos (0,01%), esteróis (0,30%), carotenóides (0,002%)(Walstra et al., 1999a).
A função primária dos lipídios do leite é de fornecer energia ao animal recém-nascido. Do ponto de vista tecnológico, os lipídios presentes no leite têm grande importância em relação às características nutricionais e propriedades sensoriais que conferem aos derivados lácteos. Os lipídios têm sido considerados como os componentes mais valiosos presentes no leite, e como resultado, durante um longo tempo o preço pago aos produtores de leite era baseado no teor de lipídios(Huppertz et al., 2009). A determinação do teor de lipídios em leite e derivados tem importância de caráter regulatório quanto de caráter nutricional(Bintsis et al., 2008). Entre os métodos mais comuns para a análise de gorduras em leites e derivados, os mais comuns são, na maioria, métodos de análise gravimétrica, tais
como: Gerber, Rӧse-Gottlieb, Mojonnier, Babcock, Werner-Schmid, Weibull-Berntrop, desnaturação das proteínas e extração com éter de petróleo, método do detergente e Bligh and Dyer(Bintsis et al., 2008; Bradley Jr, 2000; Ial, 2008; Zamora & Hidalgo, 2004).
De acordo com o Mapa (1997), para determinação do teor de lipídios em leite fluido podem ser utilizados os métodos de Rӧse-Gottlieb e Gerber.O método de Rӧse-Gottlieb se baseia na solubilização das caseínas utilizando hidróxido de amônio, neutralização da acidez, quebra da emulsão gordura-caseína utilizando álcool etílico e extração das gorduras com a mistura éter etílico-éter depetróleo. Após várias extrações, a mistura de solventes é evaporada e as gorduras são determinadas gravimetricamente. O método de Gerber se baseia na digestão da matéria orgânica promovida pelo ácido sulfúrico, que promove a liberação das gorduras. Em seguida, adiciona-se ácool isoamílico e a mistura é agitada vigorosamente, centrifugada e incubada a 65ºC por 10 minutos. Após várias repetições de incubação e centrifugação, é feita a leitura direta da porcentagem de gordura da amostra.
1.3.4 Proteínas
As proteínas são compostos orgânicos de elevada massa molecular, constituídos basicamente de carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio, sendo encontrados em menores proporções o enxofre e o fósforo. As proteínas do leite têm grande importância na nutrição humana e na produção dos derivados lácteos (Harding, 1995b). A maior parte do nitrogênio presente no leite (>95%) é proveniente das proteínas e estas são consideradas as classes de proteínas presentes em alimentos que mais foram estudadas. O primeiro estudo relacionado a proteínas do leite foi publicado no ano de 1814 por J. J. Berzellius, o qual produziu coalhada por precipitação ácida a partir de leite desnatado(O'Mahony & Fox, 2013).
A concentração média de proteínas no leite é de 3,5 a 4,0%. A caseína é considerada como a principal proteína do leite, sendo encontrada na forma de micelas e composta de frações menores de αs1-, βs2-, β- e κ-caseína. Além das caseínas, também podem ser encontradas as proteínas do soro, formadas pela β-lactoglobulina, α-lactalbumina, soroalbumina, proteose-peptona, imunoglobulinas (IgG1, IgG2, IgA e IgM), e também a lactoferrina, transferrina, enzimas e proteínas de membranas(Walstra et al., 1999a). O teor de proteínas totais de leites e produtos lácteos pode ser determinado diretamente ou pela quantificação do nitrogênio orgânico total, seguida da conversão para teor de proteínas utilizando fator de conversão de 6,38. Apesar do grande número de métodos de análises, os métodos espectrofotométricos, Dumas e espectrometria na região do Infravermelho serão
abordados de forma mais detalhada por serem métodos instrumentais(Camp & Dierckx, 2004).
A metodologia oficial do (Mapa, 1997) para determinação do teor de proteínas em leite se baseia no método de Kjeldahl, que consiste na quantificação do nitrogênio total da amostra na forma de sulfato de amônio, obtido através da digestão com ácidosulfúrico e posterior destilação com liberação da amônia, que é fixada em solução ácida e titulada. Neste método são utilizados os seguintes reagentes: Ácido sulfúrico(H2SO4), anti-espumante,
Indicador misto de vermelho de metila (C15H15N3O2) e verde de bromocresol(C21H14Br4O5S),
álcool etílico a 70 %, sulfato de potássio (K2SO4), sulfato de sódio anidro (Na2SO4), sulfato
de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O), ácido bórico (H3BO3), hidróxido de sódio (NaOH)
eZinco metálico granulado. 1.3.5 Cinzas
O termo cinzas refere-se ao resíduo inorgânico remanescente após a ignição ou a oxidação completa da matéria orgânica em um gênero alimentício. O conteúdo de cinzas representa o teor mineral total nos alimentos. Quantificar o conteúdo de cinzas em um alimento pode ser importante por vários motivos, pois está intimamente ligada à parte nutricional do mesmo. A obtenção das cinzas pode representar o primeiro passo na preparação de uma amostra de alimentos para análise elementar específica. Além disso, visto que alguns alimentos apresentam elevado teor de minerais, o conteúdo de cinzas torna-se importante(Harbers, 1998).As cinzas do leite são constituídas principalmente por óxidosde potássio, sódio, cálcio, magnésio, fósforo e por cloretos(Ial, 2008).O método oficial do Mapa (1997) para determinação do teor de cinzas em leite se baseia na eliminação da matéria orgânica a temperatura de 550 ºC por 3 horas ou até se obter cinzas totalmente brancas, que devem ser pesadas em balança analítica diretamente no cadinho, ou seja, determinadas gravimetricamente.
1.4 Métodos de Detecção/Quantificação de Adulterantes em Leite
A Instrução Normativa nº 68, de 12 de Dezembro de 2006 descreve os Métodos Analíticos Oficiais Físico-Químicos para Controle de Leite e Produtos Lácteos (Mapa, 2006). Os métodos analíticos descritos nessa instrução destinados a detectar/quantificar adulterantes em leite estão presentes na Tabela 2. Entretanto, outras análises físico-químicas também são utilizadas para complementar a pesquisa de adulterantes em leite, tais como: densidade, depressão do ponto de congelamento, acidez titulável, extrato seco total e desengordurado, lipídios, resíduo mineral fixo, umidade, etc.
Tabela 2: Métodos qualitativos e quantitativos oficiais para detecção de adulterantes em leite.
Qualitativos Quantitativos
Ácido Bórico e seus sais Ácido Siálico livre
Ácido Sórbico/Sorbato Ácido Sórbico e seus sais
Álcool Etílico Alcalinidade das Cinzas
Amido Cloretos
Cloro Livre e Hipoclorito Densidade
Dicromato de Potássio Depressão do ponto de congelamento
Formaldeído Glicídios Redutores em lactose
Gelatina Glicídios não redutores em sacarose e amido Neutralizantes de Acidez
Peróxido de Hidrogênio Sangue
Fonte: Mapa (2006).
Foi realizada uma pesquisa na base de dados Scopus conforme metodologia de Moore et al. (2012), que citam os principais termos de busca que devem ser utilizados. Na Tabela 3 verificamos os métodos de análise mais utilizados e alguns dos adulterantes mais pesquisados em leite nos últimos 15 anos, sendo notável a utilização de métodos instrumentais de análise. Isto deve ocorrer pelo fato de que a maioria dos métodos clássicos de análise de leite e derivados é considerada ultrapassada frente aos métodos sofisticados de adulteração(Azad & Ahmed, 2016). Além disso, a maioria dos métodos clássicos não permite a distinção entre componentes naturais do leite e componentes adicionados de modo fraudulento, tal como no caso da determinação do teor de proteínas, que se baseia na determinação de nitrogênio total e, por isso, não permite a distinção entre nitrogênio protéico e nitrogênio proveniente de melamina, por exemplo.
Geralmente, os procedimentos oficiais de análise de produtos lácteos para determinação da composição centesimal (quantificação dos teores de umidade, gordura, proteína, lactose) e detecção/quantificação de adulterantes (Tabela 3) são muito demorados e geram muitos resíduos devido ao uso de grande quantidade de reagentes por amostra analisada. Consequentemente, há uma necessidade de instrumentos que podem fornecer resultados rápidos e de baixa geração de resíduos (Frankhuizen, 2008).
Tabela 3: Métodos analíticos para detecção/determinação de adulterantes em leite.
Tipo de leite Metodologia Analito Referência
Cru Espectroscopia no
Infravermelho Médio
Nitrogênio ureico (Oliveira et al., 2012) Espectroscopia no
Infravermelho Médio
Bicarbonato de sódio, citrato de sódio e proteínas
do soro (Cassoli et al., 2011) Bioimpedância Elétrica água e peróxido de hidrogênio (Bertemes-Filho et al., 2011) Escaneamento de imagem
água e hidróxido de sódio (Santos et al., 2012) Espectrofotometria e
CLAE
Ácido siálico (Fukuda et al., 2004) Análise sensorial Proteínas do soro (Aquino et al., 2014) UHT Ultra-som, butirômetro
de Gerber.
água e gordura (Nazário et al., 2009) CLAE Caseinomacropeptídeo (Villanoeva et al., 2014) Kjeldahl e espectrofotometria Melamina, sulfato de amônio e uréia (Finete et al., 2013) Metodologias do MAPA
Amido, cloro, formol, peróxido de hidrogênio e
urina
(Souza et al., 2011)
Pasteurizado e UHT
Língua eletrônica Peróxido de hidrogênio (Paixão & Bertotti, 2009) Pasteurizado Fosfomolibdato e
nitrogênio diferencial.
Fósforo, nitrogênio total, protéico e não-protéico
(Wolfschoon-Pombo & Furtado, 1989)
ND* Eletroquímico Melamina. (Araujo & Paixão, 2014)
Escaneamento de imagem
água, proteínas do soro, peróxido de hidrogênio, urina sintética e leite
sintético
(Santos & Pereira-Filho, 2013)
Espectroscopia no Infravermelho Médio
Proteínas do soro, peróxido de hidrogênio, urina sintética, uréia e leite
sintético.
(Santos et al., 2013b)
Espectroscopia no Infravermelho Médio e
próximo
água, proteínas do soro, peróxido de hidrogênio, urina sintética, uréia e leite
sintético
(Santos et al., 2013a)
nd*: Não definido pelos autores
2. AÇAÍ
Açaí é o fruto da palmeira Euterpe oleracea Martius, conhecida como a mais produtiva do estuário da Amazônia (Menezes et al., 2008). O fruto apresenta-se como uma pequena drupa séssil, arredondada, com diâmetro de 1 a 2 cm e peso médio de 0,8 a 2,3 g. O epicarpo violáceo-purpura, quase preto, é fino, o mesocarpo possui uma espessura de 1 a 2
mm e o endocarpo é duro, revestido por fibras e contem uma única semente. Sendo assim, a proporção de polpa para o fruto é baixa, variando de 5 a 15% (Nascimento, 2008; Rogez, 2000).
Açaí é uma parte importante da dieta na Amazônia, onde geralmente é consumido como uma sopa grossa, no entanto também pode ser utilizado na produção de sorvetes, chocolates, geleias e produtos liofilizados (Schauss, 2009). A cor violeta do açaí é uma consequência da alta concentração de antocianinas glucosídeo e cianidina-3-rutinosídeo, flavonóides que exibem uma ampla gama de benefícios para a saúde como propriedades antioxidante e anti-inflamatória (Bichara & Rogez, 2011; Velioglu et al., 1998; Wycoff et al., 2015). Devido às suas propriedades funcionais, o consumo de polpa de açaí vem aumentando(Yamaguchi et al., 2015). Esta bebida, nos últimos anos, tornou-se conhecida em outras regiões do país, principalmente na região sudeste, e vem tendo grande e crescente aceitação (Suframa, 2003). O açaí também contem compostos fenólicos não flavonoides (protocatecuico, p-hidroxibenzóico, ácido vanílico, siríngico e ferúlico), lipídio saturados e insaturados (ácido oléico, ácido linoleico, ácido linolênico e ácido palmitoléico), carboidratos, cinzas, proteínas, fibras dietéticas, vitaminas (C, tiamina, riboflavina e niacina) e minerais (Na, K, Ca, Mg, Fe e P) (Gordon et al., 2012; Pacheco-Palencia et al., 2009; Rogez, 2000).
O açaizeiro é explorado principalmente na forma de extrativismo, dadas as grandes populações da espécie na floresta, com predominância para os Estados do Amapá e Pará. Devido a sua exploração predatória, que chegou a representar um risco considerável para a espécie até o início da década de 90, foram tomadas providências pelas instituições competentes no sentido de racionalizar a exploração do açaí, tanto através de sistemas de extrativismo manejado e sustentável quanto de seu cultivo (Suframa, 2003).
O açaí apresenta duas safras, a primeira de março a junho e a segunda de agosto a dezembro; e duas entre safras nos períodos de janeiro a fevereiro e de junho a julho. Nos períodos de entressafra o produto é encontrado em menor quantidade e apresenta uma menor qualidade, visto que são encontrados frutos em estágios diferentes de maturação no mesmo cacho. Enquanto que a safra de agosto a dezembro (estação mais seca) é mais expressiva e apresenta uma maior quantidade de frutos, os quais se encontram em estágios de maturação mais homogêneos (Rogez, 2000). Como consequência, o negócio açaí é diretamente afetado pela sazonalidade, o que implica em escassez e escalação de preços nos períodos entre as culturas (Binois, 2012). A polpa de açaí pode ser comercializada fresca, mas para garantir a oferta ao longo do ano, toneladas de polpas são congeladas e liofilizadas (Schauss, 2009).
O açaí é fonte de renda de cerca de 13.000 produtores no Pará, tendo grande importância socioeconômica no estado, que é o maior produtor brasileiro (54% da produção), envolvendo 300 mil pessoas de 54 municípios. O cultivo do açaizeiro no Pará movimenta mais de R$ 3 bilhões por ano (Conab, 2014; Mapa, 2017). A partir de 2000 iniciou-se a exportações de polpa de açaí congelada e liofilizadas para os Estados Unidos, em seguida o produto passou a ser exportado para Austrália, Europa e Japão (Binois, 2012).
2.1 Adulteração de açaí
A fraude é um problema que ocorre com alimentos ou ingredientes alimentares de alto valor, como a polpa de açaí liofilizada (Manley et al., 2008). A adulteração de polpa de açaí (seca por pulverização ou liofilizada) pode ser feita pela adição de materiais espessantes, como farinha de trigo, amido de milho e maltodextrina; e corantes artificiais ou derivados de outras frutas e vegetais (uva e beterraba), que é considerado um prática comum, uma vez que os corantes melhoram a aparência dos alimentos e, portanto, promovem as vendas(Binois, 2012; Soares, 2014). A prática de adulteração é comumente realizada para aumentar os lucros usando adulterantes mais baratos que podem ser facilmente misturados e dificilmente detectados (Moore et al., 2012). A polpa de açaí liofilizada pode ser encontrada no Brasil com um preço médio de US $ 96,01 / kg. Em contraste, maltodextrina, amido de milho, amido de mandioca, suco de uva e beterraba vermelha podem ser encontrados com preços médios de US $ 1,99, US $ 0,64, US $ 1,46, US $ 5,50 e US $ 0,45 / kg, respectivamente. A identificação de produtos alimentares adulterados é desafiadora, uma vez que a complexidade das matrizes de alimentos dificulta a determinação de produtos adulterados(Moore et al., 2012).Em buscas nas bases de dados Scopus e Web of Science, utilizando as palavras chave açai e adulterant, açai e fraud, açai e adulteration, não foram encontrados trabalhos publicados sobre detecção de fraudes em açaí. Desse modo, avaliação de fraudes em polpa de açaí liofilizada será inédita.
3. ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO E MÉDIO
Espectroscopia é definida como o estudo de sistemas físicos através da radiação eletromagnética interagida ou produzida. Espectrometria é a medida da radiação para obter informações dos sistemas e seus componentes. Em algumas técnicas de espectroscopia, a radiação é proveniente de uma fonte externa e modifica-se ao interagir com o sistema e, em outras técnicas, a radiação é originada do sistema(Iupac, 1997). Os espectros obtidos das amostras carregam uma grande quantidade de informações e por isso, as análises de espectroscopia são utilizadas tanto em métodos qualitativos quanto quantitativos. Existem
